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一種制備阿法替尼的中間體及其對映異構(gòu)體的檢測方法與流程

文檔序號:12268187閱讀:341來源:國知局
一種制備阿法替尼的中間體及其對映異構(gòu)體的檢測方法與流程

本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種制備阿法替尼的關(guān)鍵中間體及其對映異構(gòu)體的含量檢測方法。



背景技術(shù):

手性藥物是指由具有藥理活性的手性化合物組成的藥物。由于藥物分子所作用的受體或靶位是由氨基酸、核苷、膜等組成的手性蛋白質(zhì)和核酸大分子等。它們對與其結(jié)合的藥物分子的空間立體構(gòu)型(手性)有一定的要求。因此,手性藥物的兩個(gè)對映體往往在生物體內(nèi)的藥理活性、代謝過程、代謝速率及毒性等存在顯著的差異。以1960年代的一個(gè)著名的事件來說明:外消旋的沙利度胺(thalidomide)曾是有力的鎮(zhèn)靜劑和止吐藥,尤其適合在早期妊娠反應(yīng)中使用。但很快就發(fā)現(xiàn)它是極強(qiáng)的致畸劑。進(jìn)一步研究表明,致畸性由該藥的(S)-異構(gòu)體引起,而(R)-異構(gòu)體被認(rèn)為即使在高劑量時(shí)在動(dòng)物中也不引起畸變。

正是由于手性藥物的不同立體異構(gòu)體在藥效、藥代及毒理等方面都可能存在差異,美國FDA在其關(guān)于開發(fā)立體異構(gòu)體新藥的政策中要求在對手性藥物進(jìn)行藥理毒理研究時(shí),應(yīng)分別獲得該藥物的各立體異構(gòu)體,進(jìn)行必要的比較研究,以確定擬進(jìn)一步開發(fā)的藥物。我國食品藥品監(jiān)督管理局也于2006年12月發(fā)布的《手性藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則》,在其中指出手性藥物研究的基本思路,其中包括“在原料藥制備工藝研究時(shí),應(yīng)根據(jù)手性中心的引入方式,采取有效的過程控制手段,嚴(yán)格控制手性原料與每步反應(yīng)產(chǎn)物的光學(xué)純度;”及“質(zhì)量研究時(shí),應(yīng)結(jié)合工藝與各手性中心的穩(wěn)定性確定需研究控制的立體異構(gòu)體雜質(zhì)”等。

阿法替尼(式1)為手性藥物,是由德國的勃林格殷格翰公司研發(fā)的一種多靶點(diǎn)小分子藥物,其屬于表皮生長因子受體(EGFR)和人表皮受體(HER2)酪氨酸激酶的不可逆抑制劑,也是首個(gè)用于表皮生長因子受體抑制劑治療失敗后的肺癌治療藥物。臨床上可用于晚期非小細(xì)胞肺癌及晚期乳腺癌、腸癌的治療。2013年7月在美國以Gilotrif為商品名獲得批準(zhǔn),

2013年9月在歐盟獲得批準(zhǔn)上市。作為手性藥物,阿法替尼對映異構(gòu)體的含量直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量。目前已有一些專利及文獻(xiàn)提供了阿法替尼對映異構(gòu)體的含量檢測方法,如文獻(xiàn)1(高效液相色譜法測定馬來酸阿法替尼對映異構(gòu)體的含量,馬麗萍等,《中南藥學(xué)》,2016年3月第14卷第3期,303~305頁)及專利CN104391058等。

N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[[(3S)-四氫-3-呋喃基]氧基]-4,6-喹唑啉二胺(式2)是合成阿法替尼的關(guān)鍵中間體,該中間體的結(jié)構(gòu)與阿法替尼成品的結(jié)構(gòu)相似度較大,且引入了手性結(jié)構(gòu),是有可能在產(chǎn)品中引入其手性雜質(zhì)的源頭所在。國家局發(fā)布的《手性藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則》明確規(guī)定了“在原料藥制備工藝研究時(shí),應(yīng)根據(jù)手性中心的引入方式,采取有效的過程控制手段,嚴(yán)格控制手性原料與每步反應(yīng)產(chǎn)物的光學(xué)純度”,因此阿法替尼作為手性藥物,有必要對其關(guān)鍵中間體(式2)的對映異構(gòu)體(式3)的含量進(jìn)行控制,以保證該藥品的質(zhì)量安全、有效、可控。現(xiàn)有技術(shù)僅有對阿法替尼成品的對映異構(gòu)體含量的檢測方法,由于阿法替尼(式1)與(式2)所示的關(guān)鍵中間體取代基差異較大,兩化合物在色譜柱中的吸附及解吸附能力不同,從而造成阿法替尼成品的對映異構(gòu)體的檢測方法不能用來檢測其關(guān)鍵中間體對映異構(gòu)體的含量,因此出于“嚴(yán)格控制手性原料與每步反應(yīng)產(chǎn)物的光學(xué)純度”的需要,需要開發(fā)一種適合檢測阿法替尼關(guān)鍵中間體(式2)的對映異構(gòu)體(式3)含量方法,從而保證阿法替尼成品的光學(xué)純度。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

