本發(fā)明屬于化學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的方法。
背景技術(shù)：
：甲殼素是地球上僅次于纖維素的第二大生物多糖，主要存在于蝦、蟹、昆蟲的甲殼，真菌、植物的細(xì)胞壁，動(dòng)物的關(guān)節(jié)等堅(jiān)硬部分以及肌肉與骨結(jié)合處等。殼寡糖(COS)是氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的同聚物或異聚物，由甲殼素降解而來。甲殼素的N-乙酰基脫去55％以上即為殼聚糖(CTS)，CTS繼續(xù)降解至2-10個(gè)聚合度即為COS。實(shí)際生產(chǎn)中，20個(gè)聚合度(約3kDa)的分子也被稱為COS。與殼聚糖相比，殼寡糖具有溶解性更好，粘度更低更易被人體吸收的優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、精細(xì)化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。殼寡糖不僅具有抗腫瘤、抑菌抗菌、抗氧化等功能，還具有減肥、調(diào)脂、增強(qiáng)免疫力等生物功能。殼寡糖的研究和開發(fā)是目前的研究熱點(diǎn)。殼寡糖的脫乙酰度是指在殼寡糖中總的糖殘基數(shù)中脫除乙?；奶菤埢鶖?shù)所占的百分比，能夠影響殼寡糖的生物、物理、化學(xué)功能與活性，是殼寡糖各種功能的體現(xiàn)，是衡量殼寡糖質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。目前，已有較多成熟的方法應(yīng)用于測(cè)定殼聚糖的脫乙酰度，如：2015年版《中華人民共和國藥典》第四部第511-512頁公開了甲基橙酸堿指示劑法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的方法；歐洲藥典(EuropeanPharmacopeia8.0[M].EDQM,2014:1841-1842)公開了以純化水為溶劑，利用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的方法。中國專利申請(qǐng)201310587162.5公開了一種測(cè)定殼聚糖與殼寡糖混合物的脫乙酰度的方法，包括如下步驟：將待檢測(cè)的樣品用稀鹽酸溶解，同時(shí)以全脫乙?；瘹す烟菫閮?nèi)標(biāo)，分別測(cè)定在199nm的紫光下吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到樣品脫乙酰度，檢測(cè)過程中以0.001mol/L的鹽酸溶液作為溶劑。殼聚糖和殼寡糖，由于兩者在性質(zhì)上存在較大的差異，因此殼聚糖脫乙酰度的測(cè)定方法并不一定適用于殼寡糖脫乙酰度的測(cè)定。根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》第四部中殼聚糖脫乙酰度的測(cè)定方法測(cè)定殼寡糖的脫乙酰度時(shí)，指示劑甲基橙pH變色范圍在3.1-4.4，酸式色為紅色，堿式色為黃色，一方面，殼寡糖樣品水溶液本身呈現(xiàn)淡黃色，采用甲基橙作為指示劑，使得滴定終點(diǎn)無法準(zhǔn)確判斷；另一方面，殼寡糖等電點(diǎn)值在4.80左右，超出甲基橙pH變色范圍，因此，按照2015版《中國藥典》采用甲基橙酸堿指示劑法測(cè)定的殼寡糖脫乙酰度存在滴定終點(diǎn)顏色變化不明顯，重現(xiàn)性差，誤差較大的缺點(diǎn)。參照歐洲藥典測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的方法以水或者0.001mol/L的鹽酸溶液作為溶劑測(cè)定殼寡糖脫乙酰度時(shí)，殼寡糖無最大吸收波長(zhǎng)，因此，歐洲藥典公開的一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法無法適用于殼寡糖脫乙酰度的測(cè)定。核磁共振氫譜(1H-NMR)作為測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的金標(biāo)準(zhǔn)，已載入了美國藥典，同時(shí)，Kim等發(fā)表的論文“OligosaccharidesandTheirDerivatives”和王世欣等發(fā)表的論文“不同來源的殼寡糖產(chǎn)品的質(zhì)量分析”公開了可利用核磁共振氫譜法測(cè)定殼寡糖的脫乙酰度，測(cè)定結(jié)果誤差小。但1H-NMR方法由于其儀器成本高且操作需要專業(yè)的技術(shù)人員，因而無法廣泛推廣使用。目前國內(nèi)外尚未建立測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的標(biāo)準(zhǔn)方法。因此，有必要建立一種快速、方便并且準(zhǔn)確的測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，發(fā)明人進(jìn)行了大量的試驗(yàn)和研究，意外地發(fā)現(xiàn)：采用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度時(shí)，若采用鹽酸濃度達(dá)到0.30mol/mL及以上的稀鹽酸作為溶劑，殼寡糖有最大波長(zhǎng)?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明的目的將通過下面的詳細(xì)描述來進(jìn)一步體現(xiàn)和說明。