本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體說是涉及一種判別煙草代謝組學(xué)研究所用的新鮮煙葉樣品質(zhì)量是否滿足代謝組學(xué)研究需要的判別方法。
背景技術(shù)：
：植物代謝組學(xué)是通過考察植物受刺激或擾動(dòng)后期代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來研究植物體的一種技術(shù)。在代謝組學(xué)輪廓分析的流程中，典型樣品的采集是首要并且極其重要的步驟，獲得合格樣品，以真實(shí)客觀的反映樣品的代謝狀態(tài)，是代謝組學(xué)分析進(jìn)行的基礎(chǔ)和前提。新鮮煙葉樣品的采集，需要在低溫下淬滅以停止其生理活動(dòng)以保證其停止在采樣時(shí)的代謝狀態(tài)，標(biāo)準(zhǔn)做法為采摘植物樣品后，錫紙包裹，置于-196℃液氮冷凍，用于新鮮煙葉樣品分析或者凍干后干粉樣品分析。在樣品采摘到分析前的這一段過程，需保證新鮮煙葉樣品在液氮中保存且在液氮條件下研磨，否則會(huì)造成煙葉的酶促褐變。由于煙葉樣品保存不當(dāng)而導(dǎo)致的質(zhì)量發(fā)生變化，代謝物水平不能反映煙葉樣品真實(shí)狀態(tài)的情況時(shí)有發(fā)生。急需一種簡單、快速的分析方法對植物代謝組學(xué)研究中的煙葉樣品質(zhì)量進(jìn)行判別。煙葉萜類化合物與煙葉香氣品質(zhì)密切相關(guān)，它們不但是煙葉重要的香氣前提物質(zhì)，而且它們的降解產(chǎn)物是煙葉最重要的香氣來源之一。同時(shí)，萜類代謝是煙葉的重要次生代謝途徑之一，揮發(fā)性萜類化合物在植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)、植物與植物之間的相互競爭和協(xié)同進(jìn)化、植物對昆蟲的危害、草食性動(dòng)物的采食及病原微生物的侵襲等過程的防御中起著重要作用。近年來有關(guān)煙葉中萜類化合物的分離、鑒定及檢測取得了一定進(jìn)展，但未曾有人提出將新鮮煙葉中的萜類化合物含量或含量比值用于代謝組學(xué)新鮮煙葉樣品質(zhì)量的判別。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種基于萜類的煙草代謝組學(xué)中新鮮煙葉樣品質(zhì)量的判別方法。本發(fā)明利用新鮮煙葉中植醇和角鯊烯含量的比值對代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量進(jìn)行判別，該法操作簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明的基于萜類的煙草代謝組學(xué)中新鮮煙葉樣品質(zhì)量的判別方法通過檢測新鮮煙葉中植醇和角鯊烯含量，計(jì)算其比值，采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜GC-MS對代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品中植醇和角鯊烯進(jìn)行絕對定量分析；具體制備方法如下：a、稱取10~25mg的凍干研磨煙葉樣品，加入提取溶劑正己烷0.75~1.5mL，室溫下超聲提取30min，離心，將上清液轉(zhuǎn)移到樣品瓶中，并用氮?dú)獯蹈桑惶崛『蟮臍堅(jiān)尤?.6~1.2mL由甲醇和氫氧化鉀溶液按4:1的體積比組成的混合液，70℃下振蕩提取30min，離心，將上清液轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中；加入0.5~1.0mL正己烷，進(jìn)行萃??；渦旋6s，離心1min；之后轉(zhuǎn)移到上述樣品瓶中，并用氮?dú)獯蹈?；衍生化：加?0~100μL20mg/mL甲氧胺鹽酸鹽-吡啶溶液，40~60℃反應(yīng)60~90分鐘，再加入50~100μLN-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液，在40~60℃條件下反應(yīng)30~90分鐘，進(jìn)GC/MS分析，采用保留時(shí)間和選擇離子（SIM）模式定性，檢測萜類物質(zhì)的含量；b、GC/MS分析方法的氣相色譜參數(shù)：色譜柱：DB-35MS(30m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)；程序升溫：起始溫度60℃（3min），25℃/min的速度升至210℃，0.8℃/min的速度升至220℃，15℃/min的速度升至310℃（13min）。