本發(fā)明屬于中藥檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種桂枝茯苓膠囊中多糖含量的檢測方法。
背景技術(shù)：
：桂枝茯苓膠囊由桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍和桃仁共五味中藥組成，具有活血、化瘀、消癥之功效，主治婦人瘀血阻絡(luò)所致癥塊、經(jīng)閉、痛經(jīng)、產(chǎn)后惡露不盡；子宮肌瘤，慢性盆腔炎包塊，痛經(jīng)，子宮內(nèi)膜異位癥，卵巢囊腫見上述證候者；也可用于女性乳腺香囊性增生病屬瘀血阻絡(luò)癥，癥見乳房疼痛、乳房腫塊、胸肋脹悶；或用于前列腺增生屬瘀阻膀胱證，癥見小便不爽、小腹脹痛。桂枝茯苓膠囊中的多糖含量對控制和評價桂枝茯苓膠囊的質(zhì)量具有十分重要的意義。目前多糖含量的檢測多采用顯色法，這種方法專屬性差，且準(zhǔn)確度不高。因此，為了更好地反映桂枝茯苓膠囊的內(nèi)在質(zhì)量，研究一種新的桂枝茯苓膠囊中多糖含量的檢測方法是十分必要的。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種桂枝茯苓膠囊中多糖含量的檢測方法，本發(fā)明提供的方法專屬性好，準(zhǔn)確性高。本發(fā)明提供了一種桂枝茯苓膠囊中多糖含量的檢測檢測方法，包括以下步驟：a)、將水與桂枝茯苓膠囊的內(nèi)容物混合后依次進(jìn)行超聲處理和固液分離，得到沉淀物；b)、將所述沉淀物與硫酸混合，回流反應(yīng)，得到反應(yīng)液；c)、將所述反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至4～8后與乙醇混合，得到待測樣品液；d)、采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器對所述待測樣品液進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果和預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，得到所述待測樣品液中D-無水葡萄糖的含量。優(yōu)選的，所述內(nèi)容物與水的用量比為(0.1～0.5)g：(20～50)mL。優(yōu)選的，所述硫酸的濃度為2～5mol/mL；優(yōu)選的，所述內(nèi)容物與硫酸的用量比為(0.1～0.5)g：(10～30)mL。優(yōu)選的，所述回流反應(yīng)的時間為2～6h。優(yōu)選的，步驟c)中，將所述反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至4.5～6。優(yōu)選的，步驟d)中，檢測過程中采用的流動相為三乙胺溶液和乙腈。優(yōu)選的，步驟d)中，檢測過程中的流動相流速為0.8～1.2mL/min。優(yōu)選的，步驟d)中，檢測過程中的色譜柱柱溫為40～50℃。優(yōu)選的，步驟d)中，檢測過程中的理論塔板數(shù)按D-無水葡萄糖峰計算不低于2000。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種桂枝茯苓膠囊中多糖含量的檢測方法，該方法包括以下步驟：a)、將水與桂枝茯苓膠囊的內(nèi)容物混合后依次進(jìn)行超聲處理和固液分離，得到沉淀物；b)、將所述沉淀物與硫酸混合，回流反應(yīng)，得到反應(yīng)液；c)、將所述反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至4～8后與乙醇混合，得到待測樣品液；d)、采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器對所述待測樣品液進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果和預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，得到所述待測樣品液中D-無水葡萄糖的含量。本發(fā)明首先以水為溶劑在超聲條件下溶解桂枝茯苓膠囊的內(nèi)容物中單糖、二糖和β-環(huán)糊精；然后固液分離，得到含有多糖成分的沉淀物；之后將該沉淀物與硫酸混合反應(yīng)，使沉淀物中的多糖水解為D-無水葡萄糖；最后將反應(yīng)得到的反應(yīng)液制成待測樣品液，采用HPLC(高效液相色譜)-ELSD(蒸發(fā)光散射)法對待測樣品液中的D-無水葡萄糖的含量進(jìn)行檢測。由于沉淀物中的糖類成分只有多糖，待測樣品液中的D-無水葡萄糖均由多糖水解而成，因此通過測定待測樣品液中D-無水葡萄糖含量的大小可直接反映出桂枝茯苓膠囊中多糖含量的高低，從而實現(xiàn)對桂枝茯苓膠囊中多糖含量的評價。對本發(fā)明提供的方法的專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率進(jìn)行評價，結(jié)果表明本發(fā)明提供的方法專屬性良好，精密度RSD≤1.16％，穩(wěn)定性RSD≤2.21％，重復(fù)性RSD為1.89％，平均回收率為100.11％、回收率RSD為1.39％，可用于評價桂枝茯苓膠囊中的多糖含量。