本發(fā)明屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用分子熒光差異加標(biāo)測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法。

背景技術(shù)：

維生素B₂，又稱核黃素，在光照和紫外線的照射下容易分解，耐酸不耐堿，可溶于氯化鈉水溶液，易溶于稀的氫氧化鈉溶液。核黃素對人體非常重要，當(dāng)缺乏時，代謝容易發(fā)生障礙。核黃素是水溶性的，不會在人體蓄積，要時常補充，雞蛋黃、黃豆、牛奶、酵母等中的含量較多。

雞蛋黃含有豐富的脂肪和蛋白質(zhì)，包括可幫助合成乙酰膽堿的卵磷脂，同時含有豐富的鈣磷鐵等礦物質(zhì)，以及豐富的脂溶性維生素，核黃素含量也比較高，因此，雞蛋黃很適宜嬰幼兒食用；維生素B₂藥片為黃色片劑，用于治療口角炎、唇干裂、舌炎、陰囊炎、結(jié)膜炎、脂溢性皮炎等。一般普通規(guī)格維生素B₂藥片含核黃素5毫克，藥品中還含有其他輔料，如淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂。由于核黃素對人體的重要性，而且核黃素易發(fā)生破壞，因此對其來源中含量的測定十分重要。

目前，核黃素的測定方法較多，如電化學(xué)法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、化學(xué)發(fā)光分析方法、示波極譜法、熒光光譜法等。這些方法都有各自的優(yōu)缺點，像電化學(xué)分析法雖然測定方法簡單，靈敏度較高，但準(zhǔn)確度和抗干擾能力較差。高效液相色譜法具有測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，但是樣品前處理過程較為繁瑣，測定較為費時，儀器較為昂貴，操作繁雜。毛細(xì)管電泳法有很好的靈敏度，但測定成本比較高。

分子熒光法是一種應(yīng)用較多的分子發(fā)光痕量分析技術(shù)，靈敏度高，檢出限低。由于核黃素溶液在430-440nm藍光照射下，發(fā)出較強的綠色熒光，因此可以利用分子熒光法測定核黃素的含量，但由于分子熒光法為痕量分析技術(shù)，熒光污染、環(huán)境因素以及樣品共存組分的影響是準(zhǔn)確、快速分析不可不考慮的主要問題。目前測定中較多的定量分析方法為工作標(biāo)準(zhǔn)曲線法和比較法；工作曲線法是將已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在待測定試液之外，在一定條件下測定其標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對發(fā)光強度，以發(fā)光強度對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制工作曲線，提供回歸方程和參數(shù)間的相關(guān)性，樣品試液與標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同的條件下測定，對照工作曲線或代入回歸方程求出試樣中待測組份的含量。該法的優(yōu)點是適用于大批量樣品的測定，缺點是①繪制工作曲線需配制5-7個標(biāo)準(zhǔn)溶液，耗費時間長，測定成本高；②工作曲線需要在一段工作時間之后重新繪制或校正；③是由于標(biāo)準(zhǔn)溶液中不含待測試樣，因此試樣測定時的背景與標(biāo)準(zhǔn)溶液的背景有較大差異，即使是用蒸餾水代替試液做全過程空白予以“扣空白”，也不能扣除試樣本身共存物質(zhì)可能引入的背景干擾，只能部分扣除蒸餾水、所用試劑、所用儀器引入的干擾，因標(biāo)準(zhǔn)溶液和試液的背景不一樣，分別測定不能保證在完全相同測定條件下完全扣除背景干擾，測定的準(zhǔn)確度將大打折扣；測定必須在線性范圍內(nèi)進行，如果被測定物質(zhì)的濃度過稀或過濃，有可能發(fā)生不同程度的離解、聚合、光解或其它副反應(yīng)而偏離線性關(guān)系，引入較大誤差甚至無法測定。比較法為：取一標(biāo)準(zhǔn)溶液，在和試液完全相同的條件下測定，同時測定試劑空白，根據(jù)在完全相同條件下測定時，濃度與發(fā)光值成正比的關(guān)系，可計算出試液的濃度，本法適用于單個樣品的快速測定，同時要求標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與待測液濃度盡量接近，該法的優(yōu)點是快速、簡便，分析成本相對低廉，無需作圖；缺點是①雖然扣除了試劑空白的發(fā)光值，但試液和標(biāo)準(zhǔn)溶液背景本底情況并不一致，若體系在測定過程中發(fā)生不同程度的化學(xué)副反應(yīng)或光化學(xué)副反應(yīng)，測定結(jié)果就會不同程度的引入誤差；②測定要求標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測試液的濃度盡量接近，對未知樣品實際上很難做到，往往需要預(yù)做試驗確定； 由一個標(biāo)準(zhǔn)溶液測定信號決定待測試液的濃度，標(biāo)準(zhǔn)溶液測定信號的準(zhǔn)確度嚴(yán)重影響測定結(jié)果。雞蛋黃和維生素B₂藥片如上所述，除了核黃素，還含有其他較多的共存物質(zhì)，尤其是雞蛋黃基體成分復(fù)雜，存在較高含量的蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)，無論是采用工作曲線法還是比較法，在測定時均容易受到共存蛋白質(zhì)等非測定組分的熒光干擾和各種熒光污染的影響；給測量結(jié)果帶來一定的誤差；所以，人們希望建立基體熒光干擾小或能夠有效消除干擾和熒光污染的測定核黃素的新型熒光分析方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于提供一種利用分子熒光差異加標(biāo)測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，該測定方法快速，有效消除了試液本底以及濃度差異所引入的干擾，準(zhǔn)確度得到保證，工作效率得到提高。

