本發(fā)明涉及鏈霉親和素標(biāo)記物與生物素偶聯(lián)物在側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑及其制備方法、檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

免疫側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)的主要特點(diǎn)是檢測(cè)速度快，操作簡(jiǎn)單，因此在很多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。它是以條狀纖維材料為固相，如硝酸纖維素膜，通過(guò)毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測(cè)物與層析材料上預(yù)包被的該待測(cè)物特異性受體發(fā)生高親和性免疫反應(yīng)，層析過(guò)程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域，通過(guò)對(duì)該特定區(qū)域的分析得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從而達(dá)到檢測(cè)目的。常用的標(biāo)記物如酶、膠體金顆粒、彩色微球、熒光微球、有機(jī)熒光分子。

酶法標(biāo)記是利用酶催化底物的原理，其缺點(diǎn)是檢測(cè)范圍窄、受溫度影響大；膠體金標(biāo)記是通過(guò)靜電吸附原理標(biāo)記，再對(duì)捕獲線(xiàn)上膠體金顆粒的富集顯色判定結(jié)果，其缺點(diǎn)是重復(fù)性差，靈敏度不高；彩色微球可以采用共價(jià)的化學(xué)交聯(lián)法也可以采用物理吸附法標(biāo)記，但定量檢測(cè)的缺點(diǎn)是捕獲線(xiàn)上色度不均一；熒光微球的本質(zhì)和彩色微球一樣，是將有機(jī)熒光分子摻入或包被乳膠微球而制成，其缺點(diǎn)是微球分子阻礙大、特異性低、微球容易凝聚；上述方法均難以做到精確定量，從而限制了這類(lèi)產(chǎn)品的實(shí)際應(yīng)用。在已經(jīng)商品化的定量免疫層析診斷試劑中，也有用熒光分子標(biāo)記，而一般的熒光染料因?yàn)樗鼈兊募ぐl(fā)光和檢測(cè)光的波長(zhǎng)位于可見(jiàn)光區(qū)，容易形成高背景的熒光干擾，降低了檢測(cè)靈敏度。

鏈霉親和素生物素系統(tǒng)是一種新型生物反應(yīng)系統(tǒng)，此系統(tǒng)幾乎可與目前研究成功的各種標(biāo)記物結(jié)合，且一個(gè)鏈霉親和素分子也能結(jié)合4個(gè)生物素分子，目前已應(yīng)用于酶法檢測(cè)微量抗原、分離DNA片段和蛋白、在細(xì)胞水平的定位觀(guān)察研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一在于針對(duì)現(xiàn)有免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑條所存在的檢測(cè)靈敏度差的問(wèn)題而提供一種操作簡(jiǎn)單便捷、檢測(cè)速度快，定量準(zhǔn)確的免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之二在于提供上述免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑的制備方法。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之三在于提供上述免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑的檢測(cè)方法。

作為本發(fā)明的第一方面的免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑，包括測(cè)試條，所述測(cè)試條包括底板和按樣品流動(dòng)方向依次設(shè)置在所述底板上的樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，在所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，按樣品流動(dòng)方向所述檢測(cè)線(xiàn)在前，質(zhì)控線(xiàn)在后，所述檢測(cè)線(xiàn)上包被有檢測(cè)線(xiàn)蛋白，所述質(zhì)控線(xiàn)上包被有質(zhì)控線(xiàn)蛋白，其特征在于，

所述檢測(cè)線(xiàn)蛋白為能與抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物結(jié)合，形成免疫復(fù)合物；所述質(zhì)控線(xiàn)蛋白能與參照標(biāo)記復(fù)合物特異性結(jié)合；

還包括抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物凍干品和參照標(biāo)記復(fù)合物兩者混合物的凍干品；

所述抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物是以近紅外熒光分子染料標(biāo)記鏈霉親和素與活化的生物素偶聯(lián)能與體內(nèi)的疾病標(biāo)志物特異性結(jié)合的生物素標(biāo)記特異性抗體結(jié)合而形成的抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物；

所述參照標(biāo)記復(fù)合物是以近紅外熒光分子染料標(biāo)記鏈霉親和素與活化的生物素標(biāo)記參照物結(jié)合而形成。

作為本發(fā)明第二發(fā)明的免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑的制備方法，具有如下步驟：

1)制備近紅外熒光分子染料標(biāo)記鏈霉親和素；

2)活化的生物素偶聯(lián)能與體內(nèi)的疾病標(biāo)志物特異性結(jié)合得到生物素標(biāo)記特異性抗體，活化的生物素標(biāo)記參照物得到活化的生物素標(biāo)記參照物；