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。圖1是本發(fā)明實施例1提供的D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2是本發(fā)明實施例5提供的D-無水葡萄糖含量測定專屬性試驗圖譜；圖3是本發(fā)明實施例6提供的不同流速和柱溫的色譜圖；圖4是本發(fā)明實施例6提供的不同載氣流速、漂移管溫度和色譜柱的色譜圖。具體實施方式下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供了一種桂枝茯苓膠囊中多糖含量的檢測方法，包括以下步驟：a)、將水與桂枝茯苓膠囊的內(nèi)容物混合后依次進(jìn)行超聲處理和離心，得到沉淀物；b)、將所述沉淀物與硫酸混合，回流反應(yīng)，得到反應(yīng)液；c)、將所述反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至4～8后與乙醇混合，得到待測樣品液；d)、采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器對所述待測樣品液進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果和預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，得到桂枝茯苓膠囊中的多糖含量。在本發(fā)明提供的方法中，首先除去桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物中的單糖、二糖和β-環(huán)糊精，采用的方式為：a)、將水與桂枝茯苓膠囊的內(nèi)容物混合后依次進(jìn)行超聲處理和固液分離，得到沉淀物。其中，所述內(nèi)容物和水的用量比優(yōu)選為(0.1～0.5)g：(20～50)mL，更優(yōu)選為0.25g：(20～50)mL，最優(yōu)選為0.25g：30mL。所述超聲處理的頻率優(yōu)選為20～60KHz，更優(yōu)選為30～40KHz；所述超聲處理的功率優(yōu)選為200～300W，更優(yōu)選為250～260W；所述超聲處理的時間優(yōu)選為10～60min；更優(yōu)選為30～40min。所述固液分離的方式優(yōu)選為離心；所述離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為5000～20000r/min，更優(yōu)選為10000～15000r/min，最優(yōu)選為11000～13000r/min；所述離心的時間優(yōu)選為10～30min，更優(yōu)選為15～20min。在本發(fā)明中，為了提高沉淀物中多糖的純凈度(減少單糖、二糖和β-環(huán)糊精含量)，優(yōu)選對得到的所述沉淀物重復(fù)進(jìn)行步驟a)的操作，所述重復(fù)的次數(shù)優(yōu)選為1～3次，更優(yōu)選為2次。得到所述沉淀物中，將所述沉淀物與硫酸混合，進(jìn)行回流反應(yīng)。其中，所述硫酸的濃度優(yōu)選為2～5mol/mL，更優(yōu)選為3mol/mL。所述內(nèi)容物與硫酸的用量比優(yōu)選為(0.1～0.5)g：(10～30)mL，更優(yōu)選為0.25g：(10～30)mL，最優(yōu)選為0.25g：20mL。所述回流反應(yīng)的時間優(yōu)選為2～6h，更優(yōu)選為3～4h?；亓鞣磻?yīng)過程中桂枝茯苓膠囊中多糖水解為D-無水葡萄糖，回流反應(yīng)結(jié)束后，得到反應(yīng)液。得到所述反應(yīng)液后，將所述反應(yīng)液的pH值調(diào)節(jié)至4～8，優(yōu)選調(diào)節(jié)至4.5～6。在本發(fā)明提供的一個實施例中，使用氫氧化鈉溶液條件所述反應(yīng)液的pH值，所述氫氧化鈉溶液的濃度優(yōu)選為35～40wt％。pH調(diào)節(jié)完畢后，將其與乙醇混合，得到待測樣品液。在本發(fā)明中，優(yōu)選先對完成pH調(diào)節(jié)的反應(yīng)液進(jìn)行減壓濃縮，之后再將其與乙醇混合，得到待測樣品液。在本發(fā)明中，優(yōu)選先將減壓濃縮的反應(yīng)液與部分乙醇混合，之后固液分離，液相再與余量的乙醇混合，得到待測樣品液。在本發(fā)明提供的一個實施例中，所述待測樣品液中的乙醇濃度為70～80vol％。在本發(fā)明提供的一個實施例中，所述內(nèi)容物與所述待測樣品液的質(zhì)量體積比優(yōu)選為(0.1～0.5)g：(50～200)mL，更優(yōu)選為0.25g：(50～200)mL，最優(yōu)選為：0.25g：100mL。得到所述待測樣品液后，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器對所述待測樣品液進(jìn)行檢測。檢測過程中，采用的流動相優(yōu)選為三乙胺溶液和乙腈；所述三乙胺溶液的濃度優(yōu)選為0.1～0.2vol％；所述三乙胺溶液和乙腈的體積比優(yōu)選為(10～30)：(90～70)，更優(yōu)選為20：80。