本發(fā)明涉及免疫檢測分析領(lǐng)域，尤其涉及一種基于貴金屬納米粒子的可視化檢測方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

比色法因具有肉眼直接讀出信號，不需要借助于其他精密昂貴的儀器設(shè)備等自身優(yōu)勢，在很多方面都有應(yīng)用。以往報道的很多與比色相關(guān)的方法大都是通過控制金或者是銀納米粒子的聚集和分散狀態(tài)以達(dá)到顏色改變的目的。但是這些方法往往需要對金屬納米粒子的表面進(jìn)行修飾，或者是向他們的溶液中添加一些電解質(zhì)以改變其表面的電荷，從而達(dá)到溶液變色的目的。然而，復(fù)雜的修飾過程很可能會導(dǎo)致金屬納米粒子的非特異性聚集從而產(chǎn)生假陽性或者假陰性信號。此外，雖然目前報道的許多方法都取得了良好的靈敏度，但是大部分方法都不能適用于臨床的直接檢測。本發(fā)明所公開的方法能夠方便、快捷、高靈敏的可視化檢測包括腫瘤標(biāo)志物、細(xì)菌、病毒等在內(nèi)的多種物質(zhì)，具有很好的普適性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供了一種高靈敏的實用型的可視化檢測方法。所述方法將酶的高效催化活性與貴金屬納米粒子高的消光系數(shù)相結(jié)合直接原位生長金或銀納米粒子用于包括腫瘤標(biāo)志物、細(xì)菌、病毒等在內(nèi)的多種物質(zhì)的檢測。本發(fā)明中酶催化其底物產(chǎn)生的還原劑能夠迅速的將金或銀離子還原為顏色明顯的納米粒子溶液。主要特點是整個過程無需復(fù)雜的探針修飾，直接原位生長金或銀納米粒子得到不同顏色深淺的納米粒子溶液。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種基于貴金屬納米粒子的可視化檢測方法，包括

1)含酶催化溶液制備的步驟；

2)貴金屬納米粒子溶液制備的步驟；

3)肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果；

4)用微孔板讀數(shù)器讀取孔板中金或銀納米粒子的溶液的吸光度值，將堿性磷酸酶(ALP)的濃度與所得吸光度值做線性擬合；

其中：含酶催化溶液是將L-抗壞血酸-2-磷酸酯三鈉鹽(AA-P)溶解在二乙醇胺-硝酸的緩沖溶液(DEA buffer)中，在孔板中與不同濃度的堿性磷酸酶(ALP)孵化得到；

其中貴金屬為金或銀，其納米粒子溶液是將氯金酸(HAuCl₄)或硝酸銀(AgNO₃)加入到1)的溶液中啟動氧化還原反應(yīng)原位生長金或銀納米粒子得到。

進(jìn)一步的，步驟1)中，L-抗壞血酸-2-磷酸酯三鈉鹽(AA-P)溶解在二乙醇胺-硝酸的緩沖溶液(DEA buffer)中，取50-500μL上述溶液與不同濃度的堿性磷酸酶(ALP)于4-37℃下孵化0.5-24h；

步驟4)中，金或銀納米粒子的溶液的吸光度值是金或銀納米粒子的溶液在530nm或400nm處的吸光度值(A_530nm or A_400nm)，并將ALP的濃度與A_530nm或A_400nm做線性擬合。

進(jìn)一步的，步驟1)所述AA-P的濃度為5-50mM，優(yōu)選為10mM；所述DEA buffer的濃度為50-400mM，優(yōu)選為160mM；所述DEA buffer的pH為9.8；所述ALP的濃度為0-100U/L。

進(jìn)一步的，步驟2)所述氯金酸或硝酸銀的濃度為1M；所述氯金酸或硝酸銀的體積為0.5-3μL，優(yōu)選為3μL。

本發(fā)明提供了一種基于貴金屬納米粒子的可視化檢測方法的應(yīng)用，包括如下步驟：

1)將不同濃度的抗原通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到捕獲抗體包被的ELISA孔板上；

2)將生物素化的檢測抗體(biotin-Ab2)通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到ELISA孔板上；

3)將鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶(streptavidin-ALP)通過生物素與親和素的特異性結(jié)合吸附到ELISA孔板上；

4)L-抗壞血酸-2-磷酸酯三鈉鹽(AA-P)溶解在二乙醇胺-硝酸的緩沖溶液(DEA buffer)中得到AA-P的溶液，將所得溶液加入到3)所述孔板中，恒溫條件下孵化1h；

