本發(fā)明涉及一種分離富集和測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中的抗生素殘留的方法，具體涉及一種溫敏聚合物-鹽雙水相浮選分離與HPLC-MS/MS檢測(cè)聯(lián)用分析農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留的方法，屬于環(huán)境分析的技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來盲目濫用抗生素的現(xiàn)象日益嚴(yán)重，長(zhǎng)期或超標(biāo)、濫用抗生素不但不能達(dá)到預(yù)期治療疾病的目的，而且導(dǎo)致大量耐藥性治病細(xì)菌的出現(xiàn)，造成農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留日益嚴(yán)重。國(guó)家監(jiān)督管理局公布的農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全合格率抽檢結(jié)果讓我們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中的抗生素殘留情況表示嚴(yán)重?fù)?dān)憂。在超市的動(dòng)物內(nèi)臟產(chǎn)品、生乳及養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物尿樣和飼料樣中均檢出氯霉素類、四環(huán)素類、磺胺類、硝基呋喃類代謝產(chǎn)物的報(bào)道, 各種抗生素的檢出率在3%-50%不等?？股仡愃幬锏牟缓侠硎褂蒙踔翞E用造成了農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境中抗生素的殘留嚴(yán)重，給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來了嚴(yán)重威脅?？股貧埩魡栴}已經(jīng)引起社會(huì)的高度重視，人們對(duì)“綠色”生態(tài)農(nóng)產(chǎn)品的需求也愈發(fā)強(qiáng)烈。因此，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留的檢測(cè)分析成為關(guān)注的熱點(diǎn)。由于農(nóng)產(chǎn)品的基質(zhì)成分復(fù)雜，干擾多，且抗生素通常為痕量或超痕量存在，必須建立行之有效的方法對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中的抗生素殘留進(jìn)行分離/富集，從而達(dá)到分離干擾物質(zhì)，降低檢出限和提高測(cè)定準(zhǔn)確度的目的。

目前農(nóng)產(chǎn)品中抗生素的傳統(tǒng)前處理方法主要有：液-液萃取 (LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPEM)、超聲波萃取技術(shù)(UAE)和加壓溶劑萃取(PLE)等。然而這些方法存在著耗時(shí)、耗溶劑、重復(fù)性低等缺點(diǎn)，特別是前處理中使用的有機(jī)溶劑具有揮發(fā)性、可燃性和毒性等特點(diǎn)，以及隨著國(guó)際社會(huì)對(duì)環(huán)境問題的日趨重視，有機(jī)溶劑的使用受到了不同程度的限制。與傳統(tǒng)的前處理方法相比，溫敏聚合物雙水相浮選技術(shù)將雙水相體系與氣浮溶劑浮選技術(shù)相耦合，集二者的優(yōu)勢(shì)于一體，既有效提高了溫敏聚合物雙水相體系的富集倍數(shù)，又避免傳統(tǒng)氣浮溶劑浮選使用苯、二甲苯等有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境造成二次污染。

在抗生素殘留的分析檢測(cè)方面，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) (HPLC-MS) 兼具HPLC的強(qiáng)分離能力和MS的高靈敏度和極強(qiáng)的定性鑒定能力，是目前檢測(cè)復(fù)雜基體組織中痕量抗生素發(fā)展最迅速的分析手段之一?；诖?，將溫敏聚合物雙水相浮選前處理技術(shù)與HPLC-MS/MS聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留的超痕量檢測(cè)與識(shí)別，具有重要的應(yīng)用價(jià)值?；诖?，本發(fā)明擬構(gòu)建溫敏聚合物循環(huán)雙水相浮選分離/富集抗生素的新體系，并將該技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用，檢測(cè)農(nóng)產(chǎn)品中的抗生素殘留。為農(nóng)產(chǎn)品中抗生素的殘留檢測(cè)提供一種準(zhǔn)確，高效，綠色，前景廣闊的新型分析測(cè)試技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服目前抗生素分析前處理方法存在著耗時(shí)、耗溶劑、重復(fù)性低等缺點(diǎn)，特別是前處理中使用的有機(jī)溶劑具有揮發(fā)性、可燃性和毒性等特點(diǎn)，以及隨著國(guó)際社會(huì)對(duì)環(huán)境問題的日趨重視，有機(jī)溶劑的使用受到了不同程度的限制，提供一種基于溫敏聚合物雙水相浮選分離富集農(nóng)產(chǎn)品中的抗生素殘留的方法，并將其與HPLC-MS/MS聯(lián)用，降低抗生素檢測(cè)的檢出限以及提高測(cè)定準(zhǔn)確度。為我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品中抗生素的殘留檢測(cè)提供一種準(zhǔn)確，高效，綠色的新型分析檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案概述如下：

