本發(fā)明涉及一種標(biāo)記物，所述標(biāo)記物用于診斷何首烏所致肝損傷。

背景技術(shù)：

何首烏所致的肝損傷是服用何首烏所導(dǎo)致肝臟的疾病，主要癥狀有黃疸、尿黃、乏力、厭食、腹痛等，嚴(yán)重者導(dǎo)致肝衰竭甚至死亡。目前“首烏肝”臨床診斷以檢測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)等生化指標(biāo)和肝組織病理切片為主。但生化指標(biāo)缺少靈敏度和專屬性，肝病理切片則是終端檢測(cè)不足以跟蹤監(jiān)控病情。由于“首烏肝”缺少有效的診斷標(biāo)記物，醫(yī)師主要依據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)加以診治，這增加了治療周期和風(fēng)險(xiǎn)甚至貽誤病情。

膽汁酸是構(gòu)成膽汁的主要成分，是一類膽烷酸物質(zhì)的總稱。膽汁酸在肝臟中由膽固醇經(jīng)過相關(guān)酶轉(zhuǎn)化而成，以鈉鹽或鉀鹽兩種形式存在于人體內(nèi)。膽汁酸可根據(jù)結(jié)構(gòu)劃分為游離型膽汁酸和結(jié)合型膽汁酸，游離型膽汁酸包括膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸和少量的石膽酸；結(jié)合型膽汁酸是游離型膽汁酸與甘氨酸和?；撬峤Y(jié)合而產(chǎn)生，一般結(jié)合型膽汁酸水溶性較游離型大，使得膽汁酸鹽更穩(wěn)定，防止膽汁酸從膽道和小腸吸收。膽汁酸從來源上分類可分為初級(jí)膽汁酸、次級(jí)膽汁酸和三級(jí)膽汁酸。肝細(xì)胞內(nèi)，以膽固醇為原料直接合成的膽汁酸稱為初級(jí)膽汁酸，包括膽酸和鵝脫氧膽酸。初級(jí)膽汁酸在腸道中受細(xì)菌作用，進(jìn)行7α脫羥作用生成的膽汁酸，稱為次級(jí)膽汁酸，包括脫氧膽酸、石膽酸和酮基石膽酸。三級(jí)膽汁酸則是重吸收次級(jí)膽汁酸在肝臟及腸道的代謝產(chǎn)物，包括磺基石膽酸和熊脫氧膽酸。主要膽汁酸如表1所示。

表1主要膽汁酸名稱

臨床研究發(fā)現(xiàn)，膽汁酸可作為信號(hào)分子參與肝臟疾病的調(diào)控，其代謝異常與肝功能障礙密切相關(guān)。在健康受試者的尿液中，只有少量的膽汁酸存在；而對(duì)于有肝臟疾病的患者，由于肝中膽汁酸合成、代謝、清除及腸道重吸收的障礙，會(huì)影響其在尿液中的濃度。因此，尿液中的膽汁酸可以作為指示肝臟疾病的標(biāo)志物。

前期報(bào)道，中國專利文獻(xiàn)CN101221129B公開了磺酸化膽汁酸酶熒光毛細(xì)分析法及酶熒光定量試劑盒，適用于肝膽疾病的快速篩查和診斷。但是關(guān)于用于“首烏肝”診斷標(biāo)記物目前還未見報(bào)道。

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供膽汁酸作為診斷標(biāo)記物在臨床中用于“首烏肝”臨床診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：建立膽汁酸分析方法，對(duì)“首烏肝”大鼠體內(nèi)的膽汁酸進(jìn)行分析，尋找所述的診斷標(biāo)記物。

本發(fā)明所述的何首烏所導(dǎo)致肝臟的疾病的診斷標(biāo)記物是?；穷惸懼?，當(dāng)?；穷惸懼岬暮可咴\斷為“首烏肝”。

本發(fā)明通過正常和“首烏肝”受試動(dòng)物中17種膽汁酸的含量分析比較，結(jié)合多元模式識(shí)別分析尋找“首烏肝”的重要指標(biāo)，作為診斷標(biāo)記物。

本發(fā)明涉及何首烏所致肝損傷的臨床診治的診斷標(biāo)記物。受試動(dòng)物體內(nèi)膽汁酸主要有膽酸、甘氨膽酸、牛磺膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、熊去氧膽酸、甘氨熊去氧膽酸、?；切苋パ跄懰?、石膽酸、甘氨石膽酸、?；鞘懰?、β-鼠膽酸、?；铅?鼠膽酸。

本發(fā)明所述的診斷標(biāo)記物是牛磺β-鼠膽酸。

所述標(biāo)記物的診斷樣品為尿液。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：首次提出?；穷惸懼峥勺鳛椤笆诪醺巍睒?biāo)記物的應(yīng)用，可用于臨床中“首烏肝”的鑒別和診斷。

