本發(fā)明涉及中藥檢測技術領域，具體涉及一種補脾益腎方的質量控制方法及其指紋圖譜。
背景技術：
慢性腎臟病chronickidneydisease(ckd)是指腎臟損傷或腎小球濾過率(gfr)<60ml/(min·1.73m2)持續(xù)3個月或以上；腎損傷的定義是指腎臟病理學異常或血液、尿液、影像學的檢查異常。ckd是各種原發(fā)和繼發(fā)腎臟病的總稱，為一組進行性發(fā)展的慢性非感染性疾病，在我國的患病率呈逐年上升趨勢，成為全世界國家必須面臨的嚴重挑戰(zhàn)。ckd從腎功能正常至腎功能衰竭的整個過程分為5期，相當于慢性腎炎與慢性腎衰2個階段，其中慢性腎臟病四期為符合慢性腎臟病的診斷。
補脾益腎方是廣東省中醫(yī)院腎內科劉旭生教授在本領域的研究基礎上，集成行業(yè)精華并進行多次論證與優(yōu)化后形成(一種治療慢性腎臟病的中藥制劑及其制備方法，專利公開號：cn102579894a)。該組方包括黃芪、生黨參、菟絲子等九味藥物，具有補脾益腎的功效，對慢性腎臟病療效顯著，臨床療效顯示該組方能延緩慢性腎臟病四期患者egfr的下降，延緩了本病的進展，優(yōu)于國際上運用的有效藥物acei。
中醫(yī)藥療效長期以來由于缺乏可靠的臨床研究證據(jù)支持，不能廣泛獲得國際社會的認同。應用國際上公認的評價干預措施效果的標準方案――隨機雙盲臨床研究試驗(randomizedcontrolledtrials,rtc)，把中醫(yī)藥治療的臨床經(jīng)驗以科學研究的證據(jù)形式呈現(xiàn)出來，是中醫(yī)藥與國際接軌的一個突破點。而中藥復方質量控制標準化是rtc質量控制的源頭。因此，中醫(yī)藥臨床療效欲被國際認可，首先應有標準化的中藥質量控制標準。
中藥復方具有的整體作用特點不能僅針對某幾個化學成分，因此應建立從整體上綜合反映中藥質量的方法，以指紋圖譜作為中成藥、草藥提取物這類含有混合物質群的質量控制方法，已經(jīng)成為目前國際共識。中藥指紋圖譜是對中藥及其復方物質基礎整體特征的一種量化表達和解析手段，是指某種中藥材或中成藥經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段提取其化學信息，得到能夠標志其特性的共有峰的圖譜。中藥及其復方內在質量的保證亦是中藥現(xiàn)代化基本的要求，中藥復方成分復雜，有效成分絕大多數(shù)沒有明確，亟需建立內在的中藥質量評估標準。補脾益腎方是包括黃芪、生黨參、菟絲子等九味藥物在內的中藥復方，臨床上用于治療慢性腎臟病，其療效已經(jīng)得到臨床的驗證，而是否能夠保證藥物的質量是決定補脾益腎方臨床療效的基礎。如果僅用一、兩種活性成分來說明組方的內在質量具有一定的片面性，且不能保證所選取指標成分是否具有活性。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是，為了克服現(xiàn)有技術中缺乏能控制補脾益腎方內在質量的質量控制方法，提供一種補脾益腎方的質量控制方法。該方法能夠同時測定補脾益腎方中黃芪、黨參、丹參、制何首烏、菟絲子等多味藥中多類活性成分的指紋圖譜測定方法，通過此測定方法，可控制補脾益腎方的內在質量。
本發(fā)明所要解決的上述技術問題，通過以下技術方案予以實現(xiàn)：
一種補脾益腎方的質量控制方法，包含如下步驟：
s1.制備補脾益腎方供試品溶液；
s2.吸取供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖；
s3.將步驟s2得到的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)；選擇不同批次補脾益腎方的色譜圖中均存在的色譜峰作為共有峰；用平均值計算法生成補脾益腎方的標準指紋圖譜；計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積；
s4.建立待檢測補脾益腎方的指紋圖譜；然后與步驟s3所述的標準指紋圖譜進行比較，最后判斷待檢測的補脾益腎方質量是否合格。