載氣：氦氣；柱流速：1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量2μL，分流進(jìn)樣，分流比10:1；c、GC/MS分析方法的質(zhì)譜參數(shù)：電離電壓：70ev；離子源溫度：250℃；傳輸線溫度：280℃；定量離子對如下：法尼醇（135>107），葉綠醇（123>87），氘代十八烷酸（IS）（376>136），α-西柏三烯二醇（156>141），β-西柏三烯二醇（156>141），角鯊烯（149>107），環(huán)氧化鯊烯（135>107），膽固醇（329>121），菜油甾醇（255>173），豆甾醇（255>173），谷甾醇（396>255），香樹脂醇（218>203）。本發(fā)明中所述凍干研磨煙葉樣品為由大田采摘的新鮮煙葉樣品置于-196℃液氮罐保存運(yùn)輸，液氮冷凍研磨，低溫凍干，-80℃冰箱保存待用的煙葉末。本發(fā)明中所述提取溶劑中添加有5~20μL2mg/mL內(nèi)標(biāo)氘代十八烷酸。本發(fā)明中所述采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜GC-MS對新鮮煙葉樣品中植醇和角鯊烯進(jìn)行絕對定量分析的分析步驟如下：GC-MS分析數(shù)據(jù)可定性新鮮煙葉中的植醇和角鯊烯，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可對所測得的植醇和角鯊烯進(jìn)行絕對定量，將植醇和角鯊烯含量的比值作為區(qū)分代謝組學(xué)合格樣品及變質(zhì)的不合格樣品的標(biāo)準(zhǔn)，即待測樣品中植醇和角鯊烯含量的比值在120以上的為合格樣品，可用于代謝組學(xué)分析，植醇和角鯊烯含量的比值在120以下的為變質(zhì)的不合格樣品，不可用于代謝組學(xué)分析。本發(fā)明經(jīng)過大量新鮮煙葉樣品的分析研究，發(fā)現(xiàn)新鮮煙葉樣品如果保存不當(dāng)，其萜類化合物含量會(huì)發(fā)生變化，植醇和角鯊烯含量的比值也會(huì)明顯降低，此類樣品將不能用于代謝組學(xué)分析。因此可以以植醇和角鯊烯含量的比值作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對代謝組學(xué)研究中的新鮮煙葉樣品質(zhì)量進(jìn)行判別。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明利用新鮮煙葉樣品中植醇和角鯊烯含量的比值和樣品質(zhì)量的相關(guān)性，對代謝組學(xué)新鮮煙葉樣品質(zhì)量進(jìn)行判別，相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下特點(diǎn)：1）操作簡單快速；2）結(jié)果準(zhǔn)確可靠；3）樣品用量少，可為煙葉代謝特征分析及相關(guān)煙葉代謝組學(xué)研究提供借鑒。具體實(shí)施方式本發(fā)明以下將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步描述：本發(fā)明中所述采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜GC-MS對新鮮煙葉樣品中植醇和角鯊烯進(jìn)行絕對定量分析的分析步驟如下：GC-MS分析數(shù)據(jù)可定性新鮮煙葉中的植醇和角鯊烯，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可對所測得的植醇和角鯊烯進(jìn)行絕對定量，將植醇和角鯊烯含量的比值作為區(qū)分代謝組學(xué)合格樣品及變質(zhì)的不合格樣品的標(biāo)準(zhǔn)，即待測樣品中植醇和角鯊烯含量的比值在120以上的為合格樣品，可用于代謝組學(xué)分析，植醇和角鯊烯含量的比值在120以下的為變質(zhì)的不合格樣品，不可用于代謝組學(xué)分析。以下不再贅述。實(shí)施例1采用GC-MS方法測定新鮮煙葉樣品中的萜類化合物含量，發(fā)現(xiàn)褐化樣品的植醇和角鯊烯含量比值明顯降低。待測樣品包括福建、貴州、湖南、河南、云南等省份的6個(gè)品種、17個(gè)產(chǎn)地的新鮮煙葉樣品97份（每個(gè)點(diǎn)有5~6個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。其中包括81份合格樣品（樣品在采集、運(yùn)送及預(yù)處理過程中均嚴(yán)格控制在-80℃），16份褐變樣品（由于儲(chǔ)運(yùn)過程中液氮不足等原因已完全褐變）。