有鑒于此,本發(fā)明旨在提供一種阿法替尼關(guān)鍵中間體(式2)及其對映異構(gòu)體(式3)含量的檢測方法,從而有效控制手性藥物阿法替尼成品的光學(xué)純度。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:

一種采用雙高效液相色譜、可同時(shí)測定阿法替尼關(guān)鍵中間體及其對映異構(gòu)體含量的方法,采用的色譜條件為:用纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為填充劑,流動(dòng)相是正己烷、異丙醇、乙腈的混合溶液,體積比是700~800:150~250:50,進(jìn)行等度檢測。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案,流動(dòng)相正己烷、異丙醇、乙腈的混合溶液的體積比是750:200:50。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案,本發(fā)明使用紫外檢測器進(jìn)行檢測,紫外檢測波長為255~265nm,優(yōu)選260nm。本發(fā)明提到的檢測波長是根據(jù)方法耐用性實(shí)驗(yàn)確定的,即本方法的檢測波長在5nm范圍內(nèi)調(diào)整,測試結(jié)果基本沒有影響。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案,洗脫流速為0.5~2.0mL/min,優(yōu)選0.9~1.1mL/min,更優(yōu)選0.9mL/min。本發(fā)明洗脫流速設(shè)定為一般技術(shù)人員公知的常識,常見的范圍一般為0.5ml/min至2ml/min。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案,檢測樣品的進(jìn)樣量為1μL~20μL,優(yōu)選10μL。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案,色譜柱柱溫為25℃~35℃,優(yōu)選25℃。本發(fā)明提到的柱溫是根據(jù)方法耐用性實(shí)驗(yàn)確定的,即本方法在柱溫在25~35℃范圍內(nèi)調(diào)整,測試結(jié)果沒有顯著影響。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案,選擇的是型號為Lux Chiral Cellulose-1,規(guī)格250*4.6mm,5μm的色譜柱。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案,本發(fā)明采用纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為填充劑的色譜柱,流動(dòng)相是正己烷、異丙醇、乙腈的混合溶液,體積比是700~800:250~150:50進(jìn)行等度檢測,使用紫外檢測器進(jìn)行檢測,紫外檢測波長為255~265nm,洗脫流速為0.5~2.0mL/min,檢測樣品的進(jìn)樣量為1μL~20μL,柱溫為25℃~35℃。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案,本發(fā)明采用型號為Lux Chiral Cellulose-1,規(guī)格為250*4.6mm,5μm的色譜柱,流動(dòng)相是正己烷、異丙醇、乙腈的混合溶液,其體積比是750:200:50,進(jìn)行等度檢測,使用紫外檢測器進(jìn)行檢測,紫外檢測波長為260nm,洗脫流速為0.9mL/min,檢測樣品的進(jìn)樣量為10μL,柱溫為25℃。

在本發(fā)明中所述的“阿法替尼關(guān)鍵中間體”是化學(xué)名稱為“N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[[(3S)-四氫-3-呋喃基]氧基]-4,6-喹唑啉二胺”的化合物(式2),其對映異構(gòu)體是化學(xué)名稱為“N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[[(3R)-四氫-3-呋喃基]氧基]-4,6-喹唑啉二胺”的化合物(式3)。

本發(fā)明的有益效果是提供了阿法替尼關(guān)鍵中間體(式2)及其對映異構(gòu)體(式3)含量檢測方法,填補(bǔ)了該藥在制備過程中質(zhì)量控制的技術(shù)空白。使用本發(fā)明方法,阿法替尼關(guān)鍵中間體(式2)及其對映異構(gòu)體(式3)的分離度可達(dá)2.0以上,保證了中間體及其異構(gòu)體雜質(zhì)含量檢測的精確度及準(zhǔn)確度,進(jìn)而控制了阿法替尼手性雜質(zhì)引入的源頭,保證了阿法替尼成品的光學(xué)純度。

附圖說明

圖1:實(shí)施例1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖;

圖2:實(shí)施例2系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖;

圖3:實(shí)施例3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖;

注:譜圖中峰1為式3化合物,峰2為式2化合物。

具體實(shí)施方案

下述是結(jié)合具體實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例限于說明本發(fā)明而不是用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

色譜條件:用纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為填充劑(參考色譜柱:Lux ChiralCellulose-1(250*4.6mm,5μm)),柱溫為25℃,以正己烷-異丙醇-乙腈(750:200:50)為流動(dòng)相,流速為每分鐘0.9ml,檢測波長為260nm,分析時(shí)間為30分鐘。