一種分離富集和測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中抗生素的方法，該方法包括以下步驟：

（1）樣品預(yù)處理：

①豬肉樣品：取代表性豬肉樣品（應(yīng)盡量避免取脂肪部分），用組織切碎機(jī)攪碎，均質(zhì)處理。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)良好的樣品2 g（精確到0.01 g）于15 mL具塞離心管中，加入抗生素內(nèi)標(biāo)50 μg/kg，再加入2 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和8 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。上層清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的50 mL具塞離心管中。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。

②牛乳試樣：準(zhǔn)確取5 mL牛乳樣品于50 mL具塞離心管中，稱量和記錄其質(zhì)量。加入內(nèi)標(biāo)抗生素4 μg/kg，再加入5 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和30 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2500×g離心10 min。取20 mL上清液到另一個(gè)干凈的50 mL具塞離心管中，注意不要混入析出的乳脂肪。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。

（2）溫敏聚合物雙水相浮選抗生素：在50mL的浮選池中加入47.0 mL已知濃度的含有抗生素標(biāo)準(zhǔn)液的鹽溶液，調(diào)節(jié)體系pH；然后從浮選池頂部慢慢再加3.0 mL 一定濃度的（w/w）L31定容至刻度。打開氮?dú)怃撈?，調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉?，充分浮選后，關(guān)閉氮?dú)?，將浮選池靜置至兩相明顯分離，記錄上、下相的體積，上相主要包含L31和抗生素，把上相全部取出用于二次溫度分離。將浮選后的上相取出加入一支新的10 mL離心管，加入一定體積的蒸餾水，在室溫下勻速的輕搖混合物5 min，使其混合均勻，然后將離心管置于恒溫為40℃水浴鍋中(溫度誤差為±0.05 K)，靜置12h使其達(dá)到新的兩相平衡，記錄上下相的體積。下相為L(zhǎng)31相，上相主要包含水和抗生素，取適量上相溶液進(jìn)入HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。

其中所述雙水相浮選體系中的鹽為K₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、K₂CO₃、NaH₂PO₄、KCl和Na₂SO₄，其中所用鹽最終為K₂HPO₄，其濃度范圍為20～60%，優(yōu)選為55%；所述溫敏聚合物為L(zhǎng)31，聚合物溶液中聚合物濃度為40%，60%和80%，優(yōu)選為80%；所述pH范圍為8.0～11.0，優(yōu)選為11.0；所述浮選時(shí)間為10～60 min，優(yōu)選為50 min；所述浮選流速為10～50 mL?min^-1，優(yōu)選流速為30 mL?min^-1。

所述浮選效果Y計(jì)算如下：

式中V_t, V_b分別代表最后溫度分離后的上下相體積，C_t, C_b分別代表最后溫度分離后抗生素在上、下相的濃度。

（3）在優(yōu)化浮選體系中，將分離得到的上相溶液直接進(jìn)入HPLC-MS/MS儀器進(jìn)行分析測(cè)試，得到實(shí)驗(yàn)最終數(shù)據(jù)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

（1）本發(fā)明首次構(gòu)建溫敏聚合物-鹽雙水相浮選體系分離富集農(nóng)產(chǎn)品中的抗生素殘留；首次將三嵌段聚合物L(fēng)31-鹽體系用于雙水相分離富集農(nóng)產(chǎn)品中的抗生素。與農(nóng)產(chǎn)品中抗生素的傳統(tǒng)前處理方法相比，溫敏聚合物雙水相浮選技術(shù)將雙水相體系與氣浮溶劑浮選技術(shù)相耦合，集二者的優(yōu)勢(shì)于一體，既有效提高了溫敏聚合物雙水相體系的富集倍數(shù)，又避免傳統(tǒng)氣浮溶劑浮選使用苯、二甲苯等有機(jī)溶劑對(duì)環(huán)境造成二次污染。實(shí)現(xiàn)了農(nóng)產(chǎn)品中抗生素污染物的高效與綠色分離富集。