5)將HAuCl₄或AgNO₃加入到4)中啟動氧化還原反應(yīng)原位生長金或銀納米粒子，得到金或銀納米粒子的溶液；

6)肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果；

7)用微孔板讀數(shù)器讀取孔板中金或銀納米粒子的溶液在530nm或400nm處的吸光度值(A_530nm or A_400nm)，將ALP濃度與A_530nm或A_400nm做線性擬合。

進(jìn)一步的，步驟1)所述抗原為甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異抗原(PSA)、腫瘤抗原153(CA153)；或免疫球蛋白(IgG)；或大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌；或人類免疫缺陷病毒(HIV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)。

進(jìn)一步的，步驟2)所述biotin-Ab2的濃度為0.1-3μg/mL,優(yōu)選為2μg/mL；所述streptavidin-ALP的濃度為0.1-3μg/mL,優(yōu)選為1μg/mL。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過貴金屬納米顆粒原位生長的方法來檢測多種物質(zhì)，所得納米粒子溶液的顏色深淺與酶濃度和檢測物質(zhì)的濃度密切相關(guān)，并且在一定濃度范圍內(nèi)可通過所得納米粒子溶液的顏色半定量酶的濃度。該過程無需任何復(fù)雜的探針修飾，也不涉及任何后續(xù)添加物，更無需昂貴精密的儀器設(shè)備以及專業(yè)的科學(xué)分析，只需肉眼即可實現(xiàn)包括腫瘤標(biāo)志物、細(xì)菌、病毒等在內(nèi)的多種物質(zhì)的可視化檢測。與傳統(tǒng)的ELISA相比，該檢測方法更加方便、快速、低耗且適用范圍更加廣泛。

附圖說明

圖1一種基于貴金屬納米粒子的可視化檢測方法在免疫檢測分析中的應(yīng)用示意圖。

圖2一種基于貴金屬納米粒子的可視化檢測方法(以原位長銀為例)。a)是不同酶濃度條件下銀納米粒子原位生長的可視化檢測結(jié)果圖；b)不同酶濃度條件下所得的銀納米粒子溶液的紫外-可見吸收光譜；c)不同濃度的酶與所得銀納米粒子溶液在400nm處吸光度值的擬合直線圖；誤差線代表了三次獨立實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖3是貴金屬納米粒子原位生長的可視化檢測方法(以原位長銀為例)與傳統(tǒng)的HRP方法用于檢測游離AFP的結(jié)果圖；誤差線代表了三次獨立實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

圖4是貴金屬納米粒子原位生長的可視化檢測方法(以原位長銀為例)以及傳統(tǒng)的HRP方法用于檢測不同癌癥病人血清中AFP的結(jié)果圖。

圖5是貴金屬納米粒子原位生長的可視化檢測方法(以原位長銀為例)以及傳統(tǒng)的HRP方法用于檢測對接受治療后的癌癥病人血清中AFP的結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明。除非本申請上下文中另有其他說明，否則本申請中所用技術(shù)術(shù)語及縮寫均具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)含義；除非另有說明，否則下述實施例中所用原料化合物均為商購獲得。

本發(fā)明中涉及到貴金屬金、銀所表述的長金法，為現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的金屬納米粒子生長方法。

按照本發(fā)明所提供的一種酶調(diào)節(jié)的貴金屬納米粒子原位生長的可視化檢測方法及其在免疫檢測分析中的應(yīng)用，其具體實施方式如下：

圖1是貴金屬納米粒子原位生長的方法在免疫檢測分析中的應(yīng)用示意圖。由圖1可知本發(fā)明將傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)與酶的高效催化活性以及貴金屬納米粒子高的消光系數(shù)相結(jié)合，可快速、便捷的可視化檢測包括腫瘤標(biāo)志物、細(xì)菌、病毒等在內(nèi)的多種物質(zhì)。

實施例1：

一種基于銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法1

將AA-P溶解在160mM的DEA buffer中，使其終濃度為10mM。再將上述100μL溶液加入96孔板中并與不同濃度的ALP在37℃下孵化1h。然后再加入3μL1 M的硝酸銀溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長銀納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果，同時用微孔板讀數(shù)器讀取AgNPs在400nm處的吸光度值(A_400nm)，將ALP的濃度與A_400nm做線性擬合。如圖2，a)是不同酶濃度條件下銀納米粒子原位生長的可視化檢測結(jié)果圖；b)不同酶濃度條件下所得的銀納米粒子溶液的紫外-可見吸收光譜；c)不同濃度的酶與所得銀納米粒子溶液在400nm處吸光度值的擬合直線圖。

實施例2：

一種基于銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法2

將AA-P溶解在120mM的DEA buffer中，使其終濃度為8mM。再將上述100μL溶液加入96孔板中并與不同濃度的ALP 37℃下孵化1h。然后再加入2.5μL 1M的硝酸銀溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長銀納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果，同時用微孔板讀數(shù)器讀取AgNPs在400nm處的吸光度值(A_400nm)，將ALP的濃度與A_400nm做線性擬合。