檢測方法:取N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[[(3S)-四氫-3-呋喃基]氧基]-4,6-喹唑啉二胺化合物(式2)10mg,精密稱定,置20ml量瓶中,加異丙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。取N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[[(3R)-四氫-3-呋喃基]氧基]-4,6-喹唑啉二胺化合物(式3)適量,加異丙醇溶解并定量稀釋制成每1ml中含2.5μg的溶液,作為對照品溶液。取式2化合物10mg與式3化合物2mg置同一200ml量瓶中,加異丙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取供試品溶液10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

方法驗(yàn)證

A.系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn):

取系統(tǒng)適用性溶液,照上述色譜條件,連續(xù)進(jìn)針5針,系統(tǒng)適用性溶液中式3化合物峰面積的RSD為0.13%,式2化合物峰面積的RSD為0.16%,分離度大于3.27,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)符合要求。具體數(shù)據(jù)見表1,系統(tǒng)適用性色譜圖見附圖1。

表1.系統(tǒng)適用性考察結(jié)果

B.耐用性試驗(yàn)

耐用性研究是通過對色譜條件作較小的改動(dòng),以確定這些改動(dòng)是否會(huì)對圖譜有較大的影響。按照下表進(jìn)行耐用性研究,在所改變的條件下,分別進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察,其中標(biāo)準(zhǔn)條件用的是重復(fù)性試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)果見表2。

表2耐用性研究結(jié)果

C.定量限、檢測限

溶液的配制:取式3化合物約10mg,精密稱定,置100mL量瓶中,配制成每1mL約含式3化合物0.05μg/mL的溶液,進(jìn)樣分析,結(jié)果以信噪比為10:1計(jì),其定量限濃度為0.46μg/mL,取定量限溶液,進(jìn)樣10μL,結(jié)果以信噪比3:1計(jì),式3化合物的檢測限濃度為0.19μg/mL。

D.線性

稱取式3化合物,配制成4.63μg/mL、0.93μg/mL、0.46μg/mL、0.23μg/mL、0.09μg/mL的溶液,進(jìn)行線性實(shí)驗(yàn);該方法的線性回歸方程為y=0.8248x-0.0172;相關(guān)系數(shù)R2=0.9999,結(jié)果表明式3化合物在0.09~5μg/mL的范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

E.回收率

稱取式3化合物對照品配制成濃度為100μg/mL的儲(chǔ)備溶液,量取儲(chǔ)備溶液用異丙醇分別稀釋成2.5μg/mL、1.0μg/mL、0.25μg/mL的異丙醇溶液。取10份式2化合物樣品每份約10mg,精密稱定,其中一份用異丙醇溶解制備成未加標(biāo)的樣品溶液,其余9份分別用3份2.5μg/mL、1.0μg/mL、0.25μg/mL的式3化合物的異丙醇溶液溶解并稀釋至刻度,按照供試品溶液制備方法,進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖。以外標(biāo)法計(jì)算測得量,進(jìn)而計(jì)算回收率。結(jié)果表明,低、中、高水平的回收率RSD值為4.02%,平均回收率為100.52%,表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

實(shí)施例2

色譜條件:用纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為填充劑(參考色譜柱:Lux ChiralCellulose-1(250*4.6mm,5μm)),柱溫為25℃,以正己烷-異丙醇-乙腈(700:250:50)為流動(dòng)相,流速為每分鐘0.9ml,檢測波長為260nm,分析時(shí)間為30分鐘。

檢測方法:取N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[[(3S)-四氫-3-呋喃基]氧基]-4,6-喹唑啉二胺化合物(式2)10mg,精密稱定,置20ml量瓶中,加異丙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。取N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[[(3R)-四氫-3-呋喃基]氧基]-4,6-喹唑啉二胺化合物(式3)適量,加異丙醇溶解并定量稀釋制成每1ml中含2.5μg的溶液,作為對照品溶液。取式2化合物10mg與式3化合物2mg置同一200ml量瓶中,加異丙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取供試品溶液10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

方法驗(yàn)證

A.系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn):

取系統(tǒng)適用性溶液,照上述色譜條件,連續(xù)進(jìn)針5針,系統(tǒng)適用性溶液中式3化合物峰面積的RSD為1.95%,式2化合物峰面積的RSD為1.93%,分離度大于2.50,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)符合要求。具體數(shù)據(jù)見表3,系統(tǒng)適用性1色譜圖見附圖2。

B.定量限、檢測限

溶液的配制:取式3化合物約10mg,精密稱定,置100mL量瓶中,配制成每1mL約含式3化合物0.05μg/mL的溶液,進(jìn)樣分析,結(jié)果以信噪比為10:1計(jì),雜質(zhì)A的定量限為0.46μg/mL,取定量限溶液,進(jìn)樣10μL,結(jié)果以信噪比3:1計(jì),式3化合物的檢測限為0.19μg/mL。

