本發(fā)明屬于基于生物標(biāo)志物的疾病診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及多囊卵巢綜合征的診斷和/或分型標(biāo)志物及試劑。

背景技術(shù)：

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)于1935年首先由Stein和Leventhal提出，它是一種生殖障礙和代謝紊亂為主要表現(xiàn)的內(nèi)分泌綜合征。持續(xù)性無(wú)排卵、雄激素過(guò)多和胰島素抵抗是其重要特征，是生育期婦女最常見(jiàn)的內(nèi)分泌紊亂性疾病，其生化改變、發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)有高度的異質(zhì)性，病因亦尚未闡明，治療手段目前仍停留在對(duì)癥治療及促排卵層面，尚無(wú)特效治療手段。

多囊卵巢綜合征的西醫(yī)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)(鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn))：⑴稀發(fā)排卵或無(wú)排卵。⑵高雄激素的臨床表現(xiàn)和/或高雄激素血癥。⑶卵巢多囊性改變：一側(cè)或雙側(cè)卵巢直徑2～9mm的卵泡≥12個(gè)，和/或卵巢體積≥10mL。⑷上述三條中符合兩條。

診斷過(guò)程需要結(jié)合問(wèn)診、超聲和多個(gè)免疫生化試劑盒的聯(lián)合檢測(cè)，成本高、診斷復(fù)雜。因此開(kāi)發(fā)新的方法應(yīng)用于臨床十分緊迫。

AE-PCOS和香港大學(xué)共同舉辦了一次共識(shí)會(huì)議，通過(guò)對(duì)亞太地區(qū)PCOS臨床研究的總結(jié)，結(jié)合對(duì)我國(guó)社區(qū)15924名受試者的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)亞太地區(qū)PCOS女性臨床特點(diǎn)與歐美女性顯著不同，亞太地區(qū)女性胰島素抵抗的發(fā)病率更高(Human Reproduction,2013,28:2562)，鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)中的高雄激素血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)不適用于亞洲人群，95.5％的亞洲PCOS女性FG評(píng)分均≤5分，應(yīng)將FG評(píng)分>4分作為亞洲女性多毛的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

PCOS涉及的病理機(jī)制非常復(fù)雜，目前對(duì)于PCOS已有體內(nèi)代謝方面的研究，研究發(fā)現(xiàn)PCOS主要與甾體激素代謝(Jedel E,Gustafson D,Waern M,et al.Psychoneuroendocrinology,2011,36(10):1470-1479.)、脂肪酸代謝(Zhang X J,Huang L L,Su H,et al.Journal of pharmaceutical and biomedical analysis,2014,95:85-92.)和氨基酸代謝(Zhang C,Zhao Y,Li R,et al.BMC pregnancy and childbirth,2014,14(1):11)有關(guān)。雖然在這幾類(lèi)代謝中都有定性定量分析，但是有的研究只關(guān)注部分化合物，還有的研究?jī)H僅是涉及到一些化合物的變化，并沒(méi)有重點(diǎn)關(guān)注，說(shuō)明已有的研究存在碎片化的傾向，而PCOS是非常復(fù)雜的代謝紊亂疾病，需要從整體和系統(tǒng)上來(lái)探討，并將探索的結(jié)果加以整合，建立整合生物標(biāo)志物系統(tǒng)，從而來(lái)探討發(fā)病機(jī)制以及指導(dǎo)臨床診斷和治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于針對(duì)目前多囊卵巢綜合征診斷復(fù)雜、成本高的臨床問(wèn)題，提供一組標(biāo)志物，可以聯(lián)合輔助診斷多囊卵巢綜合征和/或?qū)ζ浞中汀?/p>

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一組檢測(cè)試劑在制備用于診斷和/或分型多囊卵巢綜合征的試劑中的用途，為多囊卵巢綜合征的診斷和/或分型提供更加便捷高效的試劑。

