本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種免疫傳感器對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

電化學(xué)免疫傳感器的概述

電化學(xué)免疫傳感器是免疫分析方法中一種常用的分析方法，是通過(guò)抗體與抗原之間的特異性結(jié)合識(shí)別作用，應(yīng)用電極作為傳感的元件，形成具有免疫性復(fù)合物負(fù)載在電極表面，并對(duì)分析物進(jìn)行定量檢測(cè)與研究。免疫傳感器具備很多優(yōu)點(diǎn)，它具有檢測(cè)快速方便、靈敏度高、價(jià)格低廉、選擇性好、專(zhuān)一性強(qiáng)、適合聯(lián)機(jī)化在線檢測(cè)，并可實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品的檢測(cè)。迄今為止，免疫傳感器在環(huán)境檢查、臨床醫(yī)學(xué)和食品安全工業(yè)等等領(lǐng)域都有重要用途。

黃曲霉毒素的概述

黃曲霉毒素是一種具有較強(qiáng)的毒素，迄今為止，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將黃曲霉毒素列為致癌物質(zhì)系列。常見(jiàn)的黃曲霉毒素種類(lèi)有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2等十幾種結(jié)構(gòu)相似的化合物，其結(jié)構(gòu)特征為都含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?。黃曲霉毒素極易溶解在機(jī)溶劑中，如甲醇和氯仿等，不易溶于水。黃曲霉毒素會(huì)損害人體的器官，抑制人體的免疫機(jī)能，而且黃曲霉毒素中AFB1毒性是最大的，是對(duì)人類(lèi)健康危害造成非常嚴(yán)重的一類(lèi)霉毒素。

黃曲霉毒素的檢測(cè)方法

目前黃曲霉的檢測(cè)方法有薄層層析法、微柱層析法、高效液相色譜法、免疫學(xué)方法、電化學(xué)免疫檢測(cè)法。其中薄層層析法對(duì)樣品處理存在所需時(shí)間多，抗干擾能力弱；微柱層析法測(cè)定樣品是需要對(duì)樣品組分進(jìn)行分離；采用高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所使用的化學(xué)試劑和處理途，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)造成影響，技術(shù)水平要求相對(duì)較高；而電化學(xué)免疫檢測(cè)法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈 敏度好、選擇活性性好，更適合用于微量元素的檢測(cè)。

石墨烯的概述

石墨烯(Graphene，G)是一種新型碳納米材料，由單層碳原子排列堆積而成單層二維蜂窩狀晶體，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，電阻率極低，使得石墨烯具備了優(yōu)良的導(dǎo)電性。迄今為止，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)石墨烯表面呈惰性，化學(xué)穩(wěn)定性較高，并且石墨烯之間存在較強(qiáng)的范德華力，容易產(chǎn)生聚集，很難溶于水及其他溶劑中。為了充分發(fā)揮石墨烯優(yōu)良的性質(zhì)，必須要對(duì)石墨烯進(jìn)行表面的改性。通過(guò)引入特定官能團(tuán)，可賦予石墨烯新的性質(zhì)，進(jìn)一步拓展它的應(yīng)用領(lǐng)域。

聚苯胺的概述

聚苯胺(PANI)是近年來(lái)一個(gè)常用的導(dǎo)電聚合物，根據(jù)苯胺單體PANI具有良好的導(dǎo)電性、以及良好的穩(wěn)定性，能使石墨烯的片層間隙增大，可以阻止石墨烯片層之間的團(tuán)聚，將其用于電化學(xué)免疫傳感器領(lǐng)域，有利于構(gòu)建的傳感器的電化學(xué)性能的提高。

納米金概述

金納米材料具有較高比表面積、高表面反應(yīng)活性、高催化效率和強(qiáng)吸附能力等許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。納米金還具有很好的生物相容性，將其用于修飾電極制備電化學(xué)免疫傳感器不但可以提高電極的導(dǎo)電性，還可以有效的降低反應(yīng)電位，所以有效的提高了電極的靈敏度和選擇性。因?yàn)榧{米金的生物相容性可以為生物分子提供生物適應(yīng)性的微環(huán)境，保持了生物分子的活性，因此金納米材料修飾的電極不影響蛋白酶的活性。