檢測過程中，流動相流速優(yōu)選為0.8～1.2mL/min，更優(yōu)選為1mL/min。檢測過程中，色譜柱優(yōu)選為XBridgeAmide型色譜柱；所述色譜柱的填充劑優(yōu)選為以十八烷基硅烷鍵合硅膠；色譜柱的柱溫優(yōu)選為40～50℃，更優(yōu)選為45℃。檢測過程中，漂移管的溫度優(yōu)選為90～100℃，更優(yōu)選為95℃。檢測過程中，載氣的氣體流速優(yōu)選為2～3L/min。檢測過程中，理論塔板數(shù)按D-無水葡萄糖峰計算優(yōu)選不低于2000。檢測結(jié)束后，得到待測樣品液中D-無水葡萄糖的峰面積，根據(jù)所述待測樣品液中D-無水葡萄糖的峰面積與預(yù)先建立的D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測樣品液中D-無水葡萄糖的含量。本發(fā)明對所述D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方式?jīng)]有特別限定，可按照以下方式建立：首先，提供一系列D-無水葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液；然后，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器對所述一系列D-無水葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，得到D-無水葡萄糖每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖；最后，根據(jù)所述色譜圖與其對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，得到D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。在本發(fā)明提供的上述獲得D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法中，首先提供一系列不同濃度的D-無水葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液由D-無水葡萄糖與乙醇配制得到，所述乙醇的濃度優(yōu)選為70～80vol％。在本發(fā)明提供的一個實施例中，一系列不同濃度的所述D-無水葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為200～2100μg/mL；在本發(fā)明提供的另一個實施例中，一系列不同濃度的所述D-無水葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為201.8μg/mL、504.5μg/mL、807.2μg/mL、1109.9μg/mL、1412.6μg/mL、1715.3μg/mL和2018μg/mL。得到一系列D-無水葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器對所述一系列D-無水葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，得到每個濃度的D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。在本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測色譜條件與所述待測樣品液進(jìn)行檢測時的色譜條件一致，在此不再贅述。得到每個濃度的D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖后，本發(fā)明計算得到每個濃度的D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，根據(jù)得到的峰面積與其對應(yīng)的D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，得到D-無水葡萄糖濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于沉淀物中的糖類成分只有多糖，待測樣品液中的D-無水葡萄糖均由多糖水解而成，因此得到待測樣品液中D-無水葡萄糖含量后可根據(jù)其含量的大小直接反映出桂枝茯苓膠囊中多糖含量的高低，從而實現(xiàn)對桂枝茯苓膠囊中多糖含量的評價。本發(fā)明首先以水為溶劑在超聲條件下溶解桂枝茯苓膠囊的內(nèi)容物中單糖、二糖和β-環(huán)糊精；然后固液分離，得到含有多糖成分的沉淀物；之后將該沉淀物與硫酸混合反應(yīng)，使沉淀物中的多糖水解為D-無水葡萄糖；最后將反應(yīng)得到的反應(yīng)液制成待測樣品液，采用HPLC(高效液相色譜)-ELSD(蒸發(fā)光散射檢測)法對待測樣品液中的D-無水葡萄糖的含量進(jìn)行檢測。由于沉淀物中的糖類成分只有多糖，待測樣品液中的D-無水葡萄糖均由多糖水解而成，因此通過測定待測樣品液中D-無水葡萄糖含量的大小可直接反映出桂枝茯苓膠囊中多糖含量的高低，從而實現(xiàn)對桂枝茯苓膠囊中多糖含量的評價。