本發(fā)明屬于分析化學(xué)色譜法領(lǐng)域。具體是一種采用色譜法鑒定廣西容縣沙田柚的方法，本方法同時利用氣相色譜和液相色譜法對廣西容縣沙田柚中的化學(xué)組分進(jìn)行定性分析。

背景技術(shù)：

柚子(citrus junos tanaka)，又名文旦，是蕓香科柑橘亞科柚子屬植物，我國是世界上柚類種植面積最大，產(chǎn)量居第2位的生產(chǎn)大國。我國柚類品種資源豐富、品種(品系)繁多，目前主栽品種有沙田柚、琯溪蜜柚、玉環(huán)柚等，占全國柚子栽培面積的80％左右，種植面積均達(dá)0.37萬公頃以上，年產(chǎn)量超過1.2萬噸，主要分布于福建、浙江、臺灣、廣西、廣東等多個省份。容縣沙田柚是我國柚類中獨樹一幟的優(yōu)良品種。果大形美、味甜蜜、耐貯藏，果實為葫蘆形和梨形，是廣西傳統(tǒng)的名、優(yōu)、特產(chǎn)品，也是出口創(chuàng)匯的主要水果品種，素有水果珍品“天然罐頭”之美稱，并于2004年獲得原產(chǎn)地域產(chǎn)品保護(hù)，但是隨著柚子的營養(yǎng)價值和藥用價值日益受到重視，假冒名優(yōu)品種柚子的現(xiàn)象時有發(fā)生，品質(zhì)等級劃分和原產(chǎn)地的鑒定技術(shù)就顯得尤為重要。本發(fā)明同時利用氣相色譜和液相色譜技術(shù)手段對廣西容縣沙田柚的化學(xué)組分進(jìn)行定性分析，成功建立沙田柚特異性物質(zhì)色譜指紋圖譜。因此，建立一種簡單、準(zhǔn)確、快速的色譜分析方法，對廣西容縣沙田柚子的原產(chǎn)地溯源和鑒定具有重要的意義。

針對柚子的鑒定技術(shù)，目前，頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,16(6):52)，感官評價和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(現(xiàn)代食品科技,2014,30(10):274)，化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試法(中國民族民間醫(yī)藥，2010，5:35-36)，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(色譜，2007，25(5):770-771)，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(色譜，2016，34(6):558-566)等方法已被用于柚子的定性分析。頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)簡單快速，適合檢測柚子中的揮發(fā)性成分，但不合適柚子中的非揮發(fā)性成分檢測；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)高效準(zhǔn)確，適合柚子用的非揮發(fā)性成分檢測，但不適合揮發(fā)性成分的檢測，在國家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 868-2004)中對沙田柚的檢測鑒定主要采用感官檢驗、理化指標(biāo)檢驗和衛(wèi)生指標(biāo)。目前沒有發(fā)現(xiàn)報道對沙田柚采用氣相色譜或液相色譜法進(jìn)行檢測鑒定。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有鑒定技術(shù)的不足，提供一種采用色譜法鑒定廣西容縣沙田柚的方法，對廣西容縣沙田柚中的化學(xué)組分定性鑒定。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種采用色譜法鑒定廣西容縣沙田柚的方法，首先采用乙腈對沙田柚外表皮、內(nèi)表皮、內(nèi)果皮、果肉及種子等各部位中的有機(jī)物進(jìn)行提取，然后同時采用氣相色譜儀、氫火焰離子檢測器和液相色譜-紫外檢測器進(jìn)行檢測，對廣西容縣沙田柚各部位中有機(jī)物進(jìn)行色譜定性分析，準(zhǔn)確地檢測出廣西容縣沙田柚中的蛇床子素、檸檬烯、α-亞油酸、棕櫚酸、谷甾醇、油酸酰胺和諾卡酮.特異性物質(zhì)，成功建立沙田柚特異性物質(zhì)色譜指紋圖譜。

1.采用氣相色譜儀、氫火焰離子檢測器鑒定廣西容縣沙田柚的方法，具體操作步驟如下：

1)氣相色譜儀的色譜柱初始溫度為室溫，升溫速率10℃/min升至溫度50～280℃，為滿足試樣中所有成分的峰完全分離，結(jié)合各物質(zhì)沸點，確定氣相色譜最優(yōu)分析條件如下：

氣相色譜分析儀分析條件

色譜柱：30m×0.25mm DB-17色譜柱；載氣：N₂；載氣流速：1mL/min；色譜柱溫度：120℃；進(jìn)樣量：1μL；氣化室溫度：260℃；檢測器溫度：280℃；檢測器為FID檢測器；

2)外標(biāo)物溶液的配制：根據(jù)外標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別稱取不同質(zhì)量的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮，分別用乙腈加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成濃度為1000mg/L外標(biāo)物溶液，并配成濃度為100mg/L的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮的混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)溶液。