本發(fā)明提供一種利用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的方法，包括如下步驟：1)以濃度為0.3-1.0mol/L的鹽酸溶液作為空白溶劑，配置一系列濃度的N-乙酰-D-葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白溶劑為參比，測(cè)定不同濃度的N-乙酰-D-葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在200-206nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸光度值A(chǔ)，根據(jù)N-乙酰-D-葡萄糖胺的濃度和ΔA/Δλ繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，ΔA＝Aλ+1—Aλ-1，λ為203-205nm，Δλ＝2nm；2)取殼寡糖樣品，用空白溶劑溶解后，以空白溶劑為參比，在200-206nm波長(zhǎng)處測(cè)定其紫外吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖樣品中N-乙酰-D-葡萄糖胺的濃度，并根據(jù)以下公式計(jì)算殼寡糖樣品的脫乙酰度：式中，D.D％為脫乙酰度，％；C1為殼寡糖樣品濃度，μg/mL；C2為殼寡糖樣品中N-乙酰-D-葡萄糖胺的濃度，μg/mL；M1為203，N-乙酰-D-葡萄糖胺的分子量；42為N-乙酰-D-葡萄糖胺的分子量與D-氨基葡萄糖胺的分子量之差。優(yōu)選地，所述空白溶劑的濃度為0.3mol/L。優(yōu)選地，步驟1)中，N-乙酰-D-葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為1.60μg/mL、20.0μg/mL、32.0μg/mL、40.0μg/mL、64.0μg/mL、80.0μg/mL。優(yōu)選地，步驟1)中，λ為204nm。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明提供的利用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的方法，以濃度為0.3-1.0mol/L的鹽酸溶液作為溶劑，采用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法，通過測(cè)定樣品中的N-乙酰-D-葡萄糖胺的含量，直接測(cè)定殼寡糖的脫乙酰度，測(cè)定結(jié)果在0.0016-0.08mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性(R2＝0.9992)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19％-0.27％，回收率為99.5％-100.3％；同時(shí)，與1H-NMR法的測(cè)定結(jié)果相比，相對(duì)誤差控制在0.08％以內(nèi)，說明本發(fā)明提供的殼寡糖脫乙酰度測(cè)定方法準(zhǔn)確度高，實(shí)用性強(qiáng)。(2)本發(fā)明提供的利用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的方法，消除了共存物D-氨基葡萄糖胺、濁度及色度的干擾，提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度，樣品不需要特殊的處理，操作簡(jiǎn)單易行。(3)本發(fā)明提供的利用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的方法，同一樣品測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)控制在0.04％以內(nèi)，說明本發(fā)明提供的殼寡糖脫乙酰度測(cè)定方法重現(xiàn)性好，精密度好。附圖說明圖1以純化水為溶劑，N-乙?；?D-葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖胺、COSMW1000和COSMW3000在200nm-400nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。圖2以不同濃度的鹽酸溶液為溶劑，COSMW1000在200nm-400nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。圖3以不同濃度的鹽酸溶液為溶劑，COSMW3000在200nm-400nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。圖4以0.30mol/L鹽酸溶液為溶劑，N-乙?；?D-葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖胺、COSMW1000和COSMW3000在200nm-400nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。圖5N-乙?；?D-葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖胺、COSMW1000和COSMW3000在200-210nm范圍內(nèi)的紫外一階導(dǎo)數(shù)光譜。圖6一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7COSMW1000的核磁共振氫譜圖(500MHz)，其中，A-E代表糖環(huán)上C2-C6位氫信號(hào)。圖8COSMW3000的核磁共振氫譜圖(500MHz)，其中，A-E代表糖環(huán)上C2-C6位氫信號(hào)。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本發(fā)明實(shí)施例中所用原料均為市售產(chǎn)品，其中，涉及的部分設(shè)備型號(hào)和來源如下：名稱生產(chǎn)企業(yè)T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司DK-8D型千分之一電子分析天平德國賽多利斯集團(tuán)Bruker500MHz核磁共振儀德國布魯克公司實(shí)施例1測(cè)定溶劑的選擇本發(fā)明發(fā)明人在研究過程中發(fā)現(xiàn)，按照歐洲藥典中的一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼聚糖乙酰度方法測(cè)定殼寡糖時(shí)，以純化水作為溶劑，以N-乙?