（2）首次將溫敏聚合物雙水相浮選技術(shù)與HPLC-MS/MS相耦合，用于測(cè)定農(nóng)產(chǎn)品中的抗生素殘留，該技術(shù)達(dá)到降低檢出限和提高測(cè)定準(zhǔn)確度的目標(biāo)，為農(nóng)產(chǎn)品中抗生素的殘留檢測(cè)提供一種準(zhǔn)確，高效，綠色，前景廣闊的新型分析測(cè)試技術(shù)。實(shí)現(xiàn)了抗生素殘留檢測(cè)的檢出限低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

（3）利用三嵌段聚合物L(fēng)31的溫敏特性，可加熱高于其濁點(diǎn)時(shí)會(huì)與目標(biāo)物分離，因此可以進(jìn)入下一次的兩相分離，將抗生素轉(zhuǎn)移進(jìn)入水相，利用HPLC-MS/MS的分析測(cè)定。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施實(shí)例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解本發(fā)明，但不以任何方式限定本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠做出的任何顯而易見的改進(jìn)替換或變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1：

（1）樣品預(yù)處理：

①豬肉樣品：取代表性豬肉樣品（應(yīng)盡量避免取脂肪部分），用組織切碎機(jī)攪碎，均質(zhì)處理。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)良好的樣品2 g（精確到0.01 g）于15 mL具塞離心管中，加入抗生素內(nèi)標(biāo)50 μg/kg，再加入2 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和8 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。上層清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的50 mL具塞離心管中。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。②牛乳試樣：準(zhǔn)確取5 mL牛乳樣品于50 mL具塞離心管中，稱量和記錄其質(zhì)量。加入內(nèi)標(biāo)抗生素4 μg/kg，再加入5 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和30 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2500×g離心10 min。取20 mL上清液到另一個(gè)干凈的50 mL具塞離心管中，注意不要混入析出的乳脂肪。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。

（2）溫敏聚合物雙水相浮選抗生素：在50mL的浮選池中加入47.0 mL已知濃度的含有OTC、TC、SM2、CIP和COM的標(biāo)準(zhǔn)K₂HPO₄溶液（濃度為20%），體系的pH值調(diào)節(jié)為8.0。然后從浮選池頂部慢慢再加3.0 mL 40%的（w/w）L31定容至刻度。打開氮?dú)怃撈浚{(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，浮選10 min后，關(guān)閉氮?dú)猓瑢⒏∵x池靜置至兩相明顯分離，記錄上、下相的體積，上相主要包含L31和抗生素，把上相全部取出用于二次溫度分離。將浮選后的上相取出加入一支新的10 mL離心管，加入一定體積的蒸餾水，在室溫下勻速的輕搖混合物5 min，使其混合均勻，然后將離心管置于恒溫為40℃水浴鍋中(溫度誤差為±0.05 K)，靜置12h使其達(dá)到新的兩相平衡，記錄上下相的體積。下相為L(zhǎng)31相，上相主要包含水和抗生素，取適量上相溶液進(jìn)入HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。從而得到五種抗生素（OTC、TC、SM2、CIP和LOM）的分離浮選回收率為：21.56%、25.34%、27.11%、28.69%和23.78%。

實(shí)施例2：

（1）樣品預(yù)處理：

①豬肉樣品：取代表性豬肉樣品（應(yīng)盡量避免取脂肪部分），用組織切碎機(jī)攪碎，均質(zhì)處理。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)良好的樣品2 g（精確到0.01 g）于15 mL具塞離心管中，加入抗生素內(nèi)標(biāo)50 μg/kg，再加入2 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和8 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。上層清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的50 mL具塞離心管中。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。②牛乳試樣：準(zhǔn)確取5 mL牛乳樣品于50 mL具塞離心管中，稱量和記錄其質(zhì)量。加入內(nèi)標(biāo)抗生素4 μg/kg，再加入5 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和30 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2500×g離心10 min。取20 mL上清液到另一個(gè)干凈的50 mL具塞離心管中，注意不要混入析出的乳脂肪。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。