本發(fā)明的目的是以下述方式實現(xiàn)的：

一種利用分子熒光差異加標(biāo)測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，包括以下步驟：

（1）提取液制備：取樣品研磨，稱取m_樣，加入0.09-0.11moL/L鹽酸，蛋黃與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:(2.6-4)，VB₂藥片與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:(1200-1600)，壓力水解提取，壓力為（8.0-12.0）×10⁴Pa，時間為20-40min，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5-7.5，蛋黃試液中加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶加入量為蛋黃質(zhì)量的0.13-0.16%，VB₂藥片試液中加入淀粉酶溶液，淀粉酶加入量為VB₂藥片質(zhì)量的50-70%，然后在37-39℃保溫15-17h進行酶解；酶解液過濾，濾液定容至V_樣1；

（2）測定液制備：從V_樣1中取四份相同體積V_樣2的過濾試液，向第一份和第二份加入不同體積的核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量體積濃度為，第二份標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V_標(biāo)2大于第一份V_標(biāo)1，第四份加入低亞硫酸鈉將核黃素還原為無熒光物質(zhì)，作為空白，第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至V，然后加3-3.5% V的冰乙酸混勻，然后加入3-3.5% V的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為25-35g/L，混勻，靜置，滴加雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，振搖，使多余氧氣逸出，定容為V₁；

（3）測定：使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，將（1）處理好的試液在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下測定，第一份加標(biāo)試液相對發(fā)光值為I_標(biāo)1，第二份加標(biāo)試液相對發(fā)光值為I_標(biāo)2，第三份待測樣品試液相對發(fā)光值為I_樣，第四份本底空白背景相對發(fā)光值為I₀，蛋黃或VB₂藥片中核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω如式（1）；

優(yōu)選的，包括以下步驟：

（1）提取液制備：取樣品研磨，稱取m_樣，加入0.1moL/L鹽酸，蛋黃與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:3.5，VB₂藥片與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:1400，壓力水解提取，壓力為10.3×10⁴Pa，時間為30min，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，蛋黃試液中加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶加入量為蛋黃質(zhì)量的0.15%，VB₂藥片試液中加入淀粉酶溶液，淀粉酶加入量為VB₂藥片質(zhì)量的60%，然后在39℃保溫16h進行酶解；酶解液過濾，取濾液定容至V_樣1；

（2）測定液制備：從V_樣1中取至少四份相同體積V_樣2的過濾試液，向第一份和第二份加入不同體積的核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量體積濃度為，第二份標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V_標(biāo)2大于第一份V_標(biāo)1，第四份加入低亞硫酸鈉將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為本底空白，第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至V，加3.3%V的冰乙酸混勻，然后加入3.3%V的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為30g/L，混勻，靜置，滴加雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，最后加水定容至V₁后測定；

（3）測定：使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，將步驟（2）處理好的試液在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下測定。

進一步，所述的利用分子熒光差異加標(biāo)法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，包括以下步驟：