本發(fā)明發(fā)明人首先制備了補脾益腎方的干燥噴霧粉末，通過對組方的制備方法，色譜條件的選擇及色譜條件方法學研究，確立了補脾益腎方指紋圖譜。該指紋圖譜可滿足補脾益腎方九味藥中多類活性成分的同時檢測與分析，并將此指紋圖譜用于該組方的質量控制。
優(yōu)選地，步驟s1中所述的供試品溶液通過如下方法制備得到：
s11.取粉碎的黃芪、黨參、白術、茯苓、淮山、何首烏、菟絲子、薏苡仁以及丹參九味中藥，混合后加水，浸泡20～50min，煮沸后再煎煮0.5～3小時，過濾后，濾液，減壓回收，噴霧干燥，得干燥粉末；
s12.稱取補脾益腎方干燥粉末，溶于乙腈水溶液或甲醇水溶液，超聲溶解，定容于容量瓶，過濾膜，備用。
優(yōu)選地，步驟s11的具體操作為：取粉碎的黃芪25～33份、黨參15～20份、白術10～18份、茯苓15～20份、淮山13～20份、何首烏15～20份、菟絲子12～20份、薏苡仁15～25份、丹參10～20份，混合后加水，浸泡30min，煮沸后再煎煮2小時，過濾后，濾渣同法再煎煮一次，合并兩次濾液，減壓回收，噴霧干燥，得干燥粉末。
最優(yōu)選地，步驟s12的具體操作為：稱取補脾益腎方干燥粉末56mg，溶于2ml60％乙腈溶液，超聲溶解，定容于5ml容量瓶，過0.22μm濾膜，備用。
更優(yōu)選地，步驟s2中液相色譜儀的色譜條件為：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相a為0.1％-0.5％甲酸水溶液，流動相b為乙腈，采用梯度洗脫；柱溫為25～35℃；流速為200～400μl/min；進樣量為1～10μl。
更進一步優(yōu)選地，所述的梯度洗脫條件為：流動相a為0.1％甲酸水溶液，流動相b為乙腈；0分鐘時，88％流動相a，12％流動相b；22分鐘時，75％流動相a，25％流動相b；35分鐘時，65％流動相a，35％流動相b；45分鐘時，50％流動相a，50％流動相b；52分鐘時，45％流動相a，55％流動相b；流動相a及流動相b配制比例均按體積比配制。
最優(yōu)選地，柱溫為25℃；流速為250μl/min；進樣量為2μl；色譜柱選用kinetexc18分析柱，規(guī)格為2.1mm×100mm,1.7μm。
優(yōu)選地，在步驟s2所述的液相色譜儀后還連接有質譜儀，用于檢測共有峰的分子量；所述的質譜儀采用電噴霧離子源(esi)，鞘氣為45單位，輔助氣為6單位，噴霧電壓為-2.5～-3.5kv，毛細管溫度為300～375℃，樣品先采用高分辨進行全掃描，二級質譜采用動態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描，碰撞能量設為20～45％。
一種補脾益腎方的指紋圖譜，由上述建立方法建立得到，包含如下共有峰：
1號峰，平均保留時間rt為10.87min，rsd為2.31％，峰面積為6049.49，rsd為2.74％；
3號峰，平均保留時間rt為11.92min，rsd為1.43％，峰面積為15269.97，rsd為3.56％；
11號峰，平均保留時間rt為21.42min，rsd為1.17％，峰面積為14171.91，rsd為18.94％；
12號峰，平均保留時間rt為22.17min，rsd為1.17％，峰面積為8738.37，rsd為2.67％；
25號峰，平均保留時間rt為35.62min，rsd為1.91％，峰面積為9546.48，rsd為1.93％。
優(yōu)選地，所述的指紋圖譜，包含如下特征峰：
1號峰，平均保留時間rt為10.87min，rsd為2.31％，峰面積為6049.49，rsd為2.74％；
3號峰，平均保留時間rt為11.92min，rsd為1.43％，峰面積為15269.97，rsd為3.56％；
5號峰，平均保留時間rt為15.62min，rsd為1.48％，峰面積為5049.76，rsd為3.72％；
11號峰，平均保留時間rt為21.42min，rsd為1.17％，峰面積為14171.91，rsd為18.94％；
12號峰，平均保留時間rt為22.17min，rsd為1.17％，峰面積為8738.37，rsd為2.67％；