實施例3：

一種基于金納米粒子原位生長的可視化檢測方法1

將AA-P溶解在160mM的DEA buffer中，使其終濃度為10mM。再將上述100μL溶液加入96孔板中并與不同濃度的ALP 37℃下孵化1h。然后再加入3μL1 M的氯金酸溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長金納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果，同時用微孔板讀數(shù)器讀取AuNPs在530nm處的吸光度值(A_530nm)，將ALP的濃度與A_530nm做線性擬合。

實施例4：

一種基于金納米粒子原位生長的可視化檢測方法2

將AA-P溶解在120mM的DEA buffer中，使其終濃度為8mM。再將上述溶液加入96孔板中并與不同濃度的ALP 37℃下孵育1h。然后再加入2.5μL 1M的氯金酸溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長金納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果，同時用微孔板讀數(shù)器讀取AuNPs在530nm處的吸光度值(A_530nm)，將ALP的濃度與A_530nm做線性擬合。

實施例5：

一種基于銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法用于AFP的檢測1

第一步，將不同濃度的AFP(0、2、5、10、20、50、100、200ng/mL)通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到捕獲抗體包被的96孔板上，DEA buffer(含0.05％tween 20)洗滌3次后，再將2ug/mL biotin-Ab2通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到96孔板上，3次洗滌后將1ug/mL的streptavidin-ALP通過生物素與親和素的特異性結(jié)合固定到96孔板上，洗滌3次。

第二步，將AA-P溶解在160mM的DEA buffer中，使其終濃度為10mM。再將上述溶液加入到第一步的孔板中37℃下孵化1h。然后再加入3μL 1M的硝酸銀溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長銀納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果；同時用微孔板讀數(shù)器讀取AgNPs在400nm處的吸光度值(A_400nm)，將AFP的濃度與A_400nm做線性擬合,兩者在一定的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，在3σ(σ＝S₀/S；S₀,空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差；S,標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)處的最低檢測限為0.23ng/mL。如圖3是銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法與傳統(tǒng)的HRP方法用于檢測AFP的結(jié)果圖；誤差線代表了三次獨立實驗的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

實施例6：

一種基于銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法用于CEA的檢測1

第一步，將不同濃度的CEA(0、0.5、1、2、4、8、16、32ng/mL)通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到捕獲抗體包被的96孔板上，DEA buffer(含0.05％tween 20)洗滌3次后，再將2ug/mL biotin-Ab2通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到96孔板上，3次洗滌后將1ug/mL的streptavidin-ALP通過生物素與親和素的特異性結(jié)合固定到96孔板上，洗滌3次。

第二步，將AA-P溶解在160mM的DEA buffer中，使其終濃度為10mM。再將上述溶液加入到第一步的孔板中37℃下孵化1h。然后再加入3μL 1M的硝酸銀溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長銀納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果；同時用微孔板讀數(shù)器讀取AgNPs在400nm處的吸光度值(A_400nm)，將CEA的濃度與A_400nm做線性擬合。

實施例7：

一種基于銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法用于IgG的檢測1

第一步，將不同濃度的IgG(0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9ng/mL)通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到捕獲抗體包被的96孔板上，DEA buffer(含0.05％tween 20)洗滌3次后，再將2ug/mL biotin-Ab2通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到96孔板上，3次洗滌后將1ug/mL的streptavidin-ALP通過生物素與親和素的特異性結(jié)合固定到96孔板上，洗滌3次。

第二步，將AA-P溶解在160mM的DEA buffer中，使其終濃度為10mM。再將上述溶液加入到第一步的孔板中37℃下孵化1h。然后再加入3μL 1M的硝酸銀溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長銀納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果；同時用微孔板讀數(shù)器讀取AgNPs在400nm處的吸光度值(A_400nm)，將IgG的濃度與A_400nm做線性擬合。

實施例8：

一種基于銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法用于大腸桿菌的檢測1

第一步，將不同濃度的滅活的大腸桿菌通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到捕獲抗體包被的96孔板上，DEA buffer(含0.05％tween 20)洗滌3次后，再將2ug/mL biotin-Ab2通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到96孔板上，3次洗滌后將1ug/mL的streptavidin-ALP通過生物素與親和素的特異性結(jié)合固定到ELISA孔板上，洗滌3次。

第二步，將AA-P溶解在160mM的DEA buffer中，使其終濃度為10mM。再將上述溶液加入到第一步的孔板中37℃下孵化1h。然后再加入3μL 1M的硝酸銀溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長銀納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果；同時用微孔板讀數(shù)器讀取AgNPs在400nm處的吸光度值(A_400nm)，將大腸桿菌的濃度與A_400nm做線性擬合。