針對(duì)黃曲霉毒素具有較強(qiáng)的毒性，檢測(cè)要求相對(duì)較高，尋找出檢測(cè)黃曲霉毒素B1最簡(jiǎn)單，耗費(fèi)較少的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種免疫傳感器對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，旨在解決背景技術(shù)中存在的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種免疫傳感器對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，該免疫傳感器對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法包括：

將制備的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料修飾在金電極表面，采用交流阻抗法、循環(huán)伏安法檢測(cè)電極的電化學(xué)性能；

黃曲霉免疫傳感器構(gòu)建，在金電極表面滴涂Au/PANI/GN納米雜化物，晾干成膜后孵育anti-AFB1，然后用牛血清蛋白溶液封閉非特異性活性位點(diǎn)，接著孵育一系列不同濃度的AFB1用于和抗體特異性識(shí)別，采用方波循環(huán)伏安法，對(duì)anti-AFB1的濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行條件優(yōu)化、對(duì)緩沖溶液的pH和AFB1免疫反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，篩選最佳優(yōu)化條件；

采用交流阻抗法(EIS)和方波循環(huán)伏安法(SWV)，對(duì)不同濃度的AFB1進(jìn)行定量分析測(cè)定。

Au/PANI/GN制備方法包括：

PANI/GN復(fù)合物的制備：

取200μL苯胺溶于200mL CH₂Cl₂中，轉(zhuǎn)移至600mL反應(yīng)瓶中作為底部有機(jī)層；將6.0mg GN和200mg FeCl₃·6H₂O均勻分散在200mL HCl溶液中超聲分散2h后加入26.5μL H₂O₂，將超聲分散2h后加入26.5μL H₂O₂的混合溶液緩慢移入有機(jī)溶液的上層，建立界面體系；在冰浴條件下反應(yīng)48h后，收集上層溶液，用二次水離心清洗，最后將產(chǎn)物溶解在二次水中，超聲分散20min，即制得分散均勻的PANI/GN復(fù)合納米材料；

不同配比的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料的制備：

取10mg PANI/GN加入燒杯中，超聲分散均勻，分別加入10mg、40mgHAuCl₄.2H₂O和14.705mg檸檬酸三鈉，加水至20mL，超聲分散均勻，逐滴加入冰浴的0.6mL 0.1mol/L NaBH₄攪拌12h后，二次蒸餾水離心清洗，分別得到反應(yīng)原料中PANI/GN與氯金酸質(zhì)量比為1:1和1:4的Au/PANI/GN納米雜化物，備用。

黃曲霉毒素免疫傳感器的構(gòu)建方法為：

在金電極表面修飾7μL Au/PANI/GN復(fù)合你們材料溶液，室溫晾干；用二次蒸餾水清洗，室溫下晾干成膜，在電極表面滴涂10μL 150μg/mL anti-AFB1溶液，在37℃下孵育40min；用二次蒸餾水清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂10μL 2.0％牛血清蛋白BSA溶液封閉非特異性活性位點(diǎn)，于37℃下孵育40min，清洗干凈；將一系列不同濃度的AFB1抗原用于和抗體的特異性識(shí)別，37℃孵育30min，二次蒸餾水清洗干凈，于4℃冰箱中存儲(chǔ)備用。

對(duì)Au/PANI/GN復(fù)合納米材料的表征包括：采用紫外光譜對(duì)制備的材料進(jìn)行表征、采用透射電鏡對(duì)不同金納米粒子負(fù)載率的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料進(jìn)行形貌表征。

采用交流阻抗法、循環(huán)伏安法檢測(cè)電極的電化學(xué)性能方法中，以Fe(CN)₆^3-/4-作為氧化還原探針，采用電化學(xué)交流阻抗法和循環(huán)伏安法，分析不同材料修飾電極在含有0.1M KCl的10.0mM Fe(CN)₆^3-/4-溶液中的循環(huán)伏安行為，掃描速率為100mV/s。

anti-AFB1濃度的優(yōu)化方法為：

將7μL Au/PANI/GN修飾于金電極上，固載不同濃度的anti-AFB1 10μL 25μg.mL^-1、50μg.mL^-1、100μg.mL^-1、150μg.mL^-1、200μg.mL^-1將構(gòu)建的傳感器進(jìn)行孵育，采用方波伏安法檢測(cè)的電流響應(yīng)隨濃度的變化篩選優(yōu)化條件，anti-AFB1的最佳濃度為150μg mL^-1；