3)將步驟1)制備的近紅外熒光標(biāo)記的鏈霉親和素分別與步驟2)制備的生物素標(biāo)記特異性抗體、活化的生物素標(biāo)記參照物混合，發(fā)生鏈霉親和素生物素放大反應(yīng)，形成抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物和參照標(biāo)記復(fù)合物，將所述抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物和參照標(biāo)記復(fù)合物混合后凍干形成兩者混合物的凍干品；

4)將檢測(cè)線(xiàn)蛋白和質(zhì)控線(xiàn)蛋白分別包被到所述硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線(xiàn)位置和質(zhì)控線(xiàn)位置，在所述硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)；

5)將樣品墊和吸水墊分別粘貼到硝酸纖維素膜的兩端，切割成測(cè)試條并裝入塑料卡槽組裝成試劑卡；

6)將步驟3)的抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物和參照標(biāo)記復(fù)合物兩者混合物的凍干品與步驟5)的試劑卡裝入包裝袋內(nèi)組裝成免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑盒，免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑處于干燥低溫保存狀態(tài)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述近紅外熒光分子染料為發(fā)射波長(zhǎng)為650-1000nm的近紅外熒光分子染料。

在本發(fā)明的而一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述近紅外熒光分子染料為琥珀酰亞胺酯IRDye800。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述參照物為抗兔IgG抗體。

作為本發(fā)明第三方面的免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑的檢測(cè)方法，具有如下步驟：

1)將抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物和參照標(biāo)記復(fù)合物兩者混合物的凍干品復(fù)溶恢復(fù)至使用狀態(tài)得到抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物和參照標(biāo)記復(fù)合物兩者的混合復(fù)溶液；

2)將待測(cè)抗原分別與抗體免疫標(biāo)記復(fù)合物和參照標(biāo)記復(fù)合物兩者的混合復(fù)溶液以1:2比例混勻，取100ul加到測(cè)試條樣品墊上；

3)將試劑卡用近紅外熒光檢測(cè)儀讀取檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，以?xún)?chǔ)存的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)物濃度。

本發(fā)明使用硝酸纖維素膜作為固相載體，將特定蛋白質(zhì)固定在上面形成檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)，組裝成由樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊組成的試劑卡；用近紅外熒光標(biāo)記的鏈霉親和素與生物素標(biāo)記的抗體，發(fā)生每個(gè)鏈霉親和素能結(jié)合四個(gè)分子生物素的信號(hào)放大反應(yīng)，形成標(biāo)記復(fù)合物。在檢測(cè)過(guò)程中，標(biāo)記復(fù)合物與待測(cè)物樣本反應(yīng)后，再與固相上的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)分別反應(yīng)，形成相應(yīng)的免疫復(fù)合物，最后用紅外熒光檢測(cè)儀對(duì)試劑卡視窗進(jìn)行掃描，并根據(jù)熒光強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算標(biāo)本中待測(cè)物的濃度。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單便捷、檢測(cè)速度快，定量準(zhǔn)確，可以應(yīng)用于疾病診斷、毒品以及食品安全等的檢測(cè)。

本發(fā)明利用紅外熒光染料的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用了鏈霉親和素生物素系統(tǒng)，克服了以一般熒光染料為標(biāo)記物的側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)所呈現(xiàn)的背景熒光干擾大，靈敏度低，定量不精確的缺點(diǎn)，建立了一種基于近紅外熒光染料標(biāo)記鏈霉親和素、再與生物素偶聯(lián)物反應(yīng)的檢測(cè)方法。本發(fā)明的工作原理為：使用劃膜儀，將能與被檢測(cè)物特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)固定在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(xiàn)上，將能與參照物形成特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)固定在硝酸纖維素膜的質(zhì)控線(xiàn)上，檢測(cè)時(shí)，先將凍干品恢復(fù)至使用狀態(tài)，形成的近紅外熒光染料偶聯(lián)鏈霉親和素—生物素標(biāo)記第二抗體復(fù)合物、參照物標(biāo)記復(fù)合物，這些標(biāo)記復(fù)合物與待測(cè)物樣本反應(yīng)后，再與固相上的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)分別反應(yīng)，形成相應(yīng)的免疫復(fù)合物，使用紅外熒光檢測(cè)儀掃描檢測(cè)卡視窗，以參照物的熒光強(qiáng)度作為參照，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算待測(cè)物的濃度。