（1）提取液制備：取樣品研磨，稱取18-22g雞蛋黃或0.04-0.06gVB₂藥片，加入0.09-0.11moL/L鹽酸60-80 mL， 高壓水解提取，壓力為（8-12）×10⁴Pa，時間為20-40min，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5-7.5，蛋黃試液中加入2.5-3.5mL 9-11g/L木瓜蛋白酶溶液，VB₂藥片試液中加入2.5-3.5mL 9-11g/L淀粉酶溶液，然后在37-39℃保溫15-17h進行酶解；酶解液過濾，取濾液定容至V_樣1；

（2）測定液制備：從V_樣1中取至少四份相同體積V_樣2的過濾液，體積為0.5-10mL，向第一份和第二份加入不同體積的核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量體積濃度為，第二份標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V_標(biāo)2為第一份V_標(biāo)1的1.2-2倍；第四份加入低亞硫酸鈉將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為本底空白；第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至14-16mL，然后向每份過濾液中加入0.4-0.6mL冰乙酸混勻，然后加入0.4-0.6mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為25-35g/L，混勻，靜置，滴加雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，最后各管加水定容至24-26mL；

（3）測定：使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，將步驟（2）處理好的樣品試液在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下測定。

更進一步，包括以下步驟：

（1）提取液制備：取樣品研磨，稱取20g雞蛋黃或0.05gVB₂藥片，加入0.1moL/L鹽酸70mL，

壓力水解提取，壓力為10.3×10⁴Pa，時間為30min，然后用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，蛋黃試液中加入3mL 10g/L木瓜蛋白酶溶液，VB₂藥片試液中加入3mL 10g/L淀粉酶溶液，然后在39℃保溫16h進行酶解；酶解液過濾，取濾液定容至100mL；

（2）測定液制備：從100mL濾液中取至少四份相同體積的過濾試液，雞蛋黃濾液體積為10.00mL，VB₂藥片濾液體積為1.00mL，向第一份和第二份提取液中分別加入1.00mL和2.00mL濃度為 1μg/mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液；第四份加入低亞硫酸鈉將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為背景空白, 第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至15mL，然后向每份過濾液中加入0.5mL冰乙酸混勻，加入0.5mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為30g/L，混勻，靜置，滴加雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，最后加水定容至25mL；

（3）測定：使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，將步驟（2）處理好的樣品試液在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下測定。

如上所述的利用分子熒光差異加標(biāo)法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，步驟（1）中NaOH溶液濃度為1moL/L，步驟（2）中雙氧水質(zhì)量體積濃度為3%；蛋黃試液中加入低亞硫酸鈉溶液至少0.5mL，VB₂藥片試液中加入低亞硫酸鈉溶液至少5mL；低亞硫酸鈉溶液濃度為20g/100mL，所述木瓜蛋白酶和淀粉酶溶液采用2.5moL/L乙酸鈉溶液配制，

所述核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液分為濃度為25μg/mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液和濃度為1μg/mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液；核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程如下：將標(biāo)準(zhǔn)品核黃素粉末狀結(jié)晶置于真空干燥器中，用五氧化二磷干燥管和硅膠干燥劑聯(lián)合干燥24h后，準(zhǔn)確稱取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水，將容量瓶置于30-40℃溫水中搖動，待其溶解，冷至室溫，加水定容至2L，移至棕色瓶內(nèi)，加甲苯覆蓋于溶液表面，于4℃冰箱中保存；核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液配制過程為：吸取25μg/mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液2.00mL，置于50mL棕色容量瓶中，用水定容至刻度，4℃冰箱保存，保存時間為1周。

蛋黃還采用直接干燥法進行水分含量的測定。

本發(fā)明建立了一種快速、簡便定量測定蛋黃、維生素B₂藥片中的核黃素的新型分析方法，無需繪制工作曲線，只需通過使用兩個加標(biāo)試液即可計算待測組分在樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測定過程中完全消除了樣品試液中的背景干擾，同時采用兩個加入不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的加標(biāo)試液，因濃度不同可能產(chǎn)生的被測組分發(fā)生聚合、離解等副反應(yīng)可部分獲得補償或扣除，測定準(zhǔn)確度進一步得到保障和提高。本發(fā)明方法檢出限為5.76ng/mL，定量限為1.92×10^-2μg/mL。與國標(biāo)方法進行比較，經(jīng)過F檢驗法和t檢驗法，兩種方法的精密度和平均值都不存在顯著性差異；但本發(fā)明測定方法簡便、快速，扣除了樣品試液中背景發(fā)光值以及濃度差異所可能帶來的一部分干擾，提高了測定準(zhǔn)確度和工作效率，方法無需繪制工作曲線和過柱去雜質(zhì)，是適合樣品中核黃素含量測定的新型分析技術(shù)，有較強的創(chuàng)新性。