采用這種方法評價桂枝茯苓膠囊中多糖含量具有較好的專屬性和較高的準(zhǔn)確性。對本發(fā)明提供的方法的專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率進(jìn)行評價，結(jié)果表明本發(fā)明提供的方法專屬性良好，精密度RSD≤1.16％，穩(wěn)定性RSD≤2.21％，重復(fù)性RSD為1.89％，平均回收率為100.11％、回收率RSD為1.39％，可用于評價桂枝茯苓膠囊中的多糖含量。為更清楚起見，下面通過以下實施例進(jìn)行詳細(xì)說明。在本發(fā)明中，下述實施例涉及使用以下儀器和試劑：1、儀器：MettlerAE240電子分析天平；SartoriusBP211D電子分析天平；KQ-250DB數(shù)控超聲清洗儀；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋；高效液相色譜-ELSD檢測器：(1)Agilent1100高效液相色譜儀，ELSD檢測器；(2)Agilent1200高效液相色譜儀，ELSD檢測器。2、試劑：桂枝茯苓膠囊(批號：140301、140701、140801、140901；江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司)；D-無水葡萄糖(中國食品藥品檢定研究院，批號：1110833-201205，供含量測定用)；乙腈(色譜純，上海星可生化有限公司)；超純水(自制)；其它試劑均為分析純。實施例1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線1、色譜條件色譜柱：XbridgeAmide(3.5μm，4.6×150mm)；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1vol％三乙胺溶液(體積比＝80:20)為流動相；色譜柱柱溫45℃；流動相流速1.0mL/min；ELSD：漂移管溫度95℃；載氣氣體流速2.0L/min；理論塔板數(shù)以D-無水葡萄糖計算應(yīng)不低于2000。2、建立D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線取D-無水葡萄糖適量，精密稱定，加80vol％乙醇制成201.8μg/mL、504.5μg/mL、807.2μg/mL、1109.9μg/mL、1412.6μg/mL、1715.3μg/mL、2018μg/mL的D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取上述溶液各10μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，進(jìn)行檢測，記錄色譜峰峰面積。每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測兩次，以進(jìn)樣量(μg/mL)對數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，兩次檢測的平均峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表1和圖1所示。表1是本發(fā)明提供的D-無水葡萄糖線性關(guān)系考察結(jié)果，圖1是本發(fā)明實施例1提供的D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1D-無水葡萄糖線性關(guān)系考察結(jié)果根據(jù)表1計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)為：Y＝1.8242X+1.5221；R2＝0.9998?？梢?，D-無水葡萄糖進(jìn)樣量在201.8～2018μg/mL之間呈良好線性關(guān)系。結(jié)果見表1及圖1。實施例2桂枝茯苓膠囊中多糖含量的評價1、待測樣品液的制備：取10粒桂枝茯苓膠囊(批號：140301)的內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，取約0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入純化水30mL。超聲處理(40KHz，250W)30分鐘，放冷，離心(11000r/min，15min)，棄去上清液，沉淀加純化水重新超聲處理30min，離心(11000r/min，15min)，將錐形瓶內(nèi)剩余樣品加入30mL純化水少量多次的轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心(11000r/min，15min)，離心后沉淀加3mol/mL硫酸20mL少量多次轉(zhuǎn)移至回流瓶內(nèi)，于沸水浴中回流3h，放冷，加35wt％氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至4.5～6.0，減壓濃縮，加乙醇溶解，使溶液乙醇濃度為70～80vol％，放冷，離心，溶液加80vol％乙醇定容至100mL，搖勻，得到桂枝茯苓膠囊的待測樣品液。