本發(fā)明屬于分析化學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及與特發(fā)性男性不育相關(guān)的精漿代謝小分子標(biāo)志物及其基于UPLC-Q exactive MS的檢測方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

據(jù)WHO統(tǒng)計,全世界約有15％的育齡夫婦遭受不育的困擾。我國由于人口基數(shù)大，新婚夫婦中不孕不育的患者人數(shù)遠(yuǎn)超過百萬，因男性因素導(dǎo)致的不育高于50％。男性不育中目前仍有約40％～75％找不到原因，稱為特發(fā)性男性不育癥。特發(fā)性男性不育造成了極為嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)。

事實上，特發(fā)性男性不育診斷非常困難。WHO男性不育的標(biāo)準(zhǔn)是夫妻婚后同居1年以上，未采取避孕措施，由于男方原因造成女方不孕者。然而，同居1年的診斷標(biāo)準(zhǔn)，大大耽誤了對男性不育進(jìn)行早期治療和干預(yù)的時間；由于現(xiàn)實原因很多夫妻并不能保證嚴(yán)格的同居1年，使得最后的男性不育判斷變得非常困難；而且為了排除女方原因，女方還需要進(jìn)行詳細(xì)的檢查，帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的精液參數(shù)檢查只關(guān)注精子數(shù)量、運動度、精液量、pH和液化時間等常規(guī)參數(shù)，不能全面地反應(yīng)精液的全部狀況。而且，男性不育經(jīng)常表現(xiàn)為常規(guī)精液參數(shù)無明顯異常，也使得傳統(tǒng)的精液參數(shù)檢查并不能有效診斷男性不育。除此之外因為受到禁欲時間等因素的影響，常規(guī)精液參數(shù)常規(guī)分析結(jié)果還表現(xiàn)為較大的波動性。因而，臨床診斷往往需要參考多次精液常規(guī)分析，給醫(yī)生和患者帶來了負(fù)擔(dān)。因而，臨床上亟需用于特發(fā)性男性不育的新的診斷方法。

代謝組學(xué)(Metabolomics/Metabonomics)是20世紀(jì)90年代末期發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，它是通過考察生物體系在遺傳改變或受刺激或擾動后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。所謂代謝組(Metabolome)是基因組的下游產(chǎn)物也是最終產(chǎn)物，是一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常功能和生長發(fā)育的小分子化合物的集合，主要是相對分子質(zhì)量小于1000的內(nèi)源性小分子，這些內(nèi)源性代謝小分子涉及糖代謝、能量代謝、脂代謝、氨基酸代謝、核酸代謝、輔酶代謝等。

正常狀態(tài)下的生物體是一個完整的系統(tǒng)，生物體液、細(xì)胞和組織中的代謝物處于一個穩(wěn)定的平衡狀態(tài)。機(jī)體由于遺傳或者后天原因發(fā)生了病理變化，這一平衡就被打破，代謝產(chǎn)物和代謝過程也產(chǎn)生了相應(yīng)的變化。通過代謝組學(xué)分析了解代謝小分子在疾病過程中的變化，可以幫助人們尋找有關(guān)的生物標(biāo)志物(biomarker)，可以輔助疾病的診斷，也可以幫助人們通過小分子物質(zhì)本身涉及的代謝通路了解疾病的發(fā)病機(jī)制并為藥物研發(fā)提供特異性的靶標(biāo)。近年來，代謝組學(xué)在人類各類疾病的研究中在疾病的早期診斷中取得了諸多具有重大意義的研究成果，如心血管疾病、糖尿病和癌癥，相關(guān)論文發(fā)表在學(xué)術(shù)期刊《Nature》、《Nature medicine》、《Journal of hepatology》和《Cancer research》上，展現(xiàn)了代謝小分子在人類疾病診斷中巨大的潛力與價值。男性不育的根本原因是精液的問題。精漿作為精液的液體成分可以很好地反映精液的質(zhì)量改變，而且具有無創(chuàng)，容易采集的優(yōu)點。然而，采用代謝組學(xué)分析精漿代謝小分子在特發(fā)性男性不育的診斷監(jiān)測中的應(yīng)用還未得到相應(yīng)的關(guān)注。