本發(fā)明所采用的方法是雙抗體夾心法檢測(cè)抗原。當(dāng)使用雙抗夾心法檢測(cè)待測(cè)物時(shí)，在免疫層析試紙上將特定的抗體固定于檢測(cè)線(xiàn)，將能與參照物形成特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)固定于質(zhì)控線(xiàn)，此質(zhì)控體系與檢測(cè)體系不發(fā)生交叉反應(yīng)，無(wú)干擾性，質(zhì)控線(xiàn)通常包被的是兔IgG。近紅外熒光染料標(biāo)記鏈霉親和素與生物素偶聯(lián)抗體先發(fā)生生物反應(yīng)，形成特異識(shí)別待測(cè)抗原的檢測(cè)抗體標(biāo)記復(fù)合物與參照物標(biāo)記復(fù)合物。將檢測(cè)樣本加至標(biāo)記復(fù)合物中，待測(cè)物與檢測(cè)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)形成檢測(cè)抗體標(biāo)記免疫復(fù)合物，此時(shí)存在著檢測(cè)抗體標(biāo)記免疫復(fù)合物和參照標(biāo)記復(fù)合物，再加樣至樣品墊上，檢測(cè)抗體標(biāo)記免疫復(fù)合物與檢測(cè)線(xiàn)上的捕獲抗體反應(yīng)，即形成近紅外熒光染料偶聯(lián)鏈霉親和素生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體-待測(cè)抗原-捕獲抗體形式的雙抗體夾心復(fù)合物，參照標(biāo)記復(fù)合物即羊抗兔IgG復(fù)合物與質(zhì)控線(xiàn)上蛋白兔IgG發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用紅外熒光掃描儀讀取檢測(cè)卡視窗的熒光強(qiáng)度，取檢測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)的熒光強(qiáng)度的比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行計(jì)算。參照標(biāo)記復(fù)合物與質(zhì)控線(xiàn)上的固定蛋白均不與檢測(cè)體系發(fā)生反應(yīng)，因此質(zhì)控線(xiàn)是作為內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，也可作為實(shí)驗(yàn)有效性的判斷依據(jù)。

本發(fā)明中使用的熒光掃描儀為常用的實(shí)驗(yàn)掃描儀器，例如美國(guó)LI-COR公司的Odyssey近紅外成像系統(tǒng)。

本發(fā)明與其他側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)方法比較，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：

材料背景信號(hào)和生物背景信號(hào)低，信噪比高，檢測(cè)靈敏度高。目前的側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)法很多是用一般的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。但是，在一般的熒光染料的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，生物物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生干擾背景熒光，同時(shí)硝酸纖維素膜也會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的干擾背景熒光，因此，使用基于硝酸纖維素為固相和一般熒光染料標(biāo)記的蛋白芯片檢測(cè)靈敏度低，檢測(cè)結(jié)果不夠穩(wěn)定。而用近紅外標(biāo)記，則具有低背景的優(yōu)勢(shì)，而且具有很高的信噪比，從而獲得很高的檢測(cè)靈敏度；同時(shí)引入生物素鏈霉親和素系統(tǒng)，每個(gè)鏈霉親和素分子有四個(gè)生物素結(jié)合部位，可同時(shí)以多價(jià)形式結(jié)合生物素化的大分子，這種結(jié)合具有極高的親和力，親和常數(shù)可為抗原-抗體反應(yīng)的百萬(wàn)倍，其反應(yīng)呈高度專(zhuān)一性，不可逆反應(yīng)性，產(chǎn)物的穩(wěn)定性高，此系統(tǒng)的上述優(yōu)點(diǎn)可極大地提高檢測(cè)方法的靈敏度和準(zhǔn)確性，而且實(shí)驗(yàn)成本低。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明測(cè)試條的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為近紅外熒光檢測(cè)儀掃描測(cè)試條的視窗圖。

圖3為CRP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑，包括圖1所示的測(cè)試條，該測(cè)試條包括采用PVC材料制成的底板100和按樣品流動(dòng)方向依次設(shè)置在底板100上的樣品墊200、硝酸纖維素膜300、吸水墊400，在硝酸纖維素膜300上設(shè)置有檢測(cè)線(xiàn)T和質(zhì)控線(xiàn)C，按樣品流動(dòng)方向檢測(cè)線(xiàn)T在前，質(zhì)控線(xiàn)C在后，檢測(cè)線(xiàn)T上包被有檢測(cè)線(xiàn)蛋白，質(zhì)控線(xiàn)C上包被有質(zhì)控線(xiàn)蛋白。

下面以雙抗體夾心法檢測(cè)C反應(yīng)蛋白(CRP)為例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