3)檢測樣品的制備：準(zhǔn)確稱取5g樣品(鮮重)于100mL離心管中，加入25mL乙腈，渦旋2min，超聲30min，4500r/min離心3min，抽取上清液1.5mL，經(jīng)0.22μm微膜過濾，待測樣品的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮。

2.采用液相色譜-紫外檢測器鑒定廣西容縣沙田柚的方法，具體操作步驟如下：

1)液相色譜儀以254nm為紫外吸收波長，梯度洗脫，為滿足試樣中所有成分的峰完全分離，結(jié)合各物質(zhì)極性，確定液相色譜最優(yōu)分析條件如下：

液相色譜分析儀分析條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB C18 250mm×4.6mm×5μm色譜柱；流動相：A為水相，B為乙腈；洗脫流速：1mL/min；色譜柱溫度：30℃；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫程序：水A％:乙腈B％為70:30，洗脫0～15min、水A％:乙腈B％為40:60，洗脫15～20min、水A％:乙腈B％為40:60，洗脫20～40min、水A％:乙腈B％為20:80，洗脫40～45min、水A％:乙腈B％為20:80，洗脫45～65min、水A％:乙腈B％為70:30，洗脫65～70min；檢測器為紫外檢測器；

2)外標(biāo)物溶液的配制：根據(jù)外標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別稱取不同質(zhì)量的檸檬烯、谷甾醇和油酸酰胺，分別用乙腈溶解加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成濃度為1000mg/L外標(biāo)物溶液，并配成濃度為100mg/L的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮的混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)溶液。

3)檢測樣品的制備：準(zhǔn)確稱取5g樣品(鮮重)于100mL離心管中，加入25mL乙腈，渦旋2min，超聲30min，4500r/min離心3min，抽取上清液1.5mL，經(jīng)0.22μm微膜過濾，待測樣品的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮。

本發(fā)明的氣相色譜儀為Agilent7890A氣相色譜儀，色譜柱為分離效能高、分離速度快的石英毛細(xì)柱，運用氫火焰檢測器進(jìn)行檢測，對樣品中的各組分與外標(biāo)物進(jìn)行一一對比，準(zhǔn)確的檢測出廣西容縣沙田柚中的化學(xué)組分。液相色譜儀為Water-e2695高效液相色譜儀，色譜柱為Zorbax Eclipse XDB C18反相柱，運用紫外檢測器，對樣品中的各組分與外標(biāo)物進(jìn)行一一對比，準(zhǔn)確的檢測出廣西容縣沙田柚中的化學(xué)組分。

本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點：

1.改變以往以感官評價的方法判斷柚子產(chǎn)地和品質(zhì)在技術(shù)上科學(xué)性的不足。

2.從色譜技術(shù)測定內(nèi)涵物差異性上對沙田柚的產(chǎn)地、品質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果更客觀，更準(zhǔn)確更科學(xué)。

3.同時采用氣相色譜和液相色譜技術(shù)，既可以檢測出揮發(fā)性物質(zhì)，又可以檢測出極性物質(zhì)，結(jié)果更科學(xué)可靠。

4.在色譜柱不超載的范圍內(nèi)，定性結(jié)果與進(jìn)樣量重復(fù)性無關(guān)。

5.操作簡單，定性準(zhǔn)確，檢測快速，適用于沙田柚及其它柚子中化學(xué)組分的定性分析。

附圖說明

圖1為外標(biāo)物蛇床子素的氣相色譜圖。

圖2為外標(biāo)物諾卡酮的氣相色譜圖。

圖3為外標(biāo)物棕櫚酸的氣相色譜圖。

圖4為外標(biāo)物α-亞油酸的氣相色譜圖。

圖5混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物的氣相色譜圖。

圖6為外標(biāo)物谷甾醇的液相色譜圖。

圖7為外標(biāo)物油酸酰胺的液相色譜圖。

圖8為外標(biāo)物檸檬烯的液相色譜圖。

圖9混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物的液相色譜圖。

圖10為廣西容縣沙田柚外表皮樣品的氣相譜圖。

圖11為廣西容縣沙田柚內(nèi)表皮樣品的氣相譜圖。

圖12為廣西容縣沙田柚內(nèi)果皮樣品的氣相譜圖。

圖13為廣西容縣沙田柚果肉樣品的氣相譜圖。

圖14為廣西容縣沙田柚種子樣品的氣相譜圖。

圖15為廣西容縣沙田柚外表皮樣品的液相色譜圖。

圖16為廣西容縣沙田柚內(nèi)表皮樣品的液相色譜圖。

圖17為廣西容縣沙田柚內(nèi)果皮樣品的液相色譜圖。

圖18為廣西容縣沙田柚果肉樣品的液相色譜圖。

圖19為廣西容縣沙田柚種子樣品的液相色譜圖。

具體實施方式

以下實施例中應(yīng)用的儀器與試劑包括：

儀器與材料：Agilent 7890A氣相色譜儀，帶氫火焰離子檢測器(FID)；DB-17型石英毛細(xì)管色譜柱，30m×0.25mm；載氣為純度大于99.999％的氮氣，燃?xì)鉃榧兌却笥?9.999％的氫氣，助燃?xì)鉃?.5MPa的壓縮空氣；Water-e2695高效液相色譜儀，帶紫外檢測器和色譜工作站；Zorbax Eclipse XDB C18色譜柱，250mm×4.6mm×5μm。