具體地，根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)目的，本發(fā)明提供了環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷、硫酸脫氫表雄酮、棕櫚鞘磷脂聯(lián)合高密度脂蛋白膽固醇和左卵泡數(shù)目作為多囊卵巢綜合征的診斷和/或分型標(biāo)志物的用途。

根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)目的，本發(fā)明還提供了環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷檢測(cè)試劑、硫酸脫氫表雄酮檢測(cè)試劑聯(lián)合棕櫚鞘磷脂檢測(cè)試劑，在制備用于診斷和/或分型多囊卵巢綜合征的試劑中的用途。這三種檢測(cè)試劑，可以直接使用現(xiàn)有市售商品，也可以自行制備，本發(fā)明并不對(duì)其進(jìn)行任何限制。

優(yōu)選地，上述用途中，所述環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷檢測(cè)試劑檢測(cè)生物樣本中環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的濃度；所述硫酸脫氫表雄酮檢測(cè)試劑檢測(cè)生物樣本中硫酸脫氫表雄酮的濃度；所述棕櫚鞘磷脂檢測(cè)試劑檢測(cè)生物樣本中棕櫚鞘磷脂的濃度。

優(yōu)選地，上述用途中，所述生物樣本為血清、血漿或血液。

優(yōu)選地，上述用途中，所述環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的濃度標(biāo)記為X₁，硫酸脫氫表雄酮的濃度標(biāo)記為X₂，棕櫚鞘磷脂的濃度標(biāo)記為X₃，按照診斷方程Y＝0.408X₁+0.017X₂+0.011X₃-16.535，

當(dāng)Y≤-5.20時(shí)，該樣本判定為正常樣本；當(dāng)-5.20<Y≤2.29時(shí)，該樣本為PCOS患者樣本，且判定分型為亞組一；當(dāng)Y＞2.29時(shí)，該樣本為PCOS患者樣本，且可判定分型為亞組二；

所述亞組一為激素代謝異常為主的亞型；

所述亞組二為激素代謝異常伴有顯著的脂代謝異常為主的亞型。

優(yōu)選地，上述實(shí)現(xiàn)第二個(gè)目的的其中幾個(gè)用途中，還聯(lián)合有高密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑。4中標(biāo)志物的檢測(cè)試劑聯(lián)合，可以用于制備成試劑盒。

優(yōu)選地，上述用途中，所述高密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑檢測(cè)生物樣本中高密度脂蛋白膽固醇的濃度，所述生物樣本為血清、血漿或血液。

優(yōu)選地，上述用途中，還聯(lián)合左卵泡數(shù)目進(jìn)行多囊卵巢綜合征診斷和/或分型。

優(yōu)選地，上述用途中，所述環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的濃度標(biāo)記為X₁，硫酸脫氫表雄酮的濃度標(biāo)記為X₂，棕櫚鞘磷脂的濃度標(biāo)記為X₃，高密度脂蛋白膽固醇的濃度標(biāo)記為X₄，左卵泡數(shù)目標(biāo)記為X₅，按照診斷方程Y＝0.402X₁+0.009X₂+0.034X₃+15.775X₄+2.906X₅-42.597，

當(dāng)Y≤11.34時(shí)，該樣本判定為正常樣本；當(dāng)11.34<Y≤33.23時(shí)，該樣本為PCOS患者樣本，且判定分型為亞組一；當(dāng)Y＞33.23時(shí)，該樣本為PCOS患者樣本，且可判定分型為亞組二；

所述亞組一為激素代謝異常為主的亞型；

所述亞組二為激素代謝異常伴有顯著的脂代謝異常為主的亞型。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過(guò)聯(lián)合多個(gè)小分子代謝物共同作為標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)了簡(jiǎn)單快速診斷多囊卵巢綜合征的目的，同時(shí)降低了檢測(cè)成本。另外，申請(qǐng)人研究首次發(fā)現(xiàn)多囊卵巢綜合征患者具有兩個(gè)亞型，本發(fā)明提供的組合的小分子代謝物也可在多囊卵巢綜合征分型診斷中應(yīng)用，為疾病的科學(xué)治療奠定了基礎(chǔ)。通過(guò)本發(fā)明篩選出的小分子代謝物，選用其檢測(cè)劑制備診斷和/或分型試劑，配合分析檢測(cè)方法，有效解決了多囊卵巢綜合征診斷復(fù)雜、成本高的臨床問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1是PCOS患者和正常組的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)OPLS-DA分析圖。