目前代謝組學(xué)研究常用技術(shù)包括液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)及核磁共振技術(shù)(NMR)。核磁共振技術(shù)特點是對待測組分無破壞，樣本前處理簡單，但靈敏度較低；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用具有較好的靈敏度和重現(xiàn)性，但一般要采用衍生化方法對樣本進(jìn)行前處理，使得實驗步驟變得復(fù)雜。而LC-MS具有樣本處理簡單，靈敏度高，臨床實用性強(qiáng)的特點。UPLC-Q exactive MS是新一代高分辨質(zhì)譜與超高效液相的組合，具有相比傳統(tǒng)LC-MS更強(qiáng)的靈敏度、特異度和穩(wěn)定性。故而采用UPLC-Q exactive MSS進(jìn)行精漿代謝小分子的代謝組學(xué)分析，若能發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的與特發(fā)性男性不育發(fā)病相關(guān)的特異精漿代謝小分子作為生物標(biāo)志物，并研發(fā)相應(yīng)的代謝小分子標(biāo)志的UPLC-Q exactive MS檢測方法，不僅在該領(lǐng)域處于國際領(lǐng)先地位，還可創(chuàng)造令人矚目的經(jīng)濟(jì)效益，對提高我國男性生殖健康水平也將是一次強(qiáng)有力的推動。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供與特發(fā)性男性不育相關(guān)的精漿代謝小分子標(biāo)志物。

本發(fā)明另一個目的是提供上述精漿代謝小分子標(biāo)志物的檢測方法。

本發(fā)明再有一個目的是提供檢測上述精漿代謝小分子標(biāo)志物的試劑盒。

本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的：

與特發(fā)性男性不育相關(guān)的精漿代謝小分子標(biāo)志物，該標(biāo)志物不精漿代謝小分子乙酰肉堿和/或色氨酸。

所述的精漿代謝小分子標(biāo)志物在制備特發(fā)性男性不育診斷或監(jiān)測試劑盒中的應(yīng)用。

一種診斷或監(jiān)測特發(fā)性男性不育的試劑盒，該試劑盒含有檢測精漿代謝小分子乙酰肉堿和/或色氨酸的試劑。

所述的試劑盒，該試劑盒含有采用UPLC-Q exactive MS方法檢測精漿代謝小分子乙酰肉堿和/或色氨酸的試劑。

所述的試劑盒，該試劑盒含有下列試劑：

乙酰肉堿和/或色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品；

內(nèi)標(biāo)A：肌酐、纈氨酸、煙酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰對氨基酚、馬尿酸中一種或多種物質(zhì)的同位素內(nèi)標(biāo)(氘標(biāo)，水溶液)；

內(nèi)標(biāo)B：十五烷酸的同位素內(nèi)標(biāo)(氘標(biāo)，甲醇溶液)；

內(nèi)標(biāo)C：二十四烷酸的同位素內(nèi)標(biāo)(氘標(biāo)，甲醇溶液)。

進(jìn)一步，該試劑盒還含有：

Hypersil GOLD C18色譜柱；

試劑A：沉淀蛋白用，含100％甲醇；

試劑B：流動相用，含0.1％的甲酸的水；

試劑C：流動相用，含0.1％的甲酸的乙腈；

試劑D：復(fù)溶用，超純水。

一種檢測如前所述的與特發(fā)性男性不育相關(guān)的精漿代謝小分子標(biāo)志物的方法，該方法采用UPLC-Q exactive MS方法，檢測精漿中代謝小分子乙酰肉堿和/或色氨酸的含量。

上述檢測方法中：

一、液相條件：

液相色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱，柱溫為40℃；

流動相A為含0.1％甲酸的水，流動相B為含0.1％甲酸的乙腈，流速為400μL/min；

儀器梯度為：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min 99％到1％B，13.1-17min 1％B；(各梯度中流動相A的量與對應(yīng)的流動相B的量共100％，下同)

進(jìn)樣方式：體積10μl；

二、質(zhì)譜條件

采用加熱電噴霧電離方式(HESI)進(jìn)行分析，正離子模式噴霧電壓：3.5kV；負(fù)離子模式噴霧電壓：2.5kV；兩種模式下毛細(xì)管溫度：250℃，加熱器溫度：425℃，鞘氣氣流：50AU，輔助氣氣流：13AU，反吹氣氣流：0AU；透鏡電壓：60V；采用全掃模式，掃描范圍：70到1050m/z；分辨率：70000。

本發(fā)明詳細(xì)描述如下：

本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的精漿樣本，系統(tǒng)收集完整的人群基礎(chǔ)信息和臨床資料，并采用了基于UPLC-Q exactive MS的代謝組學(xué)方法進(jìn)行分析。