15號峰，平均保留時間rt為23.50min，rsd為1.15％，峰面積為3759.06，rsd為8.75％；
14號峰，平均保留時間rt為22.66min，rsd為3.39％，峰面積為3415.56，rsd為24.4％；
15號峰，平均保留時間rt為23.50min，rsd為1.15％，峰面積為3759.06，rsd為8.75％；
17號峰，平均保留時間rt為30.95min，rsd為1.63％，峰面積為4498.02，rsd為5.54％；
18號峰，平均保留時間rt為31.85min，rsd為1.89％，峰面積為4870.13，rsd為2.16％；
21號峰，平均保留時間rt為34.14min，rsd為1.90％，峰面積為4582.24，rsd為17.46％；
23號峰，平均保留時間rt為35.08min，rsd為1.94％，峰面積為3040.11，rsd為8.13％；
25號峰，平均保留時間rt為35.62min，rsd為1.91％，峰面積為9546.48，rsd為1.93％；
27號峰，平均保留時間rt為41.28min，rsd為2.03％，峰面積為5646.33，rsd為2.16％；
28號峰，平均保留時間rt為43.07min，rsd為2.23％，峰面積為3629.00，rsd為13.16％。
最優(yōu)選地，所述的指紋圖譜，包含如下特征峰：
1號峰，平均保留時間rt為10.87min，rsd為2.31％，峰面積為6049.49，rsd為2.74％；
2號峰，平均保留時間rt為11.28min，rsd為0.52％，峰面積為1095.05，rsd為3.49％；
3號峰，平均保留時間rt為11.92min，rsd為1.43％，峰面積為15269.97，rsd為3.56％；
4號峰，平均保留時間rt為15.17min，rsd為2.80％，峰面積為1158.83，rsd為15.83％；
5號峰，平均保留時間rt為15.62min，rsd為1.48％，峰面積為5049.76，rsd為3.72％；
6號峰，平均保留時間rt為16.28min，rsd為2.11％，峰面積為582.55，rsd為16.58％；
7號峰，平均保留時間rt為17.09min，rsd為3.44％，峰面積為1532.83，rsd為18.40％；
8號峰，平均保留時間rt為18.72min，rsd為3.12％，峰面積為2777.4，rsd為3.27％；
9號峰，平均保留時間rt為19.45min，rsd為3.32％，峰面積為941.96，rsd為17.72％；
10號峰，平均保留時間rt為20.99min，rsd為1.35％，峰面積為2708.15，rsd為1.38％；
11號峰，平均保留時間rt為21.42min，rsd為1.17％，峰面積為14171.91，rsd為18.94％；
12號峰，平均保留時間rt為22.17min，rsd為1.17％，峰面積為8738.37，rsd為2.67％；
13號峰，平均保留時間rt為22.81min，rsd為1.04％，峰面積為1122.84，rsd為18.86％；
14號峰，平均保留時間rt為22.66min，rsd為3.39％，峰面積為3415.56，rsd為24.4％；
15號峰，平均保留時間rt為23.50min，rsd為1.15％，峰面積為3759.06，rsd為8.75％；
16號峰，平均保留時間rt為25.13，rsd為1.56％，峰面積為2253.63，rsd為16.97％；
17號峰，平均保留時間rt為30.95min，rsd為1.63％，峰面積為4498.02，rsd為5.54％；
18號峰，平均保留時間rt為31.85min，rsd為1.89％，峰面積為4870.13，rsd為2.16％；
19號峰，平均保留時間rt為32.82min，rsd為1.88％，峰面積為1216.68，rsd為13.19％；
20號峰，平均保留時間rt為33.96min，rsd為1.89％，峰面積為1549.99，rsd為10.15％；
21號峰，平均保留時間rt為34.14min，rsd為1.90％，峰面積為4582.24，rsd為17.46％；
