本發(fā)明屬于分析化學(xué)色譜法領(lǐng)域。具體是一種采用色譜法鑒定福建琯溪蜜柚的方法，本方法同時(shí)利用氣相色譜和液相色譜法對(duì)福建琯溪蜜柚中的化學(xué)組分進(jìn)行定性分析。

背景技術(shù)：

柚子(citrus junos tanaka)，又名文旦，是蕓香科柑橘亞科柚子屬植物，我國(guó)是世界上柚類種植面積最大，產(chǎn)量居第2位的生產(chǎn)大國(guó)。我國(guó)柚類品種資源豐富、品種(品系)繁多，目前主栽品種有蜜柚、琯溪蜜柚、玉環(huán)柚等，占全國(guó)柚子栽培面積的80％左右，種植面積均達(dá)0.37萬(wàn)公頃以上，年產(chǎn)量超過(guò)1.2萬(wàn)噸，主要分布于福建、浙江、臺(tái)灣、廣西、廣東等多個(gè)省份?，g溪蜜柚原產(chǎn)于福建省平和縣，已有500多年栽培歷史。1995年通過(guò)全國(guó)農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。2009年平和縣種植50多萬(wàn)公頃，年總產(chǎn)量達(dá)100多萬(wàn)噸，年創(chuàng)產(chǎn)值15億多元，成為福建省平和縣果業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)，也是果農(nóng)致富的重要途徑?，g溪蜜柚已先后注冊(cè)了“琯溪”商標(biāo)、“平和琯溪蜜柚”證明商標(biāo)，獲得了國(guó)家、“綠色食品”認(rèn)證和國(guó)家質(zhì)檢總局原產(chǎn)地標(biāo)志認(rèn)證，分別在美國(guó)、英國(guó)、法國(guó)等17個(gè)國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行商標(biāo)國(guó)際注冊(cè)，被推薦為與歐盟交換保護(hù)的十大地理標(biāo)志產(chǎn)品之一，被認(rèn)定為“中國(guó)名牌農(nóng)產(chǎn)品”，但是隨著柚子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值日益受到重視，假冒名優(yōu)品種柚子的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，品質(zhì)等級(jí)劃分和原產(chǎn)地的鑒定技術(shù)就顯得尤為重要。本發(fā)明同時(shí)利用氣相色譜和液相色譜技術(shù)手段對(duì)福建琯溪蜜柚的化學(xué)組分進(jìn)行定性分析，成功建立蜜柚特異性物質(zhì)色譜指紋圖譜。因此，建立一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速的色譜分析方法，對(duì)福建琯溪蜜柚子的原產(chǎn)地溯源和鑒定具有重要的意義。

針對(duì)柚子的鑒定技術(shù)，目前，頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,16(6):52)，感官評(píng)價(jià)和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(現(xiàn)代食品科技,2014,30(10):274)，化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試法(中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2010，5:35-36)，高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(色譜，2007，25(5):770-771)，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(色譜，2016，34(6):558-566)等方法已被用于柚子的定性分析。頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)簡(jiǎn)單快速，適合檢測(cè)柚子中的揮發(fā)性成分，但不合適柚子中的非揮發(fā)性成分檢測(cè)；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)高效準(zhǔn)確，適合柚子用的非揮發(fā)性成分檢測(cè)，但不適合揮發(fā)性成分的檢測(cè)。目前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)報(bào)道對(duì)蜜柚采用氣相色譜或液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)鑒定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有鑒定技術(shù)的不足，提供一種采用色譜法鑒定福建琯溪蜜柚的方法，對(duì)福建琯溪蜜柚中的化學(xué)組分定性鑒定。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：

一種采用色譜法鑒定福建琯溪蜜柚的方法，首先采用乙腈對(duì)蜜柚外表皮、內(nèi)表皮、內(nèi)果皮及果肉等各部位中的有機(jī)物進(jìn)行提取，然后同時(shí)采用氣相色譜儀、氫火焰離子檢測(cè)器和液相色譜-紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)福建琯溪蜜柚各部位中有機(jī)物進(jìn)行色譜定性分析，準(zhǔn)確地檢測(cè)出福建琯溪蜜柚中的蛇床子素、檸檬烯、α-亞油酸、棕櫚酸、谷甾醇、油酸酰胺和諾卡酮等特異性物質(zhì)，成功建立蜜柚特異性物質(zhì)色譜指紋圖譜：

1)采用氣相色譜儀、氫火焰離子檢測(cè)器鑒定福建琯溪蜜柚的方法，操作步驟如下：

1.1)氣相色譜儀的色譜柱初始溫度為室溫，升溫速率10℃/min升至溫度50～280℃，為滿足試樣中所有成分的峰完全分離，結(jié)合各物質(zhì)沸點(diǎn)，確定氣相色譜最優(yōu)分析條件如下：

氣相色譜分析儀分析條件

色譜柱：30m×0.25mm DB-17色譜柱；載氣：N₂；載氣流速：1mL/min；色譜柱溫度：120℃；進(jìn)樣量：1μL；氣化室溫度：260℃；檢測(cè)器溫度：280℃；檢測(cè)器為FID檢測(cè)器；