具體來說研究的實驗方法主要包括以下幾個部分：

一、研究對象選擇和分組依據(jù)

第一階段 篩選階段

隨機(jī)納入明確診斷的特發(fā)性男性不育148人和健康對照148人，共296人。

A組：健康對照組(148人)：

1.年齡在19至39歲之間；

2.體質(zhì)指數(shù)在17至31之間；

3.生殖能力健康的男性，而且6-8個月后有了健康的后代；

4.無全身重大疾病。

B組：特發(fā)性男性不育疾病組(148人)：

1.年齡與對照組匹配；

2.體質(zhì)指數(shù)與對照組匹配

3.嘗試懷孕12個月沒有成功，而配偶沒有不孕疾病的男性；。

4.無明確男性不育病因；

5.吸煙飲酒史與對照組匹配；

6.民族與對照組匹配；

7.無全身重大疾病。

第二階段 驗證階段

納入明確診斷的特發(fā)性男性不育15人和健康對照15人，共30人。

A組：健康對照組(15人)：

1.年齡在24到36歲之間；

2.體質(zhì)指數(shù)在19至24之間；

3.生殖能力健康的男性，而且6-8個月后有了健康的后代；

4.無全身重大疾病。

B組：特發(fā)性男性不育疾病組(15人)：

1.年齡與對照組匹配；

2.體質(zhì)指數(shù)與對照組匹配；

3.嘗試懷孕12個月沒有成功，而配偶沒有不孕疾病的男性；

4.無明確男性不育病因；

5.吸煙飲酒史與對照組匹配；

6.民族與對照組匹配；

7.無全身重大疾病。

二、UPLC-Q exactive MS代謝組學(xué)分析和特發(fā)性男性不育診斷用代謝小分子篩選和驗證

1.樣本前處理

1.1.取10μL精漿、加入10μL內(nèi)標(biāo)A，加入10μL內(nèi)標(biāo)B，加入10μL內(nèi)標(biāo)C，加入甲醇(試劑A)40μL，渦旋30s，沉淀蛋白。

1.2.離心機(jī)中4℃16000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL進(jìn)口EP管，并將上清液在室溫條件下于離心濃縮干燥儀中濃縮至干。

1.3.用10μL超純水(試劑D)復(fù)溶，待分析。

2.儀器檢測

2.1.分析儀器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色譜儀；Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀。

2.2.液相條件：

2.2.1.液相色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱(100mm×2.1mm,粒徑1.9μm,Thermo Scientific,Germany)，柱溫為40℃。

2.2.2采用的流動相為(A)含0.1％甲酸的水(試劑B)和(B)含0.1％甲酸的乙腈(試劑C)，流速為400μL/min。

2.2.3儀器梯度為：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min99％到1％B，13.1-17min 1％B。

2.2.4進(jìn)樣方式：體積10μl。

2.3.質(zhì)譜條件

2.3.1加熱電噴霧電離方式(HESI)進(jìn)行分析。

2.3.2采用加熱電噴霧電離方式(HESI)，正離子模式噴霧電壓：3.5kV；負(fù)離子模式噴霧電壓：2.5kV；兩種模式下毛細(xì)管溫度：250℃，加熱器溫度：425℃，鞘氣氣流：50AU，輔助氣氣流：13AU，反吹氣氣流：0AU；透鏡電壓：60V。采用全掃模式，掃描范圍：70到1050m/z；分辨率：70000。

3.物質(zhì)定性

代謝小分子定性采用與標(biāo)準(zhǔn)品乙酰肉堿和色氨酸比對色譜信息(保留時間)和質(zhì)譜信息(精確分子量)，并實時比對樣本中同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品系列的色譜信息以校正保留時間。

4.數(shù)據(jù)分析：

生物標(biāo)志物篩選采用采用多元Logistic回歸確認(rèn)關(guān)鍵代謝物。

5.健康對照組、特發(fā)性男性不育組精漿樣本中代謝小分子的差異和診斷意義。

經(jīng)過校正年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒史的信息，多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)精漿乙酰肉堿和色氨酸的含量增加顯著降低了特發(fā)性男性不育的發(fā)生。采用隨機(jī)人群應(yīng)用上述代謝小分子組合診斷特發(fā)性男性不育，靈敏度為93.33％，特異度為86.67％，ROC曲線下面積為0.9822，具有較高的輔助診斷價值。