附圖說明

圖1是鹽酸體積對雞蛋黃試液相對熒光值的影響；

圖2是pH對雞蛋黃試液相對熒光值的影響；

圖3是低亞硫酸鈉體積對雞蛋黃試液相對熒光值的影響；

圖4是鹽酸體積對維生素B₂藥片試液相對熒光值的影響；

圖5是pH對維生素B₂藥片試液相對熒光值的影響；

圖6是低亞硫酸鈉體積對維生素B₂藥片試液相對熒光值的影響。

具體實施方式

實施例1

一種利用分子熒光加標(biāo)法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，包括以下步驟：

（1）提取液制備：取樣品研磨，稱取m_樣，加入0.09-0.11moL/L鹽酸，蛋黃與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:(2.6-4)，VB₂藥片與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:(1200-1600)，壓力水解提取，壓力為（8.0-12.0）×10⁴Pa，時間為20-40min，然后用1moL/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5-7.5，蛋黃試液中加入木瓜蛋白酶溶液，木瓜蛋白酶加入量為蛋黃質(zhì)量的0.13-0.16%，VB₂藥片試液中加入淀粉酶溶液，淀粉酶加入量為VB₂藥片質(zhì)量的50-70%，然后在37-39℃保溫15-17h進行酶解；酶解液用干濾紙過濾，取濾液定容至V_樣1；通過鹽酸水解和酶解，可讓樣品物料中結(jié)合態(tài)的核黃素游離出來，參與測定，提高分析數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性；雞蛋黃中加入木瓜蛋白酶可以酶解出與蛋白質(zhì)結(jié)合的核黃素；

（2）測定液制備：從V_樣1中取至少四份相同體積V_樣2的過濾試液，向第一份和第二份加入不同體積的核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量體積濃度為，第二份標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V_標(biāo)2大于第一份V_標(biāo)1，第四份加入低亞硫酸鈉將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為本底空白，第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至V，然后加3.3%V的冰乙酸混勻，然后加入3.3%V的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為30g/L，混勻，靜置，滴加雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，最后加高純水（石英亞沸去離子重蒸水，25℃時，pH6.63±0.02、電導(dǎo)率1.183μs/cm）定容至V₁后測定；加入冰乙酸可維持溶液處于弱酸環(huán)境，因核黃素在弱酸環(huán)境中較為穩(wěn)定；加入高錳酸鉀可氧化除去可能存在的一些較強還原性物質(zhì)的干擾，降低本底空白值；

（3）測定：使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，將步驟（2）處理好的樣品在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下測定，第一份加標(biāo)試液相對發(fā)光值為I_標(biāo)1，第二份加標(biāo)試液相對發(fā)光值為I_標(biāo)2，第三份待測樣品試液相對發(fā)光值為I_樣，第四份本底空白背景相對發(fā)光值為I₀，上述測定過程中四份試液在完全相同的條件下測定，根據(jù)待測組份的濃度與發(fā)光值成正比的關(guān)系，即：，為待測定容試液的質(zhì)量體積濃度，為兩份加標(biāo)定容試液的質(zhì)量體積濃度之差；可推算出蛋黃或VB₂藥片中核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω如式（1）；

本發(fā)明采用的差異加標(biāo)測定方法，其中I_{標(biāo)1、}I_標(biāo)2因與I₀使用相同的輔助試劑，因此，I_{標(biāo)1、}I_標(biāo)2也含有I₀值，但后I₀已抵消，由于待測試液和加標(biāo)后待測試液的測定本底一致，因此，采用該方法可消除試液背景對測定結(jié)果的干擾，提高了測定的準(zhǔn)確度。所以，該方法只需在相同條件下測出溶液的相對發(fā)光值，即可快速求得測定結(jié)果，無需繪制工作曲線和作圖求值，快速，簡便，極大的提高工作效率，采用兩個不同濃度的加標(biāo)試液確定待測組份的濃度，因樣品濃度不同可能產(chǎn)生的被測組分發(fā)生聚合、離解等副反應(yīng)可部分獲得補償和扣除，測定準(zhǔn)確度進一步得到保障和提高。