2、D-無水葡萄糖含量的測定取按照上述方法制備的待測樣品液6份，分別精密吸取上述待測樣品液各5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜峰峰面積，根據(jù)所述峰面積與實施例1建立的D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到待測樣品液中D-無水葡萄糖的含量，結(jié)果如表2所示：表2D-無水葡萄糖的含量計算結(jié)果編號1(wt％)2(wt％)3(wt％)4(wt％)5(wt％)6(wt％)平均含量RSD(％)D-無水葡萄糖35.1935.9335.3336.6936.8136.3336.051.89通過表2可以看出，該方法重復(fù)性良好，待測樣品液中D-無水葡萄糖的平均含量為36.05wt％，RSD為1.89％。實施例3系統(tǒng)適用性試驗1、對照品溶液的制備取D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加80vol％乙醇制成每1mL含D-無水葡萄糖0.8mg的溶液，即得對照品溶液。2、供試品溶液的制備：按照實施例2中所述待測樣品液的制備方法制得供試品溶液。3、測定精密吸取對照品溶液5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，計算峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；精密吸取供試品溶液5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，計算待測組分的理論塔板數(shù)、分離度與拖尾因子。結(jié)果如表3所示：表3桂枝茯苓膠囊系統(tǒng)適應(yīng)性主要參數(shù)結(jié)果表在上述條件下，拖尾因子為0.92～0.95，D-無水葡萄糖的色譜系統(tǒng)峰面積重復(fù)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.53％，以D-無水葡萄糖峰計算理論板數(shù)大于2000，為確保定量分析的準(zhǔn)確，規(guī)定理論板數(shù)按D-無水葡萄糖峰計算不得低于2000。實施例4待測樣品液制備過程中條件參數(shù)的影響1、水提取次數(shù)的影響取10粒桂枝茯苓膠囊(批號：140301)的內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，取約0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入純化水30mL。超聲處理(40KHz，250W)30分鐘，放冷，離心(11000r/min，15min)，得到上清液(即一次提取液)和沉淀，沉淀加純化水重新超聲處理30min，離心(11000r/min，15min)，得到上清液(即二次提取液)和沉淀，將錐形瓶內(nèi)沉淀加入30mL純化水少量多次的轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心(11000r/min，15min)，得到上清液(即三次提取液)和沉淀。對一次提取液、二次提取液和三次提取液中的果糖、葡萄糖、蔗糖和β-環(huán)糊精含量進(jìn)行測定，結(jié)果如表4所示：表4提取次數(shù)考察結(jié)果提取次數(shù)果糖(wt％)葡萄糖(wt％)蔗糖(wt％)β-環(huán)糊精(wt％)第1次6.017.4316.437.68第2次0.570.871.063.16第3次無無無0.14實驗結(jié)果顯示：用水提取三次后基本上將單糖、二糖和環(huán)糊精去除干凈。2、硫酸濃度的影響取批號為140301的桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物，按照實施例2中待測樣品液的制備方法，分別選擇2mol/mL、3mol/mL、4mol/mL和5mol/mL的硫酸制備2份待測樣品液，標(biāo)記為①和②。分別精密吸取上述待測樣品液各5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜峰峰面積，根據(jù)所述峰面積與實施例1建立的D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到待測樣品液中D-無水葡萄糖的含量，結(jié)果如表5所示：表5不同濃度硫酸對D-無水葡萄糖含量測定的影響通過表5可以看出，不同的硫酸濃度對多糖水解有一定影響，3mol/mL為最佳濃度。3、不同pH值的影響取批號為140301的桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物，按照實施例2中待測樣品液的制備方法，在“加35wt％氫氧化鈉中和至PH為4.5～6”時，分別調(diào)至不同的PH值，通過回收率以考察不同pH值對D-無水葡萄糖含量檢測的影響；分別精密吸取上述待測樣品液各5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜峰峰面積，根據(jù)所述峰面積與實施例1建立的D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到待測樣品液中D-無水葡萄糖的含量，進(jìn)而計算出回收率，結(jié)果如表6所示。