22號峰，平均保留時間rt為34.48min，rsd為1.96％，峰面積為1521.18，rsd為3.76％；
23號峰，平均保留時間rt為35.08min，rsd為1.94％，峰面積為3040.11，rsd為8.13％；
24號峰，平均保留時間rt為35.35min，rsd為1.90％，峰面積為2944.64，rsd為2.12％；
25號峰，平均保留時間rt為35.62min，rsd為1.91％，峰面積為9546.48，rsd為1.93％；
26號峰，平均保留時間rt為37.11，rsd為1.67％，峰面積為718.58，rsd為8.92％；
27號峰，平均保留時間rt為41.28min，rsd為2.03％，峰面積為5646.33，rsd為2.16％；
28號峰，平均保留時間rt為43.07min，rsd為2.23％，峰面積為3629.00，rsd為13.16％；
29號峰，平均保留時間rt為43.30min，rsd為1.96％，峰面積為2900.10，rsd為5.12％。
有益效果：(1)本發(fā)明以補脾益腎方中主要成分為指標建立色譜指紋圖譜，實現(xiàn)其最大可能的化學成分檢測，避免了常規(guī)的只測定一、兩個化學成分而判定補脾益腎方質量的片面性。該色譜指紋圖譜代表了補脾益腎方大部分藥理活性，能有效表征補脾益腎組方的質量，有利于對中藥復方質量的全面控制。(2)本發(fā)明提供一種補脾益腎組方的檢測方法，實驗切實可行，具有重復性。方法穩(wěn)定、簡便、精密度高、易于掌握。可同時適用于補脾益腎方提取液的指紋圖譜測定及補脾益腎方制劑的指紋圖譜測定。
附圖說明
圖1為本發(fā)明所述的補脾益腎方指紋圖譜。
具體實施方式
以下結合具體實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例對本發(fā)明不做任何形式的限定。
實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。其中，所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產品。
實施例1
一種補脾益腎方的質量控制方法，包含如下步驟：
s1.制備補脾益腎方供試品溶液；
s2.吸取供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖；
s3.將步驟s2得到的色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)；選擇不同批次補脾益腎方的色譜圖中均存在的色譜峰作為共有峰；用平均值計算法生成補脾益腎方的標準指紋圖譜；計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積；
s4.建立待檢測補脾益腎方的指紋圖譜；然后與步驟s3所述的標準指紋圖譜進行比較，最后判斷待檢測的補脾益腎方質量是否合格；
步驟s1中所述的供試品溶液通過如下方法制備得到：
取粉碎的黃芪28份、黨參20份、白術15份、茯苓18份、淮山15份、何首烏18份、菟絲子15份、薏苡仁22份、丹參18份，混合后加水，浸泡30min，煮沸后再煎煮2小時，過濾后，濾渣同法再煎煮一次，合并兩次濾液，減壓回收，噴霧干燥，得干燥粉末；
s12.稱取補脾益腎方干燥粉末56mg，溶于2ml60％乙腈溶液，超聲溶解，定容于5ml容量瓶，過0.22μm濾膜，備用；
步驟s2中液相色譜儀的色譜條件為：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相a為0.1％甲酸水溶液，流動相b為乙腈，采用梯度洗脫；柱溫為25℃；流速為250μl/min；進樣量為2μl；色譜柱選用kinetexc18分析柱，規(guī)格為2.1mm×100mm,1.7μm；
所述的梯度洗脫條件為：流動相a為0.1％甲酸水溶液，流動相b為乙腈；0分鐘時，88％流動相a，12％流動相b；22分鐘時，75％流動相a，25％流動相b；35分鐘時，65％流動相a，35％流動相b；45分鐘時，50％流動相a，50％流動相b；52分鐘時，45％流動相a，55％流動相b；流動相a及流動相b配制比例均按體積比配制。