（2）溫敏聚合物雙水相浮選抗生素：在50mL的浮選池中加入47.0 mL已知濃度的含有OTC、TC、SM2、CIP和COM的標(biāo)準(zhǔn)K₂HPO₄溶液（濃度為30%），體系的pH值調(diào)節(jié)為9.0。然后從浮選池頂部慢慢再加3.0 mL 60%的（w/w）L31定容至刻度。打開氮?dú)怃撈?，調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，浮選20 min后，關(guān)閉氮?dú)猓瑢⒏∵x池靜置至兩相明顯分離，記錄上、下相的體積，上相主要包含L31和抗生素，把上相全部取出用于二次溫度分離。將浮選后的上相取出加入一支新的10 mL離心管，加入一定體積的蒸餾水，在室溫下勻速的輕搖混合物5 min，使其混合均勻，然后將離心管置于恒溫為40℃水浴鍋中(溫度誤差為±0.05 K)，靜置12h使其達(dá)到新的兩相平衡，記錄上下相的體積。下相為L(zhǎng)31相，上相主要包含水和抗生素，取適量上相溶液進(jìn)入HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。從而得到五種抗生素（OTC、TC、SM2、CIP和LOM）的分離浮選回收率為：38.12%、39.55%、42.68%、39.11%和36.25%。

實(shí)施例3：

（1）樣品預(yù)處理：

①豬肉樣品：取代表性豬肉樣品（應(yīng)盡量避免取脂肪部分），用組織切碎機(jī)攪碎，均質(zhì)處理。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)良好的樣品2 g（精確到0.01 g）于15 mL具塞離心管中，加入抗生素內(nèi)標(biāo)50 μg/kg，再加入2 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和8 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。上層清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的50 mL具塞離心管中。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。②牛乳試樣：準(zhǔn)確取5 mL牛乳樣品于50 mL具塞離心管中，稱量和記錄其質(zhì)量。加入內(nèi)標(biāo)抗生素4 μg/kg，再加入5 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和30 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2500×g離心10 min。取20 mL上清液到另一個(gè)干凈的50 mL具塞離心管中，注意不要混入析出的乳脂肪。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。

（2）溫敏聚合物雙水相浮選抗生素：在50mL的浮選池中加入47.0 mL已知濃度的含有OTC、TC、SM2、CIP和COM的標(biāo)準(zhǔn)K₂HPO₄溶液（濃度為40%），體系的pH值調(diào)節(jié)為10.0。然后從浮選池頂部慢慢再加3.0 mL 80%的（w/w）L31定容至刻度。打開氮?dú)怃撈?，調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，浮選30 min后，關(guān)閉氮?dú)?，將浮選池靜置至兩相明顯分離，記錄上、下相的體積，上相主要包含L31和抗生素，把上相全部取出用于二次溫度分離。將浮選后的上相取出加入一支新的10 mL離心管，加入一定體積的蒸餾水，在室溫下勻速的輕搖混合物5 min，使其混合均勻，然后將離心管置于恒溫為40℃水浴鍋中(溫度誤差為±0.05 K)，靜置12h使其達(dá)到新的兩相平衡，記錄上下相的體積。下相為L(zhǎng)31相，上相主要包含水和抗生素，取適量上相溶液進(jìn)入HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。從而得到五種抗生素（OTC、TC、SM2、CIP和LOM）的分離浮選回收率為：78.62%、80.13%、81.33%、82.16%和79.80%。

實(shí)施例4：

（1）樣品預(yù)處理：

①豬肉樣品：取代表性豬肉樣品（應(yīng)盡量避免取脂肪部分），用組織切碎機(jī)攪碎，均質(zhì)處理。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)良好的樣品2 g（精確到0.01 g）于15 mL具塞離心管中，加入抗生素內(nèi)標(biāo)50 μg/kg，再加入2 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和8 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。上層清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的50 mL具塞離心管中。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。②牛乳試樣：準(zhǔn)確取5 mL牛乳樣品于50 mL具塞離心管中，稱量和記錄其質(zhì)量。加入內(nèi)標(biāo)抗生素4 μg/kg，再加入5 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和30 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2500×g離心10 min。取20 mL上清液到另一個(gè)干凈的50 mL具塞離心管中，注意不要混入析出的乳脂肪。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。