；?D-葡萄糖胺為內(nèi)標(biāo)，在200nm-400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖胺、COSMW1000(脫乙酰度≥90％，平均分子量≤1000的殼寡糖樣品)和COSMW3000(脫乙酰度≥90％，平均分子量≤3000的殼寡糖樣品)進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果見圖1，其中曲線1為D-氨基葡萄糖胺的紫外掃描曲線，曲線2為COSMW3000的紫外掃描曲線，曲線3為COSMW1000的紫外掃描曲線，曲線4為N-乙?；?D-葡萄糖胺的紫外掃描曲線。由圖1結(jié)果可知，按照歐洲藥典中一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法，以純化水作為溶劑時(shí)，殼寡糖沒有最大吸收波長(zhǎng)，歐洲藥典公開的一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法無法適用于殼寡糖脫乙酰度的測(cè)定。發(fā)明人進(jìn)行了大量的試驗(yàn)和研究，意外地發(fā)現(xiàn)：采用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度時(shí)，采用鹽酸濃度達(dá)到0.30mol/mL及以上的稀鹽酸作為溶劑，殼寡糖有最大吸收波長(zhǎng)。以不同濃度的稀鹽酸溶液作為溶劑，在200nm-400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)COSMW1000和COSMW3000進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果見圖2和圖3。圖2中，曲線1-5分別為以濃度為0.05mol/mL、0.10mol/mL、0.15mol/mL、0.30mol/mL、0.50mol/mL的鹽酸溶液作為溶劑時(shí)COSMW1000的紫外掃描曲線；圖3中，曲線1-5分別為以濃度為0.05mol/mL、0.10mol/mL、0.15mol/mL、0.30mol/mL、0.50mol/mL的鹽酸溶液作為溶劑時(shí)COSMW3000的紫外掃描曲線。由圖2和圖3結(jié)果可知，當(dāng)鹽酸濃度達(dá)到0.30mol/mL及以上時(shí)殼寡糖有最大吸收波長(zhǎng)。因此，以鹽酸濃度達(dá)到0.30mol/mL及以上的稀鹽酸作為溶劑，可利用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度。實(shí)施例2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇中國專利申請(qǐng)201310587162.5公開了通過測(cè)定199nm紫光下的吸光度來測(cè)定殼聚糖與殼寡糖混合物的脫乙酰度的方法，但研究過程中發(fā)現(xiàn)，N-乙?；?D-葡萄糖胺和殼寡糖在199nm處存在末端吸收，對(duì)測(cè)定造成干擾，誤差很大，因此，本發(fā)明選擇200nm-400nm波長(zhǎng)作為研究對(duì)象。以0.30mol/mL的鹽酸溶液作為溶劑，配制40μg/mL的N-乙酰基-D-葡萄糖胺、40μg/mL的D-氨基葡萄糖胺、0.4mg/mLCOSMW1000、0.2mg/mLCOSMW3000，在200nm-400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖4，其中曲線1為D-氨基葡萄糖胺的紫外掃描曲線，曲線2為N-乙酰基-D-葡萄糖胺的紫外掃描曲線，曲線3為COSMW3000的紫外掃描曲線，曲線4為COSMW1000的紫外掃描曲線。由圖4結(jié)果可知，N-乙?；?D-葡萄糖胺在204nm處具有最大吸收，但在204nm波長(zhǎng)處，共存物D-氨基葡萄糖胺也有吸收，干擾N-乙?；?D-葡萄糖胺的測(cè)定，因此，采用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法來消除干擾。將N-乙?；?D-葡萄糖胺、D-氨基葡萄糖胺、COSMW1000和COSMW3000在200nm-210nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜轉(zhuǎn)換成一階導(dǎo)數(shù)光譜，結(jié)果見圖5，其中，曲線1為D-氨基葡萄糖胺，曲線2為COSMW3000，曲線3為COSMW1000，曲線4為N-乙?；?D-葡萄糖胺。由圖5結(jié)果可知，N-乙酰基-D-葡萄糖胺在203nm-206nm范圍內(nèi)均有吸收，在204nm具有最大吸收，而D-氨基葡萄糖胺在200nm-210nm范圍內(nèi)無吸收，因此，用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖的脫乙酰度可消除共存物D-氨基葡萄糖胺的干擾。