實施例2

利用分子熒光加標(biāo)法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，包括以下步驟：

（1）溶液配制：

核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（25μg/mL）：將標(biāo)準(zhǔn)品核黃素（上海金穗生物科技有限公司）粉末狀結(jié)晶置于真空干燥器中，經(jīng)過24h后，準(zhǔn)確稱取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水。將容量瓶置于溫水中搖動，待其溶解，冷至室溫，稀釋至2L，移至棕色瓶內(nèi)，加少許甲苯蓋于溶液表面，于冰箱中保存。

核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液（1μg/mL）；吸取2.00mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于50mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，避光，貯于4℃冰箱，可保存一周；此溶液每毫升相當(dāng)于1.00μg核黃素。

木瓜蛋白酶（10g/L）：木瓜蛋白酶（南寧龐博生物工程有限公司），用2.5mol/L乙酸鈉溶液配制；使用時，現(xiàn)配制。

淀粉酶（10g/L）：淀粉酶（邢臺萬達生物工程有限公司），用2.5mol/L乙酸鈉溶液配制。使用時現(xiàn)配制。

低亞硫酸鈉溶液（20g/100mL）：低亞硫酸鈉（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），此液用時用高純水（石英亞沸去離子重蒸水，25℃時，pH6.63±0.02、電導(dǎo)率1.183μs/cm）現(xiàn)配，保存在冰水浴中，4h內(nèi)有效。

（2）提取液制備（此實施例中樣品為蛋黃）：

取煮熟的雞蛋黃樣品研細(xì)，稱取20.0000g置于250mL錐形瓶中，加入0.1moL/L鹽酸70mL（蛋黃與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:3.5），攪拌直到顆粒物分散均勻，用40mL瓷坩堝為蓋扣住瓶口，置于壓力鍋水解提取，壓力為12.0×10⁴Pa，時間為30min，水解液冷卻后，用1moLNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，蛋黃試液中加入3mL 10g/L木瓜蛋白酶溶液（木瓜蛋白酶加入量為蛋黃質(zhì)量的0.15%），然后在39℃保溫16h進行酶解；酶解液用干濾紙過濾，取濾液定容至100mL；

（3）測定液制備

從V_樣1中取四份相同體積的過濾試液，體積為10.00mL，向第一份和第二份提取液中分別加入1.00mL和2.00mL濃度為 1μg/mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液；第四份加入0.5mL濃度為20g/100mL低亞硫酸鈉溶液將核黃素還原為無熒光物質(zhì)，作為本底空白；第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至15mL，然后向每份提取液中加入0.5mL（3.3%V）冰乙酸混勻，然后加入0.5mL（3.3%V）的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為30g/L，混勻，靜置，滴加3%雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，劇烈振搖樣品，使多余的氧氣溢出，最后加水定容至25mL；

（4）蛋黃中水分測定

為便于不同樣品間的結(jié)果比較，測定結(jié)果最好為干基含量；將煮熟雞蛋黃研細(xì)，稱取質(zhì)量約為5.0000g按照GB/T 5009.3-2010中直接干燥法進行水分測定，按照公式（2）計算出雞蛋黃水分的百分含量。

式中： ω₀為雞蛋黃的水分含量；m₁為樣品干燥前稱量瓶和樣品的質(zhì)量，g；m₂為稱量瓶和樣品干燥后的質(zhì)量，g；m₃為稱量瓶的質(zhì)量，g。

（5）熒光測定

使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，分別為452nm和530nm，將步驟（3）處理好的樣品在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下進行三次平行測定，然后取其平均值，根據(jù)公式（3）計算出干基雞蛋黃中核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω（μg /100g）；

實施例3

利用分子熒光加標(biāo)法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，包括以下步驟：

（1）溶液配制：

核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（25μg/mL）：將標(biāo)準(zhǔn)品核黃素（上海金穗生物科技有限公司）粉末狀結(jié)晶置于真空干燥器中，經(jīng)過24h后，準(zhǔn)確稱取50mg，置于2L容量瓶中，加入2.4mL冰乙酸和1.5mL水。將容量瓶置于溫水中搖動，待其溶解，冷至室溫，稀釋至2L，移至棕色瓶內(nèi)，加少許甲苯蓋于溶液表面，于冰箱中保存。

核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液（1μg/mL）；吸取2.00mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于50mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，避光，貯于4℃冰箱，可保存一周。此溶液每毫升相當(dāng)于1.00μg核黃素。