1.生物素標(biāo)記CRP單克隆抗體和羊抗兔IgG多克隆抗體

CRP單克隆抗體(深圳菲鵬)和羊抗兔IgG多克隆抗體(杭州隆基公司)分別用PBS透析，按照每1ml 2mg/ml抗體，加入約27ul 10m生物素?；?美國(guó)Thermo Fisher Scientifc公司)的比例混合，室溫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將標(biāo)記物置入生物素標(biāo)記試劑盒提供的脫鹽柱純化，以去除多余的生物素。收集蛋白樣品，加入0.005％ProClin300防腐，2-8℃保存。

2.制備凍干品

取出近紅外熒光鏈霉親和素偶聯(lián)物1mg/ml，用稀釋液(1％BSA，0.02％ProClin300，PBS)稀釋至0.8ug/ml；將生物素標(biāo)記CRP抗體用稀釋液(1％BSA，0.02％ProClin300，PBS)稀釋至2.5ug/ml，再在其中加入生物素標(biāo)記羊抗兔IgG多克隆抗體使其濃度為0.2ug/ml；將近紅外熒光鏈霉親和素和生物素標(biāo)記物等體積混勻，將液體加至棕色凍干玻璃瓶中，凍干后取出。

3.測(cè)試條制作

1)配制劃膜稀釋液：Na₂HPO₄ 0.142％，KH₂PO₄ 0.027％，蔗糖2％，ProClin3000.02％，調(diào)節(jié)PH至7.4；

2)將CRP包被抗體(深圳菲鵬公司)用劃膜稀釋液配制至0.8mg/ml，兔IgG配制至0.5mg/ml；

3)將硝酸纖維素膜300粘貼到底板100上，用劃膜儀將配制的CRP包被抗體和兔IgG包被至硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)線(xiàn)T和質(zhì)控線(xiàn)C，37℃干燥24h；

4)將樣品墊200和吸水墊400分別粘貼在底板100上并位于硝酸纖維素膜的兩側(cè)，配示意圖如圖1；

5)切割后形成測(cè)試條，將測(cè)試條與步驟2)的凍干品一起放入包裝袋內(nèi)裝配成免疫側(cè)向?qū)游龆繖z測(cè)試劑，包裝封口備用。

4.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

1)試驗(yàn)前準(zhǔn)備：標(biāo)準(zhǔn)品、封口的檢測(cè)卡、凍干品恢復(fù)至室溫；

2)配制加樣液：將CRP標(biāo)準(zhǔn)品(羅氏生物公司)37.1ug/ml取3ul用稀釋液(1％BSA，PBS)稀釋至0.5565ug/ml，再對(duì)半稀釋?zhuān)鳚舛葹?.27825ug/ml、0.139125ug/ml、0.0695625ug/ml、0.03478125ug/ml、0.01739062ug/ml、8.69531ng/ml、4.347655ng/ml、2.173828ng/ml；取凍干復(fù)溶劑，每瓶加200ul；取各標(biāo)準(zhǔn)品50ul加到100ul凍干復(fù)溶液中，混勻，此時(shí)各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.1855ug/ml、0.092ug/ml、0.046ug/ml、0.023ug/ml、0.0115ug/ml、5.75ng/ml、2.875ng/ml、1.4375ng/ml、0.71875ng/ml；

3)加樣：吸取加樣液100ul加至檢測(cè)卡的加樣孔，計(jì)時(shí)15min；

4)閱讀，分析：將檢測(cè)卡放入紅外掃描儀用熒光強(qiáng)度I＝L0.5掃描檢測(cè)卡視窗，附圖2所示掃描圖。每個(gè)濃度做兩次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，取檢測(cè)線(xiàn)與質(zhì)控線(xiàn)信號(hào)比值(T/C)的均值與濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，具體數(shù)據(jù)如下表1所示，附標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)示意圖如圖3。

表1

5.檢測(cè)臨床樣本

1)試驗(yàn)前準(zhǔn)備：臨床樣本、封口的檢測(cè)卡、凍干品恢復(fù)至室溫；

2)制備加樣液：樣本用稀釋液300倍稀釋?zhuān)粌龈善芳訌?fù)溶劑200ul復(fù)溶；取出樣本50ul加到100ul凍干液中，混勻；

3)加樣：計(jì)時(shí)吸取加樣液100ul加至檢測(cè)卡的加樣孔，計(jì)時(shí)15min；

4)閱讀，分析：將檢測(cè)卡放入紅外掃描儀用熒光強(qiáng)度I＝L0.5讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度值。具體數(shù)據(jù)如下表2所示

表2