1.2)外標(biāo)物溶液的配制：根據(jù)外標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別稱取不同質(zhì)量的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮，分別用乙腈加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成濃度為1000mg/L外標(biāo)物溶液，并配成濃度為100mg/L的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮的混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)溶液；

1.3)檢測(cè)樣品的制備：準(zhǔn)確稱取5g樣品(鮮重)于100mL離心管中，加入25mL乙腈，渦旋2min，超聲30min，4500r/min離心3min，抽取上清液1.5mL，經(jīng)0.22μm微膜過(guò)濾，待測(cè)樣品的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮；

2)采用液相色譜-紫外檢測(cè)器鑒定福建琯溪蜜柚的方法，操作步驟如下：

2.1)液相色譜儀以254nm為紫外吸收波長(zhǎng)，梯度洗脫，為滿足試樣中所有成分的峰完全分離，結(jié)合各物質(zhì)極性，確定液相色譜最優(yōu)分析條件如下：

液相色譜分析儀分析條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB C18 250mm×4.6mm×5μm色譜柱；流動(dòng)相：A為水相，B為乙腈；洗脫流速：1mL/min；色譜柱溫度：30℃；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫程序：水A％:乙腈B％為70:30，洗脫0～15min、水A％:乙腈B％為40:60，洗脫15～20min、水A％:乙腈B％為40:60，洗脫20～40min、水A％:乙腈B％為20:80，洗脫40～45min、水A％:乙腈B％為20:80，洗脫45～65min、水A％:乙腈B％為70:30，洗脫65～70min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；

2.2)外標(biāo)物溶液的配制：根據(jù)外標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別稱取不同質(zhì)量的檸檬烯、谷甾醇和油酸酰胺，分別用乙腈溶解加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成濃度為1000mg/L外標(biāo)物溶液，并配成濃度為100mg/L的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮的混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)溶液；

2.3)檢測(cè)樣品的制備：準(zhǔn)確稱取5g鮮樣品于100mL離心管中，加入25mL乙腈，渦旋2min，超聲30min，4500r/min離心3min，抽取上清液1.5mL，經(jīng)0.22μm微膜過(guò)濾，待測(cè)樣品的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮。

本發(fā)明的氣相色譜儀為Agilent7890A氣相色譜儀，色譜柱為分離效能高、分離速度快的石英毛細(xì)柱，運(yùn)用氫火焰檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)樣品中的各組分與外標(biāo)物進(jìn)行一一對(duì)比，準(zhǔn)確的檢測(cè)出福建琯溪蜜柚中的化學(xué)組分。液相色譜儀為Water-e2695高效液相色譜儀，色譜柱為Zorbax Eclipse XDB C18反相柱，運(yùn)用紫外檢測(cè)器，對(duì)樣品中的各組分與外標(biāo)物進(jìn)行一一對(duì)比，準(zhǔn)確的檢測(cè)出福建琯溪蜜柚中的化學(xué)組分。

本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：

1.改變以往以感官評(píng)價(jià)的方法判斷柚子產(chǎn)地和品質(zhì)在技術(shù)上科學(xué)性的不足。

2.從色譜技術(shù)測(cè)定內(nèi)涵物差異性上對(duì)蜜柚的產(chǎn)地、品質(zhì)進(jìn)行鑒定，結(jié)果更客觀，更準(zhǔn)確更科學(xué)。

3.同時(shí)采用氣相色譜和液相色譜技術(shù)，既可以檢測(cè)出揮發(fā)性物質(zhì)，又可以檢測(cè)出極性物質(zhì)，結(jié)果更科學(xué)可靠。

4.在色譜柱不超載的范圍內(nèi)，定性結(jié)果與進(jìn)樣量重復(fù)性無(wú)關(guān)。

5.操作簡(jiǎn)單，定性準(zhǔn)確，檢測(cè)快速，適用于蜜柚及其它柚子中化學(xué)組分的定性分析。

附圖說(shuō)明

圖1為外標(biāo)物蛇床子素的氣相色譜圖。

圖2為外標(biāo)物諾卡酮的氣相色譜圖。

圖3為外標(biāo)物棕櫚酸的氣相色譜圖。

圖4為外標(biāo)物α-亞油酸的氣相色譜圖。

圖5混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物的氣相色譜圖。

圖6為外標(biāo)物谷甾醇的液相色譜圖。

圖7為外標(biāo)物油酸酰胺的液相色譜圖。

圖8為外標(biāo)物檸檬烯的液相色譜圖。

圖9混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物的液相色譜圖。

圖10為福建琯溪蜜柚外表皮樣品的氣相色譜圖。

圖11為福建琯溪蜜柚內(nèi)表皮樣品的氣相色譜圖。

圖12為福建琯溪蜜柚內(nèi)果皮樣品的氣相色譜圖。

圖13為福建琯溪蜜柚果肉樣品的氣相色譜圖。

圖14為福建琯溪蜜柚外表皮樣品的液相色譜圖。

圖15為福建琯溪蜜柚內(nèi)表皮樣品的液相色譜圖

圖16為福建琯溪蜜柚內(nèi)果皮樣品的液相色譜圖

圖17為福建琯溪蜜柚果肉樣品的液相色譜圖

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中應(yīng)用的儀器與試劑包括：

儀器與材料：Agilent 7890A氣相色譜儀，帶氫火焰離子檢測(cè)器(FID)；DB-17型石英毛細(xì)管色譜柱，30m×0.25mm；載氣為純度大于99.999％的氮?dú)猓細(xì)鉃榧兌却笥?9.999％的氫氣，助燃?xì)鉃?.5MPa的壓縮空氣；Water-e2695高效液相色譜儀，帶紫外檢測(cè)器和色譜工作站；Zorbax Eclipse XDB C18色譜柱，250mm×4.6mm×5μm。