三、診斷試劑盒制備方法

根據(jù)上述一系列實驗結(jié)果，本發(fā)明人還制備了一種能診斷或監(jiān)測特發(fā)性男性不育的試劑盒，所述試劑盒含有用于檢測與特發(fā)性男性不育相關(guān)的精漿代謝小分子標(biāo)志物的試劑，包含測定受試者精漿中穩(wěn)定存在且可檢測的乙酰肉堿和色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品以及輔助分析的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品系列。診斷試劑盒還可以包括一套精漿代謝小分子提取及色譜分離用試劑及器材。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明人通過采用UPLC-Q exactive MS比較正常對照和特發(fā)性男性不育精漿中的代謝小分子，發(fā)現(xiàn)了精漿中存在可用于評估是否患有特發(fā)性男性不育，具有診斷價值的精漿代謝小分子標(biāo)志物組合，以及該精漿代謝小分子標(biāo)志物檢測的UPLC-Q exactive MS的應(yīng)用，研制出可便于臨床應(yīng)用的特發(fā)性男性不育診斷、監(jiān)測試劑盒。

本發(fā)明采用精漿代謝小分子作為特發(fā)性男性不育評價的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于：

(1)精漿代謝小分子是一種新型生物標(biāo)志物，其與疾病結(jié)局關(guān)聯(lián)強(qiáng)，不僅穩(wěn)定、微創(chuàng)、易于檢測，且定量精確，將大大提高特發(fā)性男性不育診斷的敏感性和特異性，該類小分子生物標(biāo)志物的成功開發(fā)將為特發(fā)性男性不育的防治開創(chuàng)全新局面，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。

(2)本發(fā)明提供的精漿代謝小分子標(biāo)志物可用作特發(fā)性男性不育的診斷標(biāo)志物，可在早期輔助診斷特發(fā)性男性不育，從而為臨床醫(yī)生進(jìn)一步深入檢查提供依據(jù)，為快速準(zhǔn)確掌握患者的疾病狀態(tài)和病情嚴(yán)重程度、及時采取更具個性化的防治方案提供支持，延緩和阻止疾病進(jìn)展。

(3)本發(fā)明采用特發(fā)性男性不育和健康對照隨機(jī)人群的精漿樣本進(jìn)行驗證，證明了精漿中乙酰肉堿和色氨酸水平在診斷特發(fā)性男性不育中具有較高靈敏度和特異度，可作為標(biāo)志物使用。

(4)本發(fā)明采用嚴(yán)密、多階段的驗證和評價體系，初期通過預(yù)實驗篩選多種精漿代謝小分子，應(yīng)用UPLC-Q exactive MS進(jìn)行獨立人群驗證，保證了該精漿代謝生物標(biāo)志物和診斷方法的可靠性。

(5)UPLC-Q exactive MS技術(shù)樣本處理簡單，儀器分析迅速準(zhǔn)確，具有較高的臨床診斷實用價值。

附圖說明

圖1篩選階段，經(jīng)過校正年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒史的信息，多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)精漿乙酰肉堿和色氨酸的含量增加顯著降低了特發(fā)性男性不育的發(fā)生。^a未調(diào)整混雜因素的單因素Logistic回歸結(jié)果。^b調(diào)整年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒史后的多元Logistic回歸結(jié)果。

圖2代謝小分子檢測水平波動性(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)。

圖3驗證階段，采用精漿乙酰肉堿含量信息制作的正常對照組和特發(fā)性男性不育組之間的ROC曲線。

圖4驗證階段，采用精漿色氨酸含量信息制作的正常對照組和特發(fā)性男性不育組之間的ROC曲線。

圖5驗證階段，采用精漿乙酰肉堿和色氨酸含量信息制作的正常對照組和特發(fā)性男性不育組之間的ROC曲線。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。

實施例1：研究對象選擇和分組依據(jù)

本部分研究對象來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院的首診特發(fā)性男性不育病例及健康生育對照。研究內(nèi)容和知情同意書均得到南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，符合相關(guān)法規(guī)的要求。病例和對照在了解內(nèi)容后簽署了知情同意書。所有研究對象均進(jìn)行了完整的體格檢查，并完成了一份包括個人基礎(chǔ)資料、生活習(xí)慣、職業(yè)和環(huán)境暴露、遺傳危險因素、性功能與生殖功能、疾病史和體力活動的調(diào)查問卷。第一階段納入了符合要求的148例特發(fā)性男性不育病例和148例健康對照；第二階段符合要求的15例特發(fā)性男性不育病例和15例健康對照作為特發(fā)性男性不育精漿代謝小分子生物標(biāo)志物的篩選實驗對象。具體的樣品歸類標(biāo)準(zhǔn)如下：