圖2是PCOS患者和正常組代謝數(shù)據(jù)Loading圖。

圖3是3個(gè)聚焦代謝物在各組變化情況，其中，*表示與正常組相比，P＜0.05；^△表示與亞組一相比，P＜0.05。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

以下僅為本發(fā)明的其中一個(gè)示例性實(shí)施例：

一、PCOS患者血漿樣本的代謝組學(xué)研究

1材料

1.1病例選擇

所有觀察病例為北京協(xié)和醫(yī)院就診的患者血漿共49例，健康志愿血漿50例。PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2003年的Rotterdam統(tǒng)一的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，具備以下3項(xiàng)指標(biāo)中的兩項(xiàng)：①排卵障礙，具有月經(jīng)異常(稀發(fā)、閉經(jīng))和不孕等；②高雄，多毛和痤瘡等高雄表現(xiàn)；或高雄血癥，即月經(jīng)第3～5d或閉經(jīng)期血總睪酮水平≥2.2nmol/L；③多囊卵巢形態(tài)學(xué)，經(jīng)直腸超聲檢查，至少在一個(gè)卵巢的一個(gè)截面見(jiàn)直徑3～8mm的10個(gè)及以上的卵泡。

1.2儀器與試劑

液相檢測(cè)：采用Waters ACQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)，配自動(dòng)進(jìn)樣器；質(zhì)譜檢測(cè)：采用Waters Xevo G2Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀，配ESI電離源；振動(dòng)和旋渦混合：采用江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司的VORTEX-5渦旋混合器；旋轉(zhuǎn)式水浴氮吹儀；離心：采用美國(guó)Beckman Coulter的AllegraTM X-22臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

HPLC級(jí)乙腈、甲醇：購(gòu)自德國(guó)Merck公司；甲酸：購(gòu)自瑞士Fluka公司；超純水(18.2MΩ)：法國(guó)Millipore公司Milli-Q超純水系統(tǒng)制備；其他試劑均采用市售分析純。

2方法

2.1臨床樣本的收集

所有觀察對(duì)象于月經(jīng)干凈后5～7d(閉經(jīng)者經(jīng)B超檢查無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡時(shí)，日期不限)，清晨空腹采集肘靜脈血8mL，留置于EDTA抗凝管中，4℃、3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15min后收集血漿分裝于1.5mL Eppendorf管中，放入-80℃冰箱儲(chǔ)存。

2.2臨床指標(biāo)測(cè)定

物理檢查：受試者脫鞋，著單衣，分別測(cè)量身高(m)、體質(zhì)量(kg)，計(jì)算BMI，公式如下：BMI＝體質(zhì)量/身高2(kg/m²)。

測(cè)量受試者的腰圍(cm)、臀圍(cm)，計(jì)算WHR，公式如下：WHR＝腰圍/臀圍；右卵泡數(shù)目、右卵泡大小/cm、左卵泡數(shù)目、左卵泡大小/cm。

激素檢查：受試者測(cè)定FSH(IU/L)、LH(IU/L)、PRL(ng/ml)、E2(pg/ml)、P(ng/ml)、T(ng/ml)、Ds(μg/dl)、TC(mmol/L)、TG(mmol/L)、HDL-C(mmol/L)、LDL-C(mmol/L)、ApoA1(g/L)、ApoB(g/L)、Lp(a)(mg/L)、hsCRP(mg/L)、FFA(μmol/L)、GLU(mmol/L)、INS(μIU/ml)、HbA1c(％)。