表3.系統(tǒng)適用性考察結(jié)果

C.線性

稱取式3化合物,配制成4.63μg/mL、0.93μg/mL、0.46μg/mL、0.23μg/mL、0.09μg/mL的溶液,進(jìn)行線性實(shí)驗(yàn);該方法的線性回歸方程為y=1.4236x-0.23584;相關(guān)系數(shù)R2=0.9997,結(jié)果表明式3化合物在0.09~5μg/mL的范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

D.回收率

稱取式3化合物對照品配制成濃度為100μg/mL的儲(chǔ)備溶液,量取儲(chǔ)備溶液用異丙醇分別稀釋成2.5μg/mL、1.0μg/mL、0.25μg/mL的異丙醇溶液。取10份式2化合物樣品每份約10mg,精密稱定,其中一份用異丙醇溶解制備成未加標(biāo)的樣品溶液,其余9份分別用3份2.5μg/mL、1.0μg/mL、0.25μg/mL的式3化合物的異丙醇溶液溶解并稀釋至刻度,按照供試品溶液制備方法,進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖。以外標(biāo)法計(jì)算測得量,進(jìn)而計(jì)算回收率。結(jié)果表明,低、中、高水平的回收率RSD值為3.89%,平均回收率為101.42%,表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

實(shí)施例3

色譜條件:用纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為填充劑(參考色譜柱:Lux Chiral Cellulose-1(250*4.6mm,5μm)),柱溫為25℃,以正己烷-異丙醇-乙腈(800:150:50)為流動(dòng)相,流速為每分鐘0.9ml,檢測波長為260nm,分析時(shí)間為30分鐘。

檢測方法:取N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[[(3S)-四氫-3-呋喃基]氧基]-4,6-喹唑啉二胺化合物(式2)10mg,精密稱定,置20ml量瓶中,加異丙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。取N4-(3-氯-4-氟苯基)-7-[[(3R)-四氫-3-呋喃基]氧基]-4,6-喹唑啉二胺化合物(式3)適量,加異丙醇溶解并定量稀釋制成每1ml中含2.5μg的溶液,作為對照品溶液。取式2化合物10mg與式3化合物2mg置同一200ml量瓶中,加異丙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為系統(tǒng)適用性溶液。精密量取供試品溶液10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。

方法驗(yàn)證

A.系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn):

取系統(tǒng)適用性溶液,照上述色譜條件,連續(xù)進(jìn)針5針,系統(tǒng)適用性溶液中式3化合物峰面積的RSD為0.60%,式2化合物峰面積的RSD為0.45%,分離度大于3.60,系統(tǒng)適用性試驗(yàn)符合要求。具體數(shù)據(jù)見表4,系統(tǒng)適用性1色譜圖見附圖3。

表4.系統(tǒng)適用性考察結(jié)果

B.定量限、檢測限

溶液的配制:取式3化合物約10mg,精密稱定,置100mL量瓶中,配制成每1mL約含式3化合物0.05μg/mL的溶液,進(jìn)樣分析,結(jié)果以信噪比為10:1計(jì),雜質(zhì)A的定量限為0.46μg/mL,取定量限溶液,進(jìn)樣10μL,結(jié)果以信噪比3:1計(jì),式3化合物的檢測限為0.19μg/mL。

C.線性

稱取式3化合物,配制成4.63μg/mL、0.93μg/mL、0.46μg/mL、0.23μg/mL、0.09μg/mL的溶液,進(jìn)行線性實(shí)驗(yàn);該方法的線性回歸方程為y=0.6252x-2.9741;相關(guān)系數(shù)R2=0.9998,結(jié)果表明式3化合物在0.09~5μg/mL的范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

D.回收率

稱取式3化合物對照品配制成濃度為100μg/mL的儲(chǔ)備溶液,量取儲(chǔ)備溶液用異丙醇分別稀釋成2.5μg/mL、1.0μg/mL、0.25μg/mL的異丙醇溶液。取10份式2化合物樣品每份約10mg,精密稱定,其中一份用異丙醇溶解制備成未加標(biāo)的樣品溶液,其余9份分別用3份2.5μg/mL、1.0μg/mL、0.25μg/mL的式3化合物的異丙醇溶液溶解并稀釋至刻度,按照供試品溶液制備方法,進(jìn)樣檢測,記錄色譜圖。以外標(biāo)法計(jì)算測得量,進(jìn)而計(jì)算回收率。結(jié)果表明,低、中、高水平的回收率RSD值為4.61%,平均回收率為102.72%,表明本方法的準(zhǔn)確度良好。

應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改,這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

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