磷酸鹽緩沖溶液pH的優(yōu)化方法為：

首先，固定anti-AFB1的濃度為150μg.mL^-1，優(yōu)化不同pH，根據(jù)蛋白質(zhì)的活性與溶液的pH的有聯(lián)系原理，底液的pH控制在5.0到8.0之間，測(cè)定不同pH溶液下電化學(xué)免疫傳感器反應(yīng)的響應(yīng)電流值，溶液的最佳pH為7.0；

anti-AFB1孵育時(shí)間優(yōu)化方法為：

固定anti-AFB1濃度為150μg mL^-1，分別孵育20min、30min、40min、50min、60min，在pH 7.0PBS溶液中進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)電流響應(yīng)值與孵育時(shí)間的關(guān)系，對(duì)anti-AFB1孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化anti-AFB1的最佳孵育時(shí)間為50min；

AFB1免疫時(shí)間的優(yōu)化方法為：

固定anti-AFB1濃度為150μg mL^-1，孵育時(shí)間為50min，溶液pH為7.0，AFB1的孵育時(shí)間分別為20min、30min、40min、50min、60min，采用上述同樣的方法構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器，根據(jù)方波循環(huán)伏安峰電流達(dá)到最小值處于相對(duì)穩(wěn)定的平臺(tái)這一條件篩選最佳免疫反應(yīng)時(shí)間，50min為最佳免疫時(shí)間。

黃曲霉毒素的檢測(cè)方法為：

基于上述最佳條件構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器，在金電極表面修飾7μLAu/PANI/GN復(fù)合你們材料溶液，室溫晾干；用二次蒸餾水清洗，室溫下晾干成膜，在上述電極表面滴涂10μL 150μg/mL anti-AFB1溶液，在37℃下孵育40min；用二次蒸餾水清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂10μL 2.0％牛血清蛋白BSA溶液封閉非特異性活性位點(diǎn)，于37℃下孵育40min，清洗干凈；將一系列不同濃度的AFB1用于和抗體的特異性識(shí)別，37℃孵育30min，二次蒸餾水清洗干凈，于4℃冰箱中存儲(chǔ)備用。采用交流阻抗法表征構(gòu)建的免疫傳感器，并且采用方波循環(huán)伏安法對(duì)不同濃度AFB1進(jìn)行檢測(cè)，以免疫反應(yīng)電流響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，AFB1濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，檢測(cè)線性范圍為0.05ng/mL-25ng/mL，檢出限為0.017ng/mL，線性方程為y＝-0.177x+4.28，線性相關(guān)系數(shù)為R²＝0.9916。

本發(fā)明對(duì)基于Au/PANI/GN構(gòu)建的不同類(lèi)型的電化學(xué)傳感器進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試，循環(huán)伏安和阻抗測(cè)試均表面Au/PANI/GN復(fù)合納米材料修飾的電極具有較好的電化學(xué)導(dǎo)電性，有利于電化學(xué)性能的提高；

對(duì)構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器的anti-AFB1濃度、磷酸鹽緩沖溶液pH、anti-AFB1孵育時(shí)間、AFB1免疫反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化；

在最佳條件下，構(gòu)建免疫傳感器對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的線性范圍為0.05ng/mL-25ng/mL，檢出限為0.017ng/mL；本發(fā)明制備的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料具有良好的電化學(xué)活性及良好的檢測(cè)能力；

本發(fā)明制備的電化學(xué)免疫傳感器具有很寬的線性范圍和很低的檢出限，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB1的檢測(cè)，可以將該傳感器應(yīng)用于其他糧食作物和食用油中。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的免疫傳感器對(duì)AFB1的檢測(cè)方法流程圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的納米材料的紫外光譜圖；