第一階段 篩選階段

隨機(jī)納入明確診斷的特發(fā)性男性不育148人和健康對照148人，共296人。

A組：健康對照組(148人)：

1.年齡在19至39歲之間；

2.體質(zhì)指數(shù)在17至31之間；

3.生殖能力健康的男性，而且6-8個月后有了健康的后代；

4.無全身重大疾病。

B組：特發(fā)性男性不育疾病組(148人)：

1.年齡與對照組匹配；

2.體質(zhì)指數(shù)與對照組匹配

3.嘗試懷孕12個月沒有成功，而配偶沒有不孕疾病的男性；。

4.無明確男性不育病因；

5.吸煙飲酒史與對照組匹配；

6.民族與對照組匹配；

7.無全身重大疾病。

第二階段 驗證階段

納入明確診斷的特發(fā)性男性不育15人和健康對照15人，共30人。

A組：健康對照組(15人)：

1.年齡在24到36歲之間；

2.體質(zhì)指數(shù)在19至24之間；

3.生殖能力健康的男性，而且6-8個月后有了健康的后代；

4.無全身重大疾病。

B組：特發(fā)性男性不育疾病組(15人)：

1.年齡與對照組匹配；

2.體質(zhì)指數(shù)與對照組匹配；

3.嘗試懷孕12個月沒有成功，而配偶沒有不孕疾病的男性；

4.無明確男性不育病因；

5.吸煙飲酒史與對照組匹配；

6.民族與對照組匹配；

7.無全身重大疾病。

實施例2：UPLC-MS代謝組學(xué)特發(fā)性男性不育生物標(biāo)志物篩選

1.樣本前處理

1.1.取10μL精漿、加入10μL內(nèi)標(biāo)A，加入10μL內(nèi)標(biāo)B，加入10μL內(nèi)標(biāo)C，加入甲醇(試劑A)40μL，渦旋30s，沉淀蛋白。

1.2.離心機(jī)中4℃16000g離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至1.5mL進(jìn)口EP管，并將上清液在室溫條件下于離心濃縮干燥儀中濃縮至干。

1.3.用10μL超純水(試劑D)復(fù)溶，待分析。

2.儀器檢測

2.1.分析儀器：UPLC Ultimate 3000system(Dionex)高效液相色譜儀；Q-Exactive高分辨質(zhì)譜儀。

2.2.液相條件：

2.2.1液相色譜柱為Hypersil GOLD C18色譜柱(100mm×2.1mm,粒徑1.9μm,Thermo Scientific,Germany)，柱溫為40℃。

2.2.2采用的流動相為(A)含0.1％甲酸的水(試劑B)和(B)含0.1％甲酸的乙腈(試劑C)，流速為400μL/min。

2.2.3儀器梯度為：0-3min 1％B，3-10min 1％到99％B，10-13min 99％B，13-13.1min99％到1％B，13.1-17min 1％B。

2.2.4進(jìn)樣方式：體積10μl。

2.3.質(zhì)譜條件

2.3.1加熱電噴霧電離方式(HESI)進(jìn)行分析。

2.3.2采用加熱電噴霧電離方式(HESI)，正離子模式噴霧電壓：3.5kV；負(fù)離子模式噴霧電壓：2.5kV；兩種模式下毛細(xì)管溫度：250℃，加熱器溫度：425℃，鞘氣氣流：50AU，輔助氣氣流：13AU，反吹氣氣流：0AU；透鏡電壓：60V。采用全掃模式，掃描范圍：70到1050m/z；分辨率：70000。

3.物質(zhì)定性

代謝小分子定性采用與標(biāo)準(zhǔn)品乙酰肉堿和色氨酸比對色譜信息(保留時間)和質(zhì)譜信息(精確分子量)，并實時比對樣本中同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品系列的色譜信息以校正保留時間。

4.數(shù)據(jù)分析：

生物標(biāo)志物篩選采用采用多元Logistic回歸確認(rèn)關(guān)鍵代謝物。

5.健康對照組、特發(fā)性男性不育組精漿樣本中代謝小分子的差異和診斷意義。

經(jīng)過校正年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒史的信息，多元Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)精漿乙酰肉堿和色氨酸的含量增加顯著降低了特發(fā)性男性不育的發(fā)生(圖1)。