2.3血液樣品前處理

將保存的血漿4℃凍融后，振蕩混合均勻，吸取100μL血漿樣本，加入甲醇400μL，渦旋振蕩2min沉淀蛋白，離心(4℃，12000rpm，20min)，取上清400μL，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，N2揮干溶媒。加入120μL(所含血漿的3倍量)復(fù)溶溶劑乙腈-水(1:4v/v)復(fù)溶，渦旋振蕩2min，使溶解，離心(4℃，12000rpm，30min)，取上清，置于2mL進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)樣10μL分析。

2.4UPLC-Q-TOF/MS分析

色譜分析：

負(fù)離子模式下的色譜條件：色譜柱為BEH C18柱(2.1×100mm)柱溫：40℃進(jìn)樣10μL，流動(dòng)相：A為高純水(0.1％甲酸水溶液)，B溶劑為乙腈溶液，流速為0.4m L/min.梯度洗脫條件見(jiàn)表。

表1.色譜流動(dòng)相梯度洗脫條件

質(zhì)譜分析：

質(zhì)譜為Waters公司Q-TOF串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀配有電噴霧離子源(ESI).質(zhì)譜采用負(fù)離子兩種模式進(jìn)行檢測(cè)。負(fù)離子條件為：電噴霧氣流量(脫溶劑氣流量)600L/h、錐孔氣流量50L/h、電噴霧氣(脫溶劑氣)溫度350℃、離子源溫度110℃、毛細(xì)管電壓3000V、錐孔電壓30V、掃描時(shí)間0.1S,掃描間隔0.02S。數(shù)據(jù)采集范圍m/z 100～1000。

2.5數(shù)據(jù)預(yù)處理與多維統(tǒng)計(jì)分析

血樣經(jīng)色譜分離、質(zhì)譜采集后生成原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)RAW文件，數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerLynx(美國(guó)Waters公司)軟件包，通過(guò)濾噪峰檢測(cè)和峰匹配，生成包含保留時(shí)間、質(zhì)荷比、峰面積的三維數(shù)據(jù)矩陣，運(yùn)行得到Markerlist表格，將該矩陣表存成Excel文件。將Markerlynx軟件處理結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P 12.0進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

2.6潛在標(biāo)志物的篩選

采用無(wú)監(jiān)督分析方法，進(jìn)行主成分(PCA)分析，查看各組之間的聚類(lèi)效果，同時(shí)為了更有效的找出各組間差異，在對(duì)樣本信息及分組已知的基礎(chǔ)上采用正交信號(hào)校正結(jié)合偏最小二乘聚類(lèi)分析方法(OSC-PLS-DA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從模型得到的變量權(quán)重值(Variable important in projection，VIP)中來(lái)選擇貢獻(xiàn)較大的差異變量，并結(jié)合T檢驗(yàn)，獲得顯示保留時(shí)間、質(zhì)荷比以及響應(yīng)強(qiáng)度等信息的代謝物列表。然后使用Masslynx軟件中的元素匹配(i-Fit)功能，對(duì)所篩選的化合物進(jìn)行判別，推斷其可能的化學(xué)式。綜合考慮與實(shí)際化學(xué)式的質(zhì)量偏差(用mDa或者ppm表示)、合理的雙鍵數(shù)(DBE)以及i-FIT值來(lái)評(píng)判為該化學(xué)式可能性的大小，計(jì)算其可能的分子式。將分子式導(dǎo)入HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG LIGAND數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索鑒定。最終得到與PCOS疾病相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物

2.7臨床指標(biāo)的篩查

臨床激素與診斷指標(biāo)，使用SPSS進(jìn)行T檢驗(yàn)，篩選出具有差異的特癥指標(biāo)，將差異指標(biāo)結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P 12.0進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