通過本實施例所述方法獲得的指紋圖譜，對共計10批的補脾益腎方進行指紋圖譜分析，其相似度均在90％以上。其中單峰相對響應值超過2％的共有峰有29個，分別為：
1號峰，平均保留時間rt為10.87min，rsd為2.31％，峰面積為6049.49，rsd為2.74％；
2號峰，平均保留時間rt為11.28min，rsd為0.52％，峰面積為1095.05，rsd為3.49％；
3號峰，平均保留時間rt為11.92min，rsd為1.43％，峰面積為15269.97，rsd為3.56％；
4號峰，平均保留時間rt為15.17min，rsd為2.80％，峰面積為1158.83，rsd為15.83％；
5號峰，平均保留時間rt為15.62min，rsd為1.48％，峰面積為5049.76，rsd為3.72％；
6號峰，平均保留時間rt為16.28min，rsd為2.11％，峰面積為582.55，rsd為16.58％；
7號峰，平均保留時間rt為17.09min，rsd為3.44％，峰面積為1532.83，rsd為18.40％；
8號峰，平均保留時間rt為18.72min，rsd為3.12％，峰面積為2777.4，rsd為3.27％；
9號峰，平均保留時間rt為19.45min，rsd為3.32％，峰面積為941.96，rsd為17.72％；
10號峰，平均保留時間rt為20.99min，rsd為1.35％，峰面積為2708.15，rsd為1.38％；
11號峰，平均保留時間rt為21.42min，rsd為1.17％，峰面積為14171.91，rsd為18.94％；
12號峰，平均保留時間rt為22.17min，rsd為1.17％，峰面積為8738.37，rsd為2.67％；
13號峰，平均保留時間rt為22.81min，rsd為1.04％，峰面積為1122.84，rsd為18.86％；
14號峰，平均保留時間rt為22.66min，rsd為3.39％，峰面積為3415.56，rsd為24.4％；
15號峰，平均保留時間rt為23.50min，rsd為1.15％，峰面積為3759.06，rsd為8.75％；
16號峰，平均保留時間rt為25.13，rsd為1.56％，峰面積為2253.63，rsd為16.97％；
17號峰，平均保留時間rt為30.95min，rsd為1.63％，峰面積為4498.02，rsd為5.54％；
18號峰，平均保留時間rt為31.85min，rsd為1.89％，峰面積為4870.13，rsd為2.16％；
19號峰，平均保留時間rt為32.82min，rsd為1.88％，峰面積為1216.68，rsd為13.19％；
20號峰，平均保留時間rt為33.96min，rsd為1.89％，峰面積為1549.99，rsd為10.15％；
21號峰，平均保留時間rt為34.14min，rsd為1.90％，峰面積為4582.24，rsd為17.46％；
22號峰，平均保留時間rt為34.48min，rsd為1.96％，峰面積為1521.18，rsd為3.76％；
23號峰，平均保留時間rt為35.08min，rsd為1.94％，峰面積為3040.11，rsd為8.13％；
24號峰，平均保留時間rt為35.35min，rsd為1.90％，峰面積為2944.64，rsd為2.12％；
25號峰，平均保留時間rt為35.62min，rsd為1.91％，峰面積為9546.48，rsd為1.93％；
26號峰，平均保留時間rt為37.11，rsd為1.67％，峰面積為718.58，rsd為8.92％；
27號峰，平均保留時間rt為41.28min，rsd為2.03％，峰面積為5646.33，rsd為2.16％；
28號峰，平均保留時間rt為43.07min，rsd為2.23％，峰面積為3629.00，rsd為13.16％；
29號峰，平均保留時間rt為43.30min，rsd為1.96％，峰面積為2900.10，rsd為5.12％.