（2）溫敏聚合物雙水相浮選抗生素：在50mL的浮選池中加入47.0 mL已知濃度的含有OTC、TC、SM2、CIP和COM的標(biāo)準(zhǔn)K₂HPO₄溶液（濃度為55%），體系的pH值調(diào)節(jié)為11.0。然后從浮選池頂部慢慢再加3.0 mL 80%的（w/w）L31定容至刻度。打開氮?dú)怃撈?，調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，浮選30 min后，關(guān)閉氮?dú)?，將浮選池靜置至兩相明顯分離，記錄上、下相的體積，上相主要包含L31和抗生素，把上相全部取出用于二次溫度分離。將浮選后的上相取出加入一支新的10 mL離心管，加入一定體積的蒸餾水，在室溫下勻速的輕搖混合物5 min，使其混合均勻，然后將離心管置于恒溫為40℃水浴鍋中(溫度誤差為±0.05 K)，靜置12h使其達(dá)到新的兩相平衡，記錄上下相的體積。下相為L(zhǎng)31相，上相主要包含水和抗生素，取適量上相溶液進(jìn)入HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。從而得到五種抗生素（OTC、TC、SM2、CIP和LOM）的分離浮選回收率為：92.8%、93.7%、94%、97.5%和95.7%。

實(shí)施例5：

（1）樣品預(yù)處理：

①豬肉樣品：取代表性豬肉樣品（應(yīng)盡量避免取脂肪部分），用組織切碎機(jī)攪碎，均質(zhì)處理。準(zhǔn)確稱取均質(zhì)良好的樣品2 g（精確到0.01 g）于15 mL具塞離心管中，加入抗生素內(nèi)標(biāo)50 μg/kg，再加入2 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和8 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2 500×g離心10 min。上層清液轉(zhuǎn)移到另一干凈的50 mL具塞離心管中。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。②牛乳試樣：準(zhǔn)確取5 mL牛乳樣品于50 mL具塞離心管中，稱量和記錄其質(zhì)量。加入內(nèi)標(biāo)抗生素4 μg/kg，再加入5 mL磷酸緩沖溶液（50 mmol/L）和30 mL乙腈，渦旋2 min，在低于10 ℃條件下2500×g離心10 min。取20 mL上清液到另一個(gè)干凈的50 mL具塞離心管中，注意不要混入析出的乳脂肪。將濾液保存在4℃冰箱內(nèi)備用。

（2）溫敏聚合物雙水相浮選抗生素：在50mL的浮選池中加入47.0 mL已知濃度的含有OTC、TC、SM2、CIP和COM的標(biāo)準(zhǔn)K₂HPO₄溶液（濃度為60%），體系的pH值調(diào)節(jié)為11.0。然后從浮選池頂部慢慢再加3.0 mL 80%的（w/w）L31定容至刻度。打開氮?dú)怃撈?，調(diào)節(jié)氮?dú)饬魉贋?0mL/min，浮選60min后，關(guān)閉氮?dú)猓瑢⒏∵x池靜置至兩相明顯分離，記錄上、下相的體積，上相主要包含L31和抗生素，把上相全部取出用于二次溫度分離。將浮選后的上相取出加入一支新的10 mL離心管，加入一定體積的蒸餾水，在室溫下勻速的輕搖混合物5 min，使其混合均勻，然后將離心管置于恒溫為40℃水浴鍋中(溫度誤差為±0.05 K)，靜置12h使其達(dá)到新的兩相平衡，記錄上下相的體積。下相為L(zhǎng)31相，上相主要包含水和抗生素，取適量上相溶液進(jìn)入HPLC-MS/MS進(jìn)行分析。從而得到五種抗生素（OTC、TC、SM2、CIP和LOM）的分離浮選回收率為：80.33%、81%、80.2%、85.4%和83.2%。