2.8特征指標(biāo)聚焦

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)(ANN)通過(guò)預(yù)先提供的一批相互對(duì)應(yīng)的輸入-輸出數(shù)據(jù)，分析掌握兩者之間潛在的規(guī)律，最終根據(jù)這些規(guī)律，用新的輸入數(shù)據(jù)來(lái)推算輸出結(jié)果。在模糊邏輯系統(tǒng)中，基于輸入與輸出之間的規(guī)律，以多值邏輯為基礎(chǔ)得出隱含在數(shù)據(jù)中的有用信息，找到對(duì)因變量有影響的自變量數(shù)據(jù)，其結(jié)果結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)能力和模糊邏輯的表達(dá)能力，使神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模型由黑箱變灰箱，從而表達(dá)出其中的規(guī)律性。建立多樣本的分類(lèi)模型，以代謝標(biāo)志物、臨床指標(biāo)、整合臨床代謝指標(biāo)為基礎(chǔ)，利用模型聚焦樣本，尋找潛在重點(diǎn)標(biāo)志物。

2.9聚焦指標(biāo)ROC分析

受試者工作特癥曲線(receiver operating characteristic curve，簡(jiǎn)稱(chēng)ROC曲線)，其將靈敏度與特異性以圖示方法結(jié)合在一起，可準(zhǔn)確反映某分析方法特異性和敏感性的關(guān)系，是試驗(yàn)準(zhǔn)確性的綜合代表。將聚焦指標(biāo)進(jìn)行ROC分析，根據(jù)曲線下面積觀察其對(duì)疾病識(shí)別能力強(qiáng)弱。

3結(jié)果與討論

3.1代謝指紋譜的建立

在液相色譜條件優(yōu)化方面，考察了流速、進(jìn)樣體積、柱溫等對(duì)樣品分離的影響，在質(zhì)譜條件優(yōu)化方面，考察了正、負(fù)離子模式，脫溶劑氣流量，溫度等因素。使用選定分析方法對(duì)99例血漿樣本進(jìn)行分離檢測(cè)。典型的志愿者和PCOS患者血漿代謝指紋譜的基峰離子流如圖1所示。

將來(lái)自PCOS患者和正常人的血漿樣品進(jìn)行混合作為質(zhì)量控制標(biāo)樣，將質(zhì)控樣本按照選定方法進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣5次，隨機(jī)選取代謝指紋譜中的10個(gè)峰進(jìn)行方法學(xué)考察，統(tǒng)計(jì)其保留時(shí)間及峰強(qiáng)度值的變化，結(jié)果表明，本方法具有較好的精密度(峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD小于10％)，滿足研究的要求。

3.2代謝數(shù)據(jù)聚類(lèi)分析結(jié)果

正交信號(hào)校正方法(OSC)可以濾掉與類(lèi)別判斷不相關(guān)(正交)的變量信息,只保留與類(lèi)別判斷有關(guān)的變量信息，從而使模式聚類(lèi)分析可以集中在這些與類(lèi)別的判別相關(guān)的變量上，提高了分型判別的準(zhǔn)確性。采用OPLS-DA對(duì)PCOS和正常組的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別(PCOS患者和正常組的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)OPLS-DA分析結(jié)果見(jiàn)圖1)。49例患者和50例正常人可以得到明顯的區(qū)分，且患者組分為兩個(gè)亞組，對(duì)于所建立的模型，其Q2為0.836(R2X＝0.21，R2Y＝0.95)，即其中21％的變量作為建立模型的主要成分，95％的樣本符合模型判別，模型的預(yù)測(cè)能力達(dá)到83.6％，可見(jiàn)，研究中建立的模型能夠很好地對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和預(yù)測(cè)。

從樣本的代謝指紋譜聚類(lèi)分析可知，因正常組和疾病組可以完全分開(kāi)，說(shuō)明了PCOS患者體內(nèi)代謝過(guò)程發(fā)生異常，并且PCOS患者完全分離為兩個(gè)亞組，說(shuō)明同樣是PCOS患者，其體內(nèi)代謝變化也并不一致，預(yù)示可能有兩種發(fā)病機(jī)制。PCOS患者組依據(jù)自身不同的代謝狀態(tài)明顯的分為兩個(gè)亞組，命名為亞組一和亞組二，通過(guò)鑒定的34個(gè)潛在代謝標(biāo)志物(見(jiàn)表2)。通過(guò)對(duì)34個(gè)潛在代謝標(biāo)志物的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，亞組一激素代謝發(fā)揮主要作用，亞組二在激素代謝異常的同時(shí)，脂代謝也起到了重要作用。