試劑：乙腈(分析純、色譜純)、超純水。

外標(biāo)物：蛇床子素、檸檬烯、α-亞油酸、棕櫚酸、谷甾醇、油酸酰胺和諾卡酮。

樣品：福建琯溪蜜柚采自福建樟州平和縣文峰鎮(zhèn)柴船村坎下。

實(shí)施例1

采用氣相色譜儀、氫火焰離子檢測(cè)器鑒定福建琯溪蜜柚的方法，具體操作步驟如下：

1.氣相色譜儀的色譜柱初始溫度為室溫，升溫速率10℃/min升至溫度50～280℃，為滿足試樣中所有成分的峰完全分離，結(jié)合各物質(zhì)沸點(diǎn)，確定氣相色譜最優(yōu)分析條件如下：

氣相色譜分析儀分析條件

色譜柱：30m×0.25mm DB-17色譜柱；載氣：N₂；載氣流速：1mL/min；色譜柱溫度：120℃；進(jìn)樣量：1μL；氣化室溫度：260℃；檢測(cè)器溫度：280℃；檢測(cè)器為FID檢測(cè)器。

2.外標(biāo)物溶液的配制：根據(jù)外標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別稱取不同質(zhì)量的蛇床子素、α-亞油酸、棕櫚酸和諾卡酮，分別用乙腈溶解加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成1000mg/L外標(biāo)物溶液，并配成濃度為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物溶液。經(jīng)氣相色譜檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果如附圖1、圖2、圖3、圖4和圖5所示，圖1為蛇床子素氣相譜圖；圖2為諾卡酮?dú)庀嗌V圖；圖3為棕櫚酸氣相色譜圖；圖4為α-亞油酸氣相色譜圖；圖5為混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物氣相色譜圖。

3.樣品的制備：準(zhǔn)確稱取5g樣品(鮮重)于100mL離心管中，加入25mL乙腈，渦旋2min，超聲30min，4500r/min離心3min，抽取上清液1.5mL，經(jīng)0.22μm微膜過(guò)濾，經(jīng)氣相色譜檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果如附圖10、圖11、圖12和圖13所示，圖10為外表皮樣品譜圖；圖11為內(nèi)表皮樣品譜圖；圖12為內(nèi)果皮樣品譜圖；圖13為果肉樣品譜圖。

實(shí)施例2

采用液相色譜-紫外檢測(cè)器鑒定福建琯溪蜜柚的方法，具體操作步驟如下：

1.液相色譜儀以254nm為紫外吸收波長(zhǎng)，梯度洗脫，為滿足試樣中所有成分的峰完全分離，結(jié)合各物質(zhì)極性，確定液相色譜最優(yōu)分析條件如下：

液相色譜分析儀分析條件

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB C18 250mm×4.6mm×5μm色譜柱；流動(dòng)相：A為水相，B為乙腈；洗脫流速：1mL/min；色譜柱溫度：30℃；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫程序：水A％:乙腈B％為70:30，洗脫0～15min、水A％:乙腈B％為40:60，洗脫15～20min、水A％:乙腈B％為40:60，洗脫20～40min、水A％:乙腈B％為20:80，洗脫40～45min、水A％:乙腈B％為20:80，洗脫45～65min、水A％:乙腈B％為70:30，洗脫65～70min；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；

2.外標(biāo)物溶液的配制：根據(jù)外標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別稱取不同質(zhì)量的檸檬烯、谷甾醇和油酸酰胺，分別用乙腈溶解加入到10mL的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成1000mg/L外標(biāo)物溶液，并配成濃度為100mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)溶液。經(jīng)液相色譜檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果如附圖6、圖7、圖8和圖9所示，圖6為谷甾醇的液相色譜圖；圖7為油酸酰胺的液相色譜圖；圖8為檸檬烯的液相色譜圖；圖9為混合標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)物的液相色譜圖。

3.樣品的制備：準(zhǔn)確稱取5g樣品(鮮重)于100mL離心管中，加入25mL乙腈，渦旋2min，超聲30min，4500r/min離心3min，抽取上清液1.5mL，經(jīng)0.22μm微膜過(guò)濾，經(jīng)液相色譜檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果如附圖14、圖15、圖16和圖17所示，圖14為外表皮樣品的液相色譜圖；圖15為內(nèi)表皮樣品的液相色譜圖；圖16為內(nèi)果皮樣品的液相色譜圖；圖17為果肉樣品的液相色譜圖。