圖中：曲線(a)為GN，曲線(b)為PANI/GN，曲線(c)為Au/PANI/GN，曲線(d)為純PANI的紫外光譜圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的不同金納米粒子負(fù)載率的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料透射電鏡圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的Au/PANI/GN修飾的金電極(a)，anti-AFB1/Au/PANI/GN修飾的金電極(b)，BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN修飾的金電極(c)，AFB1/BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN修飾的金電極(d)，在10.0mMFe(CN)₆^3-/4-溶液中含有0.1M KCl的循環(huán)伏安曲線圖(A)和電化學(xué)交流阻抗圖(B)；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的AFB1/BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN構(gòu)建的免疫傳感器中抗體濃度優(yōu)化圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的AFB1/BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN構(gòu)建的免疫傳感器中支持電解液的pH與響應(yīng)電流之間的關(guān)系圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的AFB1/BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN構(gòu)建的免疫傳感器中anti-AFB1的固定時(shí)間與響應(yīng)電流之間的關(guān)系圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的AFB1/BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN構(gòu)建的免疫傳感器中的抗原與抗體免疫反應(yīng)時(shí)間與響應(yīng)電流之間的關(guān)系圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的一系列不同濃度的AFB1構(gòu)建的AFB1/BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN免疫傳感器在10.0mM Fe(CN)₆^3-/4-溶液中測(cè)電化學(xué)交流阻抗值響應(yīng)，頻率范圍：1Hz～105kHz，電壓范圍：-0.4—0.8V；

圖10是本發(fā)明實(shí)施例提供的(A)為AFB1/BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN構(gòu)建的免疫傳感器，在pH＝7.0PBS溶液中檢測(cè)不同濃度黃曲霉毒素的方波伏安響應(yīng) 圖，(B)是目標(biāo)物AFB1的電流響應(yīng)與AFB1濃度建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

一種免疫傳感器對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法，該免疫傳感器對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)方法包括：

S101：將制備的Au/PANI/GN修飾在金電極表面，采用交流阻抗法、循環(huán)伏安法表征電極的電化學(xué)性能；

S102：黃曲霉免疫傳感器的構(gòu)建，在金電極表面滴涂Au/PANI/GN復(fù)合納米材料，再孵育anti-AFB1，用牛血清蛋白溶液封閉非特異性活性位點(diǎn)，接著孵育一系列不同濃度的AFB1抗原用于和抗體特異性識(shí)別，采用方波循環(huán)伏安法，對(duì)anti-AFB1濃度和孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化、對(duì)緩沖溶液的pH和AFB1抗原免疫反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，篩選最佳優(yōu)化條件；

S103：采用交流阻抗法(EIS)和方波循環(huán)伏安法(SWV)，對(duì)不同濃度的AFB1進(jìn)行定量分析測(cè)定。

本發(fā)明還包括不同配比的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料的制備方法：

取10mg PANI/GN加入燒杯中，超聲分散，分別加入10mg、40mgHAuCl₄·2H₂O和14.705mg檸檬酸三鈉，加水至20mL，超聲分散均勻，逐滴加入冰浴的0.6mL 0.1mol/L NaBH₄攪拌12h后，二次蒸餾水離心清洗，即可得到不同金納米粒子負(fù)載率的的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料，備用。

本發(fā)明的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料的表征：

1、紫外光譜表征

采用紫外光譜對(duì)制備的材料進(jìn)行表征，如2所示。從圖中可以看出，還原石墨烯在264nm處有最大吸收峰，純的PANI在338nm、430nm和642nm處 出現(xiàn)了三個(gè)吸收峰，PANI/GN在273nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，這個(gè)峰較還原石墨烯的紫外吸收紅移了9nm，這是由于PANI/GN之間的相互作用力所致。Au/PANI/GN復(fù)合納米材料在460nm處出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，這個(gè)峰是金納米的紫外吸收峰，且在700nm處出現(xiàn)了一個(gè)很寬的拖尾峰，在430nm處的吸收峰較PANI/GN的有所增強(qiáng)，表明所制備的復(fù)合納米材料是高度摻雜的，且PANI/GN與金納米離子間存在很強(qiáng)的相互作用。紫外表明，實(shí)驗(yàn)成功的制備了Au/PANI/GN復(fù)合納米材料，使PANI/GN的導(dǎo)電性增大。

2、透射電子顯微鏡表征

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)簡(jiǎn)單的改變反應(yīng)原料中PANI/GN與HAuCl₄·2H₂O的質(zhì)量比可以實(shí)現(xiàn)金納米粒子在PANI/GN復(fù)合納米材料表面的可控負(fù)載。采用透射電鏡(TEM)對(duì)不同金納米粒子負(fù)載率的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料進(jìn)行形貌表征。圖3A-C為反應(yīng)原料中PANI/GN與HAuCl₄·2H₂O的質(zhì)量比為1:4制備的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料的透射電鏡表征，從圖中可以看出粒徑大小均勻的金納米粒子均勻的分散在PANI/GN表面，并且金納米粒子全部原位生長(zhǎng)在PANI/GN表面，這可能是由于PANI作為一個(gè)良好的保護(hù)劑和連接劑有利于金納米粒子的均勻負(fù)載。從放大倍數(shù)更大的可以清晰的看出石墨烯的晶格條紋。從高分辨率的透射電鏡表征可以看出金納米粒子的粒徑大小為7.2nm。