試劑：乙腈(分析純、色譜純)、超純水。

外標(biāo)物：蛇床子素、檸檬烯、α-亞油酸、棕櫚酸、谷甾醇、油酸酰胺和諾卡酮。

樣品：廣西容縣沙田柚采自廣西容縣自良鎮(zhèn)大里村浪頭隊。

實施例1

采用氣相色譜儀、氫火焰離子檢測器鑒定廣西容縣沙田柚的方法，具體操作步驟如下：

1.氣相色譜儀的色譜柱初始溫度為室溫，升溫速率10℃/min升至溫度50～280℃，為滿足試樣中所有成分的峰完全分離，結(jié)合各物質(zhì)沸點，確定氣相色譜最優(yōu)分析條件如下：

氣相色譜分析儀分析條件

色譜柱：30m×0.25mm DB-17色譜柱；載氣：N₂；載氣流速：1mL/min；色譜柱溫度：120℃；進(jìn)樣量：1μL；氣化室溫度：260℃；檢測器溫度：280℃；檢測器為FID檢測器。

2.外標(biāo)物溶液的配制：根據(jù)外標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別稱取不同質(zhì)量的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮，分別用乙腈溶解加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成1000mg/L外標(biāo)物溶液，并配成濃度為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物溶液。經(jīng)氣相色譜檢測，其檢測結(jié)果如附圖1、圖2、圖3、圖4和圖5所示，圖1為蛇床子素氣相譜圖；圖2為諾卡酮氣相色譜圖；圖3為棕櫚酸氣相色譜圖；圖4為α-亞油酸氣相色譜圖；圖5為混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物氣相色譜圖。

3.樣品的制備：準(zhǔn)確稱取5g樣品(鮮重)于100mL離心管中，加入25mL乙腈，渦旋2min，超聲30min，4500r/min離心3min，抽取上清液1.5mL，經(jīng)0.22μm微膜過濾，經(jīng)氣相色譜檢測，其檢測結(jié)果如附圖10、圖11、圖12、圖13和圖14所示，圖10為外表皮樣品氣相色譜圖；圖11為內(nèi)表皮樣品氣相色譜圖；圖12為內(nèi)果皮樣品氣相色譜圖；圖13為果肉樣品氣相色譜圖；圖14為種子樣品氣相色譜圖。

實施例2

采用液相色譜-紫外檢測器鑒定廣西容縣沙田柚的方法，具體操作步驟如下：

1.液相色譜儀以254nm為紫外吸收波長，梯度洗脫，為滿足試樣中所有成分的峰完全分離，結(jié)合各物質(zhì)極性，確定液相色譜最優(yōu)分析條件如下：

液相色譜分析儀分析條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB C18 250mm×4.6mm×5μm色譜柱；流動相：A為水相，B為乙腈；洗脫流速：1mL/min；色譜柱溫度：30℃；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫程序：0～15min，A％(水):B％(乙腈)為70:30，15～20min，A％(水):B％(乙腈)為40:60，20～40min，A％(水):B％(乙腈)為40:60，40～45min，A％(水):B％(乙腈)為20:80，45～65min，A％(水):B％(乙腈)為20:80，65～70min，A％(水):B％(乙腈)為70:30；檢測器為紫外檢測器。

2.外標(biāo)物溶液的配制：根據(jù)外標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別稱取不同質(zhì)量的檸檬烯、谷甾醇和油酸酰胺，分別用乙腈溶解加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成1000mg/L外標(biāo)物溶液，并配成濃度為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)溶液。經(jīng)液相色譜檢測，其檢測結(jié)果如附圖6、圖7、圖8和9圖所示，圖6為谷甾醇液相色譜圖；圖7為油酸酰胺液相色譜圖；圖8為檸檬烯液相色譜圖；圖9為混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物液相色譜圖。

3.樣品的制備：準(zhǔn)確稱取5g樣品(鮮重)于100mL離心管中，加入25mL乙腈，渦旋2min，超聲30min，4500r/min離心3min，抽取上清液1.5mL，經(jīng)0.22μm微膜過濾，經(jīng)液相色譜檢測，其檢測結(jié)果如附圖15、圖16、圖17、圖18和圖19所示，圖15為外表皮樣品液相色譜圖；圖16為內(nèi)表皮樣品液相色譜圖；圖17為內(nèi)果皮樣品液相色譜圖；圖18為果肉樣品液相色譜圖；圖19為種子樣品液相色譜圖。