表2鑒定的PCOS相關(guān)的34種體內(nèi)潛在代謝標(biāo)志物

在PCOS患者和正常組的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)OPLS-DA分析圖圖1中，編號(hào)為N49、N50兩例樣本為PCOS疑似病例，后因其臨床生化指標(biāo)與正常值接近，最終確診為正常樣本，但通過(guò)代謝組學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，N49、N50兩例樣本體內(nèi)代謝狀態(tài)已經(jīng)發(fā)生變化，應(yīng)屬于PCOS患者或者疾病前期，預(yù)示代謝指標(biāo)的變化比臨床生化指標(biāo)的變化更靈敏。

3.3潛在代謝標(biāo)志物鑒定

OPLS-DA的荷載圖(參見(jiàn)圖2)，那些距離原點(diǎn)遠(yuǎn)的變量對(duì)各組的分類(lèi)起到顯著的作用。結(jié)合標(biāo)志物在模型中的VIP值以及S-plot分析，結(jié)合質(zhì)譜同位素匹配與數(shù)據(jù)庫(kù)檢索系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，最終確定了對(duì)于樣品分類(lèi)起決定性作用的34個(gè)特癥代謝變量，并將其作為PCOS疾病導(dǎo)致人體代謝狀態(tài)變化的潛在生物標(biāo)志物，其中包括磷脂、脂肪酸、嘧啶、固醇類(lèi)等小分子化合物。表中列舉了這34種體內(nèi)代謝產(chǎn)物在正常組與PCOS患者組的變化情況，這些代謝物兩組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。

3.4臨床指標(biāo)

正常與患者各組重要臨床生化指標(biāo)(表3)，臨床研究表明體質(zhì)指數(shù)、腰臀比患者組均顯著上升，說(shuō)明患者體內(nèi)的脂代謝異常從而導(dǎo)致體型較正常人偏胖。同時(shí)患者體內(nèi)性激素、血脂分泌紊亂，且胰島素、谷氨酸、炎癥因子顯著升高。這些指標(biāo)的異常變化從側(cè)面說(shuō)明了多囊卵巢疾病的綜合性會(huì)引發(fā)整個(gè)機(jī)體的代謝功能發(fā)生紊亂。

表3正常與患者各組重要臨床生化指標(biāo)

*表示與正常組相比，P＜0.05；△表示與亞組一相比，P＜0.05。

3.5潛在代謝標(biāo)志物和臨床指標(biāo)的聚焦分析結(jié)果

聚焦采用的是模糊神經(jīng)邏輯，將99例樣本根據(jù)正患不同類(lèi)型分為三部分，以潛在34個(gè)生物標(biāo)志物(代謝標(biāo)志物)、臨床指標(biāo)、整合臨床代謝標(biāo)志物(整合標(biāo)志物)為基礎(chǔ)，分別建立模糊神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型(NeuroFuzzy logic model)。通過(guò)不斷的訓(xùn)練，使模型達(dá)到過(guò)擬合的狀態(tài)，即模型的R²值無(wú)限接近或大于1，通過(guò)這個(gè)模型尋找到對(duì)模型建立貢獻(xiàn)最大變量，從而得到聚焦后的變量集合，具體信息見(jiàn)表4。

表4模糊神經(jīng)邏輯聚焦的變量結(jié)果

將99個(gè)樣本隨機(jī)分成訓(xùn)練集(83個(gè)樣本點(diǎn))和測(cè)試集(16個(gè)樣本點(diǎn))，利用訓(xùn)練集數(shù)據(jù)的所有變量，使用人工神經(jīng)軟件，訓(xùn)練神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，利用測(cè)試集的數(shù)據(jù)對(duì)訓(xùn)練結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)，經(jīng)過(guò)參數(shù)調(diào)整后，最終得到真實(shí)值和預(yù)測(cè)值的擬合直線的R²值，即預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。