在反應(yīng)原料中PANI/GN與HAuCl₄·2H₂O的質(zhì)量比為1:1制備的Au/PANI/GN復(fù)合納米材料的透射電鏡圖如圖3D-F所示，從圖3D可以看出粒徑大小均勻的金納米粒子均勻的分散在PANI/GN表面，并且金納米粒子全部原位生長(zhǎng)在PANI/GN表面。與圖3A相比，金納米粒子的負(fù)載率明顯減小，從放大倍數(shù)更大的可以清晰的看出石墨烯的晶格條紋。從高分辨率的透射電鏡表征(圖3F)可以看出金納米粒子的粒徑大小為6.03nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用本文的方法成功的實(shí)現(xiàn)了金納米粒子在PANI/GN面的均勻可控負(fù)載。

3、電極的電化學(xué)行為

以Fe(CN)₆^3-/4-作為氧化還原探針，采用電化學(xué)交流阻抗法和循環(huán)伏安法，考 察不同材料修飾電極在含有0.1M KCl的10.0mM Fe(CN)₆^3-/4-溶液中的循環(huán)伏安行為，掃描速率為100mV/s。從圖4所示，當(dāng)裸金電極表面被Au/PANI/GN復(fù)合納米材料修飾后，有一對(duì)可逆的氧化還原峰，還原峰和氧化峰值電流明顯增大，電位差ΔEp為98mV(如圖4曲線a)，并且從阻抗分析可以看出Au/PANI/GN復(fù)合納米材料修飾的電極的電阻為252.4Ω。結(jié)果說(shuō)明修飾Au/PANI/GN能夠提高溶液中Fe(CN)₆^3-/4-在電極表面發(fā)生電子的轉(zhuǎn)移，而且，提供了更大的比表面積，孵育anti-AFB1后，因anti-AFB1對(duì)Fe(CN)₆^3-/4-的氧化還原無(wú)任何催化作用，由于對(duì)電極的修飾導(dǎo)致電子的轉(zhuǎn)移受到一定在阻礙，使得anti-AFB1/Au/PANI/GN抗體的峰電流降低，其電位差ΔEp為126mV，(如圖4曲線b)，并且從阻抗分析可以看出anti-AFB1/Au/PANI/GN復(fù)合納米材料修飾的電極的電阻為282.1Ω，阻抗值增大，表明anti-AFB1成功的固定在了免疫傳感器上。當(dāng)繼續(xù)修飾牛血清蛋白(BSA)到上述電極后，峰電流值進(jìn)一步降低，其電位差ΔEp為133mV，(如圖4曲線c)，并且從阻抗分析可以看出BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN復(fù)合納米材料修飾的電極的電阻為436.9Ω，阻抗值增大，表明BSA成功的固定在了免疫傳感器上。繼續(xù)把AFB1固定在電極上后，峰電流進(jìn)一步降低，其電位差ΔEp為145mV(如圖4曲線d)，并且從阻抗分析可以看出AFB1/BSA/anti-AFB1/Au/PANI/GN復(fù)合納米材料修飾的電極的電阻為443.2Ω，阻抗值增大，表明AFB1成功的固定在了免疫傳感器上。

4、檢測(cè)AFB1

在電化學(xué)免疫中，電化學(xué)信號(hào)主要依賴(lài)于修飾膜的制備過(guò)程，眾所周知，蛋白質(zhì)的活性與抗體濃度、孵育時(shí)間，抗原免疫時(shí)間與溶液pH密切相關(guān)。

anti-AFB1濃度的優(yōu)化：

為得到更好的測(cè)驗(yàn)結(jié)果，分析最佳a(bǔ)nti-AFB1濃度，如圖2所示，將7μLAu/PANI/GN修飾于金電極上，固載不同濃度的anti-AFB1 10μL 25μg.mL^-1、50μg.mL^-1、100μg.mL^-1、150μg.mL^-1、200μg.mL^-1將構(gòu)建的傳感器進(jìn)行孵育，采用SWV檢測(cè)的電流響應(yīng)隨濃度的增加而逐漸減小，并在150μg mL^-1最小值隨 后處于相對(duì)平穩(wěn)，選擇150μg mL^-1為anti-AFB1的最佳濃度。