實施例9：

一種基于銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法用于金黃色葡萄球菌的檢測1

第一步，將不同濃度的滅活的金黃色葡萄球菌通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到捕獲抗體包被的96孔板上，DEA buffer(含0.05％tween 20)洗滌3次后，再將2ug/mL biotin-Ab2通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到96孔板上，3次洗滌后將1ug/mL的streptavidin-ALP通過生物素與親和素的特異性結(jié)合固定到96孔板上，洗滌3次。

第二步，將AA-P溶解在160mM的DEA buffer中，使其終濃度為10mM。再將上述溶液加入到第一步的孔板中37℃下孵化1h。然后再加入3μL 1M的硝酸銀溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長銀納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果；同時用微孔板讀數(shù)器讀取AgNPs在400nm處的吸光度值(A_400nm)，將金黃色葡萄球菌的濃度與A_400nm做線性擬合。

實施例10：

一種基于銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法用于血清中AFP的檢測

第一步，將來源于54個不同的人的血清樣品分別加入到捕獲抗體包被的96孔板中，洗滌3次后，再將1.5ug/mL biotin-Ab2通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到96孔板上，3次洗滌后將1ug/mL streptavidin-ALP通過生物素與親和素的特異性結(jié)合吸附到孔板上，洗滌3次。

第二步，將AA-P溶解在160mM的DEA buffer中，使其終濃度為10mM。再將上述溶液加入到第一步的96孔板中37℃下孵化1h。然后再加入3μL 1M的硝酸銀溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長銀納米粒子。用肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果，同時用微孔板讀數(shù)器讀取AgNPs在400nm處的吸光度值(A_400nm)。如圖4是酶調(diào)節(jié)的銀納米粒子原位生長的方法和傳統(tǒng)的ELISA方法用于血清中AFP檢測的結(jié)果圖。由圖4可知酶調(diào)節(jié)的銀納米粒子生長的方法對于血清中AFP的檢測靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的ELISA方法。

實施例11：

一種基于銀納米粒子原位生長的可視化檢測方法用于檢測接受治療后的癌癥病人的血清AFP

第一步，將來源于7個接受治療的不同的癌癥病人的血清樣品分別加入到捕獲抗體包被的96孔板中，洗滌3次后，再將1.5ug/mL biotin-Ab2通過抗原抗體的特異性結(jié)合吸附到96孔板上，3洗滌次后將1ug/ml streptavidin-ALP通過生物素與親和素的特異性結(jié)合吸附到96孔板上，洗滌3次。

第二步，將AA-P溶解在160mM的DEA buffer中，使其終濃度為10mM。再將上述100μL溶液加入到第一步的96孔板中37℃下孵化1h。然后再加入3μL1M的硝酸銀溶液來啟動氧化還原反應(yīng)原位生長銀納米粒子。肉眼觀察孔板中的顏色變化，并用相機(jī)拍照，得到可視化檢測結(jié)果，同時用微孔板讀數(shù)器讀取AgNPs在400nm處的吸光度值(A_400nm)。圖5所示是酶調(diào)節(jié)的銀納米粒子原位生長的方法以及傳統(tǒng)的ELISA方法對接受治療后的癌癥病人血清中AFP檢測結(jié)果圖。由圖5可知酶調(diào)節(jié)的銀納米粒子生長的方法對于檢測接受治療后的癌癥病人血清中AFP與傳統(tǒng)的ELISA相比具有較高的檢測靈敏度。

需要說明的是，本發(fā)明是一種基于貴金屬納米粒子原位生長的可視化檢測方法及該檢測方法的應(yīng)用，同時給出了該方法在包括腫瘤標(biāo)志物、細(xì)菌、病毒等多種物質(zhì)在內(nèi)的可視化檢測方法，其目的是為了給出一種區(qū)別于傳統(tǒng)方法的可視化檢測方法，并非屬于對疾病的診斷及治療。說明書中所描述的腫瘤標(biāo)志物等內(nèi)容，只是為了起到對本發(fā)明的內(nèi)容的了解及說明作用。另外，本發(fā)明方法是基于貴金屬納米粒子直接原位生長導(dǎo)致溶液顏色從無色到有色的明顯變化，不需要任何復(fù)雜的探針修飾過程和精密的儀器設(shè)備，使得該方法具有廣泛的普適性。仍需進(jìn)一步說明的是，本發(fā)明不限于這里的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，按本發(fā)明構(gòu)思所做出的顯而易見的改進(jìn)和修飾都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。