利用訓(xùn)練集數(shù)據(jù)的聚焦變量，同樣的方法建立并訓(xùn)練人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，利用測(cè)試集的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，經(jīng)過(guò)參數(shù)調(diào)整后，最終得到預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率，具體結(jié)果見(jiàn)表5。

表5人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)聚焦的變量分組預(yù)測(cè)結(jié)果

從結(jié)果來(lái)看，三組聚焦變量對(duì)各個(gè)分組的貢獻(xiàn)度均大于80％，且各聚焦變量預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率與所有變量集預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率相當(dāng)，說(shuō)明各聚焦變量可以表征所有變量的含量信息。這些模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率雖都未能達(dá)到100％，但聚焦整合標(biāo)志物的結(jié)果已經(jīng)達(dá)到95％以上，并且聚焦代謝標(biāo)志物及整合標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確率均明顯高于目前采用的臨床指標(biāo)的診斷準(zhǔn)確率。

3.6ROC曲線分析

根據(jù)ANN分析的結(jié)果，聚焦得到5個(gè)臨床指標(biāo)、3個(gè)代謝標(biāo)志物、5個(gè)整合標(biāo)志物。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行ROC曲線分析，評(píng)價(jià)上述三種標(biāo)志物組合用于PCOS診斷和疾病分型的準(zhǔn)確率、特異性和靈敏度。

依據(jù)判別分析將各組聚焦變量整合為多因素方程，根據(jù)該方程所得三組因變量Y值，利用該Y值分別對(duì)正常組-患者亞組一、正常組-患者亞組二，兩患者亞組進(jìn)行ROC分析，聚焦臨床指標(biāo)、聚焦代謝標(biāo)志物及聚焦整合標(biāo)志物的分析結(jié)果分別見(jiàn)表6-表8。

表6聚焦臨床指標(biāo)ROC曲線分析結(jié)果

表7聚焦代謝標(biāo)志物ROC曲線分析結(jié)果

表8聚焦整合標(biāo)志物ROC曲線分析結(jié)果

在篩選測(cè)試中一般要求有高靈敏度以排除沒(méi)有疾病的人；特異性(specificity)，或真陰性率，指示其在正確選擇沒(méi)有疾病的人中的能力。在診斷中一般要求有高特異性以獲得較低的假陽(yáng)性率。單用臨床指標(biāo)，其診斷亞組一和亞組二的診斷準(zhǔn)確率只有62.1％；單用代謝指標(biāo)各組之間的診斷準(zhǔn)確率均能達(dá)到87.4％以上，已經(jīng)具有比較好的疾病診斷和分型能力，3個(gè)潛在代謝標(biāo)志物在各組的含量變化如圖3所示；而結(jié)合3個(gè)聚焦代謝標(biāo)志物和2臨床指標(biāo)：HDL-C與左卵泡數(shù)目，則對(duì)正常、亞組一和亞二的診斷準(zhǔn)確率均能達(dá)到90％以上，可提高PCOS的診斷率，并達(dá)到病人的準(zhǔn)確分型，為臨床個(gè)體化治療提供診斷依據(jù)。

3.7診斷閾值

由于左卵泡數(shù)目與HDL-C是臨床常用診斷指標(biāo)，已有比較成熟的診斷閾值，本研究發(fā)現(xiàn)的3個(gè)代謝標(biāo)志物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)PCOS的診斷和分型，結(jié)合HDL-C與左卵泡數(shù)目聯(lián)合診斷可以提高PCOS的診斷準(zhǔn)確率，并實(shí)現(xiàn)疾病的精準(zhǔn)分型。