溶液pH的優(yōu)化：

為了優(yōu)化免疫反應(yīng)的條件，首先，固定anti-AFB1的濃度為150μg.mL^-1，優(yōu)化不同pH條件，蛋白質(zhì)的活性與溶液的pH有著非常重要的聯(lián)系，優(yōu)化抗體溶液的pH濃度尤為重要，如圖6所示，介質(zhì)的pH溶液控制在5.0到8.0之間，測(cè)定不同酸溶液濃度下電化學(xué)免疫傳感器反應(yīng)的響應(yīng)電流值。結(jié)果顯示，當(dāng)介質(zhì)pH<7時(shí)，免疫傳感器的響應(yīng)電流值隨著pH濃度的增大而逐漸減??；當(dāng)pH>7時(shí)，免疫傳感器的響應(yīng)電流值隨著pH濃度的增大而逐漸增大并趨于穩(wěn)定狀態(tài)，電化學(xué)免疫傳感器的最大響應(yīng)在pH＝7.0處，因此，選擇7.0作為本實(shí)驗(yàn)的最佳pH。

anti-AFB1孵育時(shí)間優(yōu)化：

孵育時(shí)間也是影響AFB1檢測(cè)有著重要影響的因素，因此考察孵育時(shí)間對(duì)免疫反應(yīng)的影響，如圖7所示，固定anti-AFB1濃度為150μg mL^-1，孵育時(shí)間從20min、30min、40min、50min、60min，在pH 7.0PBS溶液中檢測(cè)，電流響應(yīng)值隨著anti-AFB1固定時(shí)間的增加呈降低趨勢(shì)，并在50min時(shí)達(dá)到最小值后處于相對(duì)穩(wěn)定的平臺(tái)，50min被選擇為最佳固定時(shí)間。

AFB1免疫時(shí)間的優(yōu)化：

為研究最佳AFB1孵育時(shí)間，采用同樣的方法在上述最佳條件下構(gòu)建免疫傳感器，如圖8所示，在pH 7.0PBS溶液中，AFB1免疫時(shí)間分別為20min、30min、40min、50min、60min，隨著AFB1免疫反應(yīng)時(shí)間的增加峰電流呈下降趨勢(shì)，并在50min達(dá)到最小值后處于相對(duì)穩(wěn)定的平臺(tái)，50min被選擇為最佳免疫時(shí)間。

AFB1的檢測(cè)：

基于上述優(yōu)化條件構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器分別對(duì)不同濃度的AFB1(0.025ng/mL、0.05ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL)進(jìn) 行檢測(cè)。首先采用阻抗法對(duì)不同濃度的AFB1進(jìn)行檢測(cè)，如圖9所示隨著AFB1濃度的增加，其阻抗值依次增加。接著采用方波伏安法對(duì)基于Au/PANI/GN構(gòu)建的免疫傳感器對(duì)不同濃度AFB1進(jìn)行檢測(cè)，從圖10A中看出，隨著AFB1濃度增大，峰電流依次減小，以免疫反應(yīng)電流響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，AFB1濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(圖10B)，可以看出檢測(cè)線性范圍為0.05ng/mL-25ng/mL，檢出限為0.017ng/mL。線性方程為y＝-0.177x+4.28，線性相關(guān)系數(shù)為R²＝0.9916。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，構(gòu)建的傳感器能夠成功的對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行檢測(cè)，并且檢測(cè)的線性范圍較寬，檢出限較低。說(shuō)明Au/PANI/GN復(fù)合納米材料具有良好的電化學(xué)活性及良好的檢測(cè)能力，可以將其拓展到食品科學(xué)領(lǐng)域。

本發(fā)明采用Au/PANI/GN復(fù)合納米材料構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器對(duì)AFB1進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的anti-AFB1濃度、溶液pH、anti-AFB1孵育時(shí)間、AFB1免疫反應(yīng)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明構(gòu)建的免疫傳感器具有很寬的線性范圍和很低的檢出限，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)AFB1的檢測(cè)，有望將該傳感器應(yīng)用于其他糧食作物和食用油中。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。