其中單峰相對響應值超過10％的共有峰有15個，分別為：
1號峰，平均保留時間rt為10.87min，rsd為2.31％，峰面積為6049.49，rsd為2.74％；
3號峰，平均保留時間rt為11.92min，rsd為1.43％，峰面積為15269.97，rsd為3.56％；
5號峰，平均保留時間rt為15.62min，rsd為1.48％，峰面積為5049.76，rsd為3.72％；
11號峰，平均保留時間rt為21.42min，rsd為1.17％，峰面積為14171.91，rsd為18.94％；
12號峰，平均保留時間rt為22.17min，rsd為1.17％，峰面積為8738.37，rsd為2.67％；
15號峰，平均保留時間rt為23.50min，rsd為1.15％，峰面積為3759.06，rsd為8.75％；
14號峰，平均保留時間rt為22.66min，rsd為3.39％，峰面積為3415.56，rsd為24.4％；
15號峰，平均保留時間rt為23.50min，rsd為1.15％，峰面積為3759.06，rsd為8.75％；
17號峰，平均保留時間rt為30.95min，rsd為1.63％，峰面積為4498.02，rsd為5.54％；
18號峰，平均保留時間rt為31.85min，rsd為1.89％，峰面積為4870.13，rsd為2.16％；
21號峰，平均保留時間rt為34.14min，rsd為1.90％，峰面積為4582.24，rsd為17.46％；
23號峰，平均保留時間rt為35.08min，rsd為1.94％，峰面積為3040.11，rsd為8.13％；
25號峰，平均保留時間rt為35.62min，rsd為1.91％，峰面積為9546.48，rsd為1.93％；
27號峰，平均保留時間rt為41.28min，rsd為2.03％，峰面積為5646.33，rsd為2.16％；
28號峰，平均保留時間rt為43.07min，rsd為2.23％，峰面積為3629.00，rsd為13.16％；
其中單峰相對響應值超過20％的共有峰有5個，分別為：
1號峰，平均保留時間rt為10.87min，rsd為2.31％，峰面積為6049.49，rsd為2.74％；
3號峰，平均保留時間rt為11.92min，rsd為1.43％，峰面積為15269.97，rsd為3.56％；
11號峰，平均保留時間rt為21.42min，rsd為1.17％，峰面積為14171.91，rsd為18.94％；
12號峰，平均保留時間rt為22.17min，rsd為1.17％，峰面積為8738.37，rsd為2.67％；
25號峰，平均保留時間rt為35.62min，rsd為1.91％，峰面積為9546.48，rsd為1.93％；
實施例2
進一步地，在實施例1步驟s2所述的液相色譜儀后還連接有質譜儀，用于檢測共有峰的分子量；所述的質譜儀采用電噴霧離子源(esi)，鞘氣為45單位，輔助氣為6單位，噴霧電壓為-2.5～-3.5kv，毛細管溫度為300～375℃，樣品先采用高分辨進行全掃描，二級質譜采用動態(tài)數(shù)據(jù)依賴性掃描，碰撞能量設為20～45％。
進一步地，在實施例1的基礎上還采用毛蕊異黃酮-7-o-β-d-葡萄糖苷，芒柄花苷，毛蕊異黃酮，二苯乙烯苷，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸a，丹酚酸b，紫云英苷，黨參炔苷，芒柄花素，黃芪甲苷，黃芪皂苷i，黃芪皂苷ii等為參照物，精密稱定適量，用20％乙腈溶解，制成標準品溶液，hplc進樣分析(參照實施例1的hplc條件)，根據(jù)保留時間及紫外特征吸收，對共有峰進行歸屬。
本實施例通過對共有峰進行分子量檢測以及歸屬，可以通過指紋圖譜進一步判定待檢測的補脾益腎方質量是否合格。
補脾益腎方中各共有峰的歸屬見表1，共有峰的指紋圖譜保留時間、峰面積的平均值、rsd值以及各共有峰的分子量見表2。
表1.補脾益腎方中各共有峰的歸屬表
表2.共有峰的指紋圖譜保留時間、峰面積的平均值、rsd值以及分子量表