聚焦代謝標(biāo)志物的診斷閾值：

應(yīng)用含有3個(gè)代謝標(biāo)志物的檢測(cè)試劑的試劑盒檢測(cè)時(shí)，對(duì)檢測(cè)得到的3個(gè)代謝物的血清濃度建立診斷方程：Y＝0.408X₁+0.017X₂+0.011X₃-16.535，其中，X₁為血液中環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的測(cè)定濃度；X₂為血液中硫酸脫氫表雄酮的測(cè)定濃度；X₃為血液中棕櫚鞘磷脂的測(cè)定濃度。將每個(gè)樣本測(cè)定得到的環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷、硫酸脫氫表雄酮及棕櫚鞘磷脂含量帶入診斷方程，計(jì)算診斷因子Y值。當(dāng)Y≤-5.20時(shí)，該樣本可判定為正常樣本；當(dāng)-5.20<Y≤2.29時(shí)，該樣本為PCOS患者樣本，且可判定分型為亞組一(激素代謝異常為主)；當(dāng)Y＞2.29時(shí)，該樣本為PCOS患者樣本，且可判定分型為亞組二(激素代謝異常伴有顯著的脂代謝異常)。

聚焦整合標(biāo)志物的診斷閾值：

應(yīng)用含有3個(gè)代謝標(biāo)志物的檢測(cè)試劑及高密度脂蛋白膽固醇檢測(cè)試劑的試劑盒檢測(cè)時(shí)，對(duì)檢測(cè)得到的3個(gè)代謝物的血清濃度聯(lián)合高密度脂蛋白膽固醇和左卵泡數(shù)目建立診斷方程：Y＝0.402X₁+0.009X₂+0.034X₃+15.775X₄+2.906X₅-42.597，其中，X₁為血液中環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷的測(cè)定濃度；X₂為血液中硫酸脫氫表雄酮的測(cè)定濃度；X₃為血液中棕櫚鞘磷脂的測(cè)定濃度；X₄為高密度脂蛋白膽固醇的濃度；X₅為左卵泡數(shù)目。將每個(gè)樣本測(cè)定得到的環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷、硫酸脫氫表雄酮及棕櫚鞘磷脂含量及高密度脂蛋白膽固醇的濃度、左卵泡數(shù)目帶入診斷方程，計(jì)算診斷因子Y值。當(dāng)Y≤11.34時(shí)，該樣本判定為正常樣本；當(dāng)11.34<Y≤33.23時(shí)，該樣本為PCOS患者樣本，且判定分型為亞組一(激素代謝異常為主)；當(dāng)Y＞33.23時(shí)，該樣本為PCOS患者樣本，且可判定分型為亞組二(激素代謝異常伴有顯著的脂代謝異常)。

相比現(xiàn)有PCOS診斷的臨床指標(biāo)而言，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的三個(gè)代謝標(biāo)志物環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷、硫酸脫氫表雄酮和棕櫚鞘磷脂聯(lián)合診斷即可達(dá)到區(qū)分正常、PCOS亞組一和亞組二的效果。而結(jié)合HDL-C與左卵泡數(shù)目聯(lián)合診斷，可提高其對(duì)正常、PCOS患者亞組一和亞組二的診斷準(zhǔn)確率(均達(dá)到90％以上)。本發(fā)明為臨床疾病診斷提供了準(zhǔn)確有效的指標(biāo)體系。

4結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PCOS患者存在兩種主要代謝異常：脂質(zhì)代謝與激素代謝異常，可能的作用機(jī)制為患者體內(nèi)高脂與高雄激素相互影響；并且亞組一激素代謝發(fā)揮主要作用，亞組二在激素代謝異常的同時(shí)，脂代謝也起到了重要作用。在此基礎(chǔ)上通過(guò)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和ROC曲線分析，得到了聚焦整合標(biāo)志物體系：3個(gè)代謝物標(biāo)志物結(jié)合兩個(gè)臨床指標(biāo)，可用于PCOS的疾病診斷和兩個(gè)亞組的分型，并且預(yù)測(cè)診斷率可達(dá)到90％以上。這也說(shuō)明臨床指標(biāo)和代謝標(biāo)志物各有優(yōu)勢(shì)，兩者結(jié)合可以彌補(bǔ)各自的不足，達(dá)到更高的診斷效率，對(duì)疾病的發(fā)生和分型做出更精準(zhǔn)的診斷

以上所述實(shí)施例僅是為充分說(shuō)明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。