表6中，“稱樣量”是指制備供試品溶液時所稱取的桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物的量，“含量”是指稱取的內(nèi)容物中理論上含有的D-無水葡萄糖糖的量，“加入量”是指加入的D-無水葡萄糖對照品的量，“實測值”是指供試品溶液中測得的D-無水葡萄糖的量。表6不同pH對回收率的影響編號PH值稱樣量(mg)含量(mg)加入量(mg)實測值(mg)回收率(％)110.9125.848.9038.1176.4472.2824.11125.248.6738.0680.7384.2534.48125.648.8238.0881.0484.6144.89124.648.4338.1580.9585.2656.02125.648.8238.0280.8984.3565.59126.249.0538.1380.6582.89通過表6中的數(shù)據(jù)可以看出，強(qiáng)堿條件能破壞多糖的水解。4、不同回流時間的影響取批號為140301的桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物，按照實施例2中待測樣品液的制備方法，分別選擇2h、3h、4h、5h和6h的回流時間制備待測樣品液。分別精密吸取上述待測樣品液各5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜峰峰面積，根據(jù)所述峰面積與實施例1建立的D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到待測樣品液中D-無水葡萄糖的含量，結(jié)果如表7所示：表7不同回流時間考察試驗結(jié)果編號回流時間含量(wt％)12h36.5323h40.4934h39.6645h34.9656h32.93通過表5可以看出，不同的回流時間對多糖水解有一定影響，3h為最佳回流時間。實施例5專屬性試驗1、對照品溶液的制備：取D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加80vol％乙醇制成每1mL含D-無水葡萄糖0.8mg的溶液，即得對照品溶液。2、供試品溶液的制備：按照實施例2中所述待測樣品液的制備方法制得供試品溶液。3、陰性供試品溶液的制備除不加樣品外，按供試品溶液制備方法制得陰性供試品溶液。4、測定精密吸取對照品溶液5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示，圖2是本發(fā)明實施例5提供的D-無水葡萄糖含量測定專屬性試驗圖譜，圖2中1為陰性供試品、2為對照品、3為供試品。通過圖2可以看出，本發(fā)明提供的方法的專屬性良好。實施例6耐用性試驗1、不同流動相流速和色譜柱柱溫的影響取D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加80vol％乙醇制成每1mL含D-無水葡萄糖1000μg的溶液，即得對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件，分別在0.9mL/min、1.0mL/min和1.1mL/min的流動相流速條件下，以及43℃、45℃和47℃的流動相流速條件下進(jìn)行檢測，記錄色譜峰峰面積，結(jié)果如圖3所示，圖3是本發(fā)明實施例6提供的不同流速和柱溫的色譜圖，圖3中1為流速＝1.0mL/min、T＝47℃，2為流速＝1.0mL/min、T＝43℃，3為流速＝1.1mL/min、T＝45℃，4為流速＝1.0mL/min、T＝45℃，5為流速＝0.9mL/min，T＝45℃。通過圖3可以看出流動相流速和色譜柱柱溫對樣品的出峰時間和峰型有一定影響，其中流速為1.0mL/min，柱溫45℃時峰型較好。2、不同載氣流速、漂移管溫度、不同儀器及不同色譜柱的影響取D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加80vol％乙醇制成每1mL含D-無水葡萄糖1000μg的溶液，即得對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件，分別在2.0L/min、2.5L/min和3.0mL/min的載氣流速條件下，以及90℃、95℃和100℃的漂移管溫度條件下，以及同一型號不同編號色譜柱條件下進(jìn)行檢測，記錄色譜峰峰面積，結(jié)果如圖4所示，圖4是本發(fā)明實施例6提供的不同載氣流速、漂移管溫度和不同柱子的色譜圖，圖4中1為載氣流速2.0L/min、飄移管溫度95℃，2為載氣流速2.5L/min、飄移管溫度95℃，3為載氣流速3.0L/min、飄移管溫度95℃，4為載氣流速2.0L/min、漂移管溫度90℃，5為載氣流速2.0L/min、漂移管溫度100℃，6為載氣流速2.0L/min、漂移管溫度95℃，同一型號不同色譜柱子。通過圖4可以看出載氣流速、漂移管溫度、不同儀器及不同色譜柱對樣品的出峰時間和峰型影響不明顯。