樣品分析步驟如下所述：1）由大田采摘的新鮮煙葉樣品，于-196℃液氮罐保存運(yùn)輸，液氮冷凍研磨，低溫凍干，-80℃冰箱保存待后續(xù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析；稱取20~25mg凍干研磨煙葉樣品，加入提取溶劑正己烷1.5mL（含20μL的2mg/mL氘代十八烷酸），室溫下超聲提取30min，離心，將上清液轉(zhuǎn)移到樣品瓶中，并用氮?dú)獯蹈?；提取后的殘?jiān)尤?.2mL由甲醇和氫氧化鉀溶液按4:1的體積比組成的混合液，70℃下振蕩提取30min，離心，將上清液轉(zhuǎn)移到Eppendorf管中，加入1mL正己烷，進(jìn)行萃?。粶u旋6s，離心1min后轉(zhuǎn)移到上述樣品瓶中，并用氮?dú)獯蹈?；衍生化：加?0~100μL20mg/mL甲氧胺鹽酸鹽-吡啶溶液，40~60℃反應(yīng)60分鐘以上，再加入50~100μLN-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺溶液，40~60℃反應(yīng)30分鐘以上，進(jìn)GC/MS分析，采用保留時(shí)間和選擇離子（SIM）模式定性，檢測萜類物質(zhì)的含量；2）GC/MS分析方法的氣相色譜參數(shù)：色譜柱：DB-35MS(30m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)；程序升溫：起始溫度60℃（3min），25℃/min的速度升至210℃，0.8℃/min的速度升至220℃，15℃/min的速度升至310℃（13min）。載氣：氦氣；柱流速：1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量2μL，分流進(jìn)樣，分流比10:1。3）GC/MS分析方法的質(zhì)譜參數(shù)：電離電壓：70ev；離子源溫度：250℃；傳輸線溫度：280℃；定量離子對如下：法尼醇（135>107），葉綠醇（123>87），氘代十八烷酸（IS）（376>136），α-西柏三烯二醇（156>141），β-西柏三烯二醇（156>141），角鯊烯（149>107），環(huán)氧化鯊烯（135>107），膽固醇（329>121），菜油甾醇（255>173），豆甾醇（255>173），谷甾醇（396>255），香樹脂醇（218>203）。繪制了植醇（0.12-29.6μg/mL）與角鯊烯（0.31-12.32μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積（氘代十八烷酸）的比值為縱坐標(biāo)Y，質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)，測定結(jié)果如下：Y（植醇）=231.8X，Y（角鯊烯）=860.4X-323.5，相關(guān)系數(shù)分別為0.995和0.999。在上述條件下獲得了97份新鮮煙葉中植醇等11種萜類化合物的絕對含量，發(fā)現(xiàn)植醇與角鯊烯含量的比值變化顯著，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。表1實(shí)施例1中煙葉樣品信息及植醇與角鯊烯含量的比值樣品編號產(chǎn)地品種重復(fù)數(shù)植醇/角鯊烯是否合格C23Y貴州畢節(jié)云97652.2-99.1不合格C01K云南昆明K3265397.9-635.8合格C02K云南玉溪K3266200.3-263.5合格C03C云南曲靖云876250.5-367.4合格C04Y云南紅河云976149.1-267.7合格C05Y云南普洱云876176.2-576.6合格C06Y云南大理云875282.1-399.6合格C09Y貴州黔西南云976246.8-444.5合格C12C河南平頂山中煙1006279.3-481.8合格C13C河南南陽中煙1005151.9-352.7合格C14C河南駐馬店中煙1006179.3-375.6合格C15K廣東韶關(guān)K3266280.3-385.7合格C17K湖南郴州K3266165.4-338.8合格C25N貴州銅仁南江3號6174.1-242.5合格C26Y湖北恩施云876145.2-190.2合格C29K湖南張家界K326541.7-116.8不合格C24B貴州黔南貴煙2號597.9-112.6不合格經(jīng)過以上實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)褐化樣品中的植醇與角鯊烯含量的比值顯著降低。本發(fā)明將植醇與角鯊烯含量的比值作為區(qū)分代謝組學(xué)正常樣品與變質(zhì)樣品的標(biāo)準(zhǔn)。即待測樣品中植醇與角鯊烯含量的比值在120以上的為正常樣品，可用于代謝組學(xué)分析，植醇與角鯊烯含量的比值在120以下的為變質(zhì)樣品，不可用于代謝組學(xué)分析。當(dāng)前第1頁1 2 3