附圖說明

圖1：膽汁酸的質(zhì)譜棒狀圖

圖2：膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

圖3：膽汁酸在正常組與“首烏肝”組中的含量變化

圖4：?；穷惸懼嵩谡＝M和“首烏肝”組尿液中的含量變化

圖5：尿液膽汁酸的載荷圖

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

何首烏提取物制備：取500g藥材，加入5000mL 80％乙醇(V/V)回流3次，每次2h，過濾，合并濾液，減壓濃縮凍干成粉。

受試動(dòng)物給藥方案：54只大鼠隨機(jī)分為空白、低劑量組和高劑量組，各18只，分別給予0.5％的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，1g/kg、20g/kg何首烏提取物。第3、6周隨機(jī)挑選6只大鼠，收集24h尿樣。第7周為恢復(fù)期，各組均給予0.5％CMC-Na，7周結(jié)束時(shí)按上述方法收集樣品。尿液樣品經(jīng)甲醇沉淀后通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量檢測(cè)。有些膽汁酸在給藥組中含量較高。

一、材料和方法

1.尿液處理：

收集尿液，取100μL，置于1.5mL離心管中，加入10μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)存液(48μg/mL)，混合10s，加入400μL甲醇，渦旋5min，13,000rpm離心10min，取上清液

2.標(biāo)準(zhǔn)品：活性碳脫鹽的血清樣品作為溶劑，加入不同濃度的膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析：

如表1所示，設(shè)定串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)模式，高效液相色譜的程序如表2所示，進(jìn)行質(zhì)譜分析。上樣量為5μl。色譜柱采用Syncronis C18柱(1.7μm，100×2.1mm)；流動(dòng)相A相為5mM乙酸銨-0.01％乙酸，B相為甲醇；流速為0.4mL/min；

表1：膽汁酸質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

質(zhì)譜檢測(cè)器參數(shù)設(shè)置：ESI離子源；干燥氣溫度，300℃；干燥氣流速(N2)，10L/min；鞘氣溫度，300℃；鞘氣流速(N2)，10L/min；霧化氣壓力，45psig；負(fù)離子模式下質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。

表2：HPLC程序：

結(jié)果：在第3周，高劑量組膽汁酸水平顯著升高(P＜0.01)，是空白組的214倍。在第6周，低劑量組膽汁酸含量水平高于空白組約8倍，高劑量組中的膽汁酸含量則是空白組的303倍之多。

表3各組尿液總膽汁酸含量(ng/mL)

1.?；穷惸懼嶙鳛闃?biāo)記物的應(yīng)用

給藥組中?；穷惤Y(jié)合膽汁酸的比例與空白組相比顯著地升高，在低劑量組中，第3周只檢測(cè)到未結(jié)合膽汁酸，牛磺類結(jié)合膽酸的比例在第6周增加，約50％。在第7周減少并恢復(fù)正常水平。在高劑量組，?；墙Y(jié)合類膽汁酸的比例在第3周就顯著增加到77％，這種增長(zhǎng)趨勢(shì)一直持續(xù)到第6周，約占85％，在恢復(fù)期基本回歸正常。

表4尿液中各類別膽汁酸含量(ng/mL)

2.牛磺β-鼠膽酸作為標(biāo)記物的應(yīng)用

對(duì)于給藥組中膽汁酸的變化，其中TβMCA、TCA、CA和βMCA的貢獻(xiàn)較大，特別是TβMCA，可作為特異性標(biāo)志物。

表5膽汁酸載荷圖數(shù)據(jù)

實(shí)施例2

動(dòng)物體內(nèi)膽汁酸高效液相色譜分析優(yōu)化過程：

經(jīng)安捷倫6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化程序確定質(zhì)譜條件。質(zhì)譜檢測(cè)器參數(shù)設(shè)置為：ESI離子源；干燥氣溫度，300℃；干燥氣流速(N2)，10L/min；鞘氣溫度，300℃；鞘氣流速(N2)，10L/min；霧化氣壓力，45psig；負(fù)離子模式下質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。各膽汁酸質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)如表6所示。

高效液相色譜分析方法采用Syncronis C18柱(1.7μm，100×2.1mm)色譜柱；流動(dòng)相A相為5mM乙酸銨-0.01％乙酸，B相為甲醇；流速為0.4mL/min；上樣量為5μl。優(yōu)化過程如表7、表8所示。

表6：膽汁酸質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

表7：HPLC程序：

表8：HPLC程序：

結(jié)果：按照表7所示的條件進(jìn)行分析時(shí)，18種膽汁酸和分離度未完全達(dá)標(biāo)，達(dá)不到定量分析的要求。調(diào)整流動(dòng)相配比，按照表8所示的條件進(jìn)行分析，18種膽汁酸分離度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，符合定量分析的要求。