實施例7精密度試驗1、對照品溶液的制備：取D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加80vol％乙醇制成每1mL含D-無水葡萄糖0.5045mg、1.1099mg、1.7153mg的溶液，得低、中、高濃度對照品溶液。分別精密吸取上述低、中、高濃度對照品溶液各10μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，重復(fù)進(jìn)樣檢測6次，計算進(jìn)樣精密度，結(jié)果如表8所示：表8低、中、高濃度對照品精密度試驗結(jié)果通過表8可以看出，RSD分別為為1.16％、0.32％、0.30％。結(jié)果表明儀器精密度良好。實施例8穩(wěn)定性試驗1、對照品溶液的制備：取D-無水葡萄糖適量，精密稱定，加80vol％乙醇制成每1mL含D-無水葡萄糖0.8mg的溶液，即得對照品溶液。2、供試品溶液的制備：按照實施例2中所述待測樣品液的制備方法制得供試品溶液。3、測試取同一供試品溶液(批號：140301)，分別于第0h、2h、3h、5h、7h、9h、11h、13h、15h、17h、19h注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，每次進(jìn)樣5μL，記錄色譜峰峰面積，并計算RSD值；另取同一對照品溶液，分別于第0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、19h、21h注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，每次進(jìn)樣5μL，記錄色譜峰峰面積，并計算RSD值。結(jié)果見表9、10：表9供試品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果表10對照品溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果通過表9和10可以看出，供試品溶液的RSD為2.21％，對照品溶液的RSD為1.61。說明供試品溶液在19小時內(nèi)基本穩(wěn)定，對照品溶液在21h內(nèi)基本穩(wěn)定。實施例9回收率試驗取D-無水葡萄糖適量，精密稱定，加80vol％乙醇制成每1mL含D-無水葡萄糖0.8mg的對照品溶液。取已知含量的樣品(批號：140301，D-無水葡萄糖的含量為36.05wt％)約0.125g，精密稱定，平行稱取9份，3份一組，置具塞錐形瓶中，加入純化水30mL。超聲處理(40KHz，250W)30分鐘，放冷，離心(11000r/min，15min)，棄去上清液，沉淀加純化水重新超聲處理30min，離心(11000r/min，15min)，將錐形瓶內(nèi)剩余樣品加入30mL純化水少量多次的轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，離心(11000r/min，15min)，離心后沉淀加3mol/mL硫酸20mL少量多次轉(zhuǎn)移至回流瓶內(nèi)，各組分別加入D-無水葡萄糖對照品溶液，于沸水浴中回流3h，放冷，加35wt％氫氧化鈉中和(PH為4.5-6.0)，減壓回收至一定體積，加乙醇溶解，使溶液乙醇濃度為70～80vol％，放冷，離心，溶液加80vol％乙醇定容至100mL，搖勻，即得加標(biāo)待測樣。分別精密吸取上述加標(biāo)待測樣各5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜峰峰面積，根據(jù)所述峰面積與實施例1建立的D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到D-無水葡萄糖的含量，結(jié)果如表11所示。表11中，“稱樣量”是指制備供試品溶液時所稱取的桂枝茯苓膠囊內(nèi)容物的量，“含量”是指稱取的內(nèi)容物中理論上含有的D-無水葡萄糖糖的量，“加入量”是指加入的D-無水葡萄糖對照品的量，“測定值”是指供試品溶液中測得的D-無水葡萄糖的量，回收率＝({含量+加入量)/測定值}×100％。表11D-無水葡萄糖加樣回收率試驗結(jié)果通過表11可以看出，評價回收率為100.11％，RSD為1.39％，說明本發(fā)明提供的方法準(zhǔn)確性較高。實施例10桂枝茯苓膠囊中多糖含量的評價分別精密稱取0.25g三批(批號：140701、140801、140901)桂枝茯苓膠囊的內(nèi)容物，每批次樣品稱取兩份，標(biāo)記為①和②，按照實施例2中所述待測樣品液的制備方法制得待測樣品液。分別精密吸取上述待測樣品液各5μL，注入高效液相色譜-ELSD檢測器，按照實施例1中的色譜條件進(jìn)行檢測，記錄色譜峰峰面積，根據(jù)所述峰面積與實施例1建立的D-無水葡萄糖的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到D-無水葡萄糖的含量，結(jié)果如表12所示：表12不同批次樣品含量測定結(jié)果批號含量①含量②平均含量(％)RSD(％)14070139.3138.7639.030.9814080140.1438.8539.492.3214090138.6237.2737.952.52以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3