實施例3精漿代謝小分子的穩(wěn)定性分析

采用實施例2的方法對精漿乙酰肉堿和色氨酸水平的穩(wěn)定性進(jìn)行評價(間隔時間為2周)。結(jié)果顯示，精漿中乙酰肉堿和色氨酸測定水平穩(wěn)定(圖2)，具備作為診斷/監(jiān)測標(biāo)志物的特性。

實施例4代謝小分子組合對特發(fā)性男性不育的診斷

根據(jù)上述UPLC-Q exactive MS代謝組學(xué)方法，本發(fā)明人通過對隨機(jī)人群15病例和15對照的精漿樣品檢測乙酰肉堿和色氨酸，以此繪制ROC曲線并評估診斷的靈敏性和特異性，進(jìn)而評估檢測精漿中這2個代謝小分子水平對特發(fā)性男性不育的評估能力。

乙酰肉堿的靈敏度為93.33％,特異度為80.00％，ROC曲線下面積為0.8933(圖3)；色氨酸靈敏度為80.00％，特異度為73.33％，ROC曲線下面積為0.8267(圖4)。

組合乙酰肉堿和色氨酸的靈敏度為93.33％，特異度為86.67％，ROC曲線下面積為0.9822(圖5)。

故而組合乙酰肉堿和色氨酸具有較好地診斷特發(fā)性男性不育的能力。

實施例5用于特發(fā)性男性不育精漿代謝小分子檢測和診斷試劑盒的制作

首先通過UPLC-Q exactive MS的方法確定正常對照和特發(fā)性男性不育精漿中具有較高豐度的代謝小分子。然后，在其中通過基于UPLC-Q exactive MS的代謝組學(xué)技術(shù)篩選與特發(fā)性男性不育相關(guān)的代謝小分子，作為是否為特發(fā)性男性不育的診斷指標(biāo)。優(yōu)選將篩選出的對應(yīng)精漿代謝小分子的數(shù)量控制在2個，這是在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上做出的最優(yōu)化的精簡。采用這2個精漿代謝小分子，既可以保障較好的靈敏度與特異度，又能節(jié)省成本，減輕患者的負(fù)擔(dān)，還能減少檢測時間，具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點，便于臨床推廣使用，當(dāng)然采用其中1個標(biāo)志物也可以，采用2個標(biāo)志物效果更好。此試劑盒包括一批精漿代謝小分子檢測用試劑和耗材，其中代謝小分子的定性和定量采用乙酰肉堿和色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)品，輔助分析采用內(nèi)標(biāo)A：肌酐、纈氨酸、煙酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰對氨基酚、馬尿酸八種物質(zhì)的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)B：十五烷酸的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)C：二十四烷酸的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)。其它還有用于UPLC色譜分離的配套反向色譜柱(Hypersil GOLD C18色譜柱，100mm×2.1mm,粒徑1.9μm)、用于沉淀精漿蛋白的試劑(100％甲醇)，用于流動相的試劑(含0.1％的甲酸的水和含0.1％的甲酸的乙腈)，用于提取代謝小分子的試劑(100％超純水)。此試劑盒的價值在于只需要10μl精漿，即可檢測精漿代謝小分子標(biāo)志物的含量，再通過含量診斷特發(fā)性男性不育，并易于進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測和觀察治療效果。

具體試劑盒組成如下：

乙酰肉堿標(biāo)準(zhǔn)品

色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品

內(nèi)標(biāo)A(肌酐、纈氨酸、煙酸、胸腺嘧啶、戊二酸、L-苯基丙胺酸、N-乙酰對氨基酚、馬尿酸八種物質(zhì)的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)水溶液)

內(nèi)標(biāo)B(十五烷酸的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)甲醇溶液)

內(nèi)標(biāo)C(二十四烷酸的氘標(biāo)同位素內(nèi)標(biāo)甲醇溶液)

進(jìn)一步，還可以含有：

色譜柱(Thermo 100mm×2.1mm,粒徑1.9μm，Hypersil GOLD C18色譜柱)

試劑A(100％甲醇)

試劑B(含0.1％的甲酸的水)

試劑C(含0.1％的甲酸的乙腈)

試劑D(100％超純水)。

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