實(shí)施例3一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以濃度為0.3mol/L的鹽酸溶液作為空白溶劑，配置2.0mg/mLN-乙酰-D-葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用0.3mol/L的鹽酸溶液稀釋，配置成1.60μg/mL、20.0μg/mL、32.0μg/mL、40.0μg/mL、64.0μg/mL、80.0μg/mL的N-乙酰-D-葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.3mol/L的鹽酸溶液做參比，用1cm的石英比色皿，測(cè)定不同濃度的N-乙酰-D-葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)溶液在200-206nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸光度值A(chǔ)，根據(jù)N-乙酰-D-葡萄糖胺的濃度和ΔA/Δλ繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，ΔA＝A205nm—A203nm，Δλ＝(205-203)nm＝2nm；標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，其中，回歸方程為Y＝0.0021X-0.003，R2＝0.9992，N-乙酰氨基葡萄糖胺在0.0016-0.08mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性。2)殼寡糖脫乙酰度的測(cè)定分別精密稱取1.0gCOSMW1000和COSMW3000，用0.3mol/L的鹽酸溶液溶解后，定容至250mL作為儲(chǔ)備液。以0.3mol/L的鹽酸溶液為參比，在200-206nm波長(zhǎng)處測(cè)定其紫外吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼寡糖樣品中N-乙酰-D-葡萄糖胺的濃度，并根據(jù)以下公式計(jì)算殼寡糖樣品的脫乙酰度：式中，D.D％為脫乙酰度，％；C1為殼寡糖樣品濃度，μg/mL；C2為殼寡糖樣品中N-乙酰-D-葡萄糖胺的濃度，μg/mL；M1為203，N-乙酰-D-葡萄糖胺的分子量；42為N-乙酰-D-葡萄糖胺的分子量與D-氨基葡萄糖胺的分子量之差。3)測(cè)定結(jié)果：COSMW1000對(duì)應(yīng)的脫乙酰度為93.45±0.04％；COSMW3000對(duì)應(yīng)的脫乙酰度為92.88±0.03％。本發(fā)明提供的利用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的方法，測(cè)定同一批次殼寡糖樣品脫乙酰度，其測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.04％以內(nèi)，說明本發(fā)明提供的方法精密度好。實(shí)施例4回收率考察由于殼寡糖沒有標(biāo)準(zhǔn)品，因此，用殼寡糖聚合物分子中的兩種基本構(gòu)成鏈節(jié)N-乙?；?D-葡萄糖胺和D-氨基葡萄糖胺不同比例混合代表不同脫乙酰度的殼寡糖。分別精密量取2.0mg/mLN-乙?；?D-葡萄糖胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.50mL、0.75mL、1.00mL于100mL容量瓶中，分別向上述容量瓶中加入D-氨基葡萄糖胺0.0063g、0.0063g、0.0051g配制成相當(dāng)于脫乙酰度為92.2％、88.7％和82.7％的殼寡糖溶液。按實(shí)施例3中步驟2)所述方法測(cè)定殼寡糖溶液的脫乙酰度并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。表1一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表1結(jié)果可知，本發(fā)明提供的利用一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的方法的回收率好，殼寡糖脫乙酰度測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度高。對(duì)比例11H-NMR法測(cè)定脫乙酰度1)1H-NMR法測(cè)定脫乙酰度分別精密稱取20mgCOSMW1000和COSMW3000溶解在5mL的D2O(99.96％)中，得濃度為4mg/mL的樣品溶液，將所得樣品溶液轉(zhuǎn)移至8mm核磁管中進(jìn)行測(cè)定，共振頻率為500MHz，測(cè)定溫度為297k，最后對(duì)目標(biāo)信號(hào)積分，其中糖環(huán)上C2位乙酰胺基中乙?；臍湫盘?hào)(Acetyl-H)在1.9-2.1ppm，糖環(huán)上C2-C6位氫信號(hào)在2.6-6.0ppm處。COSMW1000，COSMW3000核磁共振氫譜圖分別見圖7，圖8。根據(jù)表2，對(duì)核磁共振氫譜圖對(duì)應(yīng)峰進(jìn)行積分，脫乙酰度計(jì)算公式為：D.D(％)＝{1-[(7*A2)/(3*A1)]}*100其中，A2代表糖環(huán)上C2位乙酰氨基中乙?；?個(gè)氫信號(hào)的積分值；A1代表糖環(huán)上C2-C6位氫信號(hào)的積分值。表225℃下殼寡糖氘水溶液氫質(zhì)子化學(xué)位移利用1H-NMR法測(cè)得COSMW1000，COSMW3000對(duì)應(yīng)的脫乙酰度測(cè)定結(jié)果分別為93.52±0.13，92.81±0.07。2)1H-NMR法與本發(fā)明酸堿指示劑法測(cè)定結(jié)果的對(duì)比1H-NMR法與本發(fā)明酸堿指示劑法測(cè)定結(jié)果的對(duì)比結(jié)果見表3。表31H-NMR與本發(fā)明酸堿指示劑法測(cè)定結(jié)果對(duì)比(n＝6)從表3結(jié)果可以看出，本發(fā)明一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法測(cè)定殼寡糖脫乙酰度的測(cè)定結(jié)果與1H-NMR法的測(cè)定結(jié)果一致，相對(duì)誤差控制在0.08％以內(nèi)，說明本發(fā)明提供的一階導(dǎo)數(shù)紫外分光光度法用于測(cè)定殼寡糖脫乙酰度準(zhǔn)確度高。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3