木瓜蛋白酶（10g/L）：木瓜蛋白酶（南寧龐博生物工程有限公司），用2.5mol/L乙酸鈉溶液配制。使用時，現(xiàn)配制。

淀粉酶（10g/L）：淀粉酶（邢臺萬達生物工程有限公司），用2.5mol/L乙酸鈉溶液配制。使用時現(xiàn)配制。

低亞硫酸鈉溶液（20g/100mL）：低亞硫酸鈉（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），此液用時用高純水（石英亞沸去離子重蒸水，25℃時，pH6.63±0.02、電導(dǎo)率1.183μs/cm）現(xiàn)配，保存在冰水浴中，4h內(nèi)有效。

（2）提取液制備（此實施例中樣品為VB₂藥片）：

取VB₂藥片研細(xì)干燥，稱取0.0500g倒入250mL錐形瓶中，加入0.1moL/L鹽酸70 mL（VB₂藥片與鹽酸溶液的質(zhì)量體積比(g/mL)為1:1400），攪拌直到顆粒物分散均勻，用40mL瓷坩堝為蓋扣住瓶口，置于壓力鍋水解提取，壓力為12.0×10⁴Pa，時間為30min，水解液冷卻后，用1moLNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，加入3mL 10g/L淀粉酶溶液（淀粉酶加入量為VB₂藥片質(zhì)量的60%），然后在39℃保溫16h進行酶解；酶解液用干濾紙過濾，取濾液定容至100mL；

（3）測定液制備

取四份相同體積的提取過濾液，體積為1.00mL，向第一份和第二份提取液中分別加入1.00mL L和2.00mL濃度為 1μg /mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液；第四份加入5mL濃度為20g/100mL低亞硫酸鈉溶液將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為本底空白；第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至15mL，然后向每份提取過濾液中加入0.5mL（3.3%V）冰乙酸混勻，然后加入0.5mL（3.3%V）的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為30g/L，混勻，靜置，滴加質(zhì)量體積濃度3%雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，劇烈振搖樣品，使多余的氧氣逸出，最后加水定容至25mL；

（4）熒光測定

使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，分別為452nm和530nm，將步驟（3）處理好的樣品在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下進行三次平行測定，然后取其平均值，根據(jù)公式（4）計算出VB₂藥片中核黃素的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)ω（g/100g）；

實施例4

利用分子熒光加標(biāo)法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，包括以下步驟：

（1）提取液制備（此實施例中樣品為蛋黃）：

取煮熟的雞蛋黃樣品研細(xì)，稱取22.0000g倒入250mL錐形瓶中，加入0.1moL/L鹽酸80 mL，攪拌直到顆粒物分散均勻，用40mL瓷坩堝為蓋扣住瓶口，置于壓力鍋水解提取，壓力為12.0×10⁴Pa，時間為30min，水解液冷卻后，用1moLNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，蛋黃試液中加入3.5mL 10g/L木瓜蛋白酶溶液，然后在39℃保溫16h進行酶解；酶解液用干濾紙過濾，取濾液定容至50mL；

（2）測定液制備

從V_樣1中取四份相同體積的過濾試液，體積為5.00mL，向第一份和第二份提取液中分別加入1.00mL和2.00mL濃度為 1μg/mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液；第四份加入0.5mL濃度為20g/100mL低亞硫酸鈉溶液將核黃素還原為無熒光物質(zhì)，作為本底空白；第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至16mL，然后向每份提取液中加入0.5mL冰乙酸混勻，然后加入0.5mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為30g/L，混勻，靜置，滴加3%雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，劇烈振搖樣品，使多余的氧氣溢出，最后加水定容至25mL；

（3）熒光測定

使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，分別為452nm和530nm，將步驟（3）處理好的樣品在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下進行三次平行測定，然后取其平均值，仿照公式（3）計算出干基雞蛋黃中核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω；其余同實施例2。

實施例5

利用分子熒光加標(biāo)法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，包括以下步驟：

（1）提取液制備（此實施例中樣品為蛋黃）：

取煮熟的雞蛋黃樣品研細(xì)，稱取20.0000g倒入250mL錐形瓶中，加入0.09moL/L鹽酸70mL，攪拌直到顆粒物分散均勻，用40mL瓷坩堝為蓋扣住瓶口，置于壓力鍋水解提取，壓力為10.0×10⁴Pa，時間為20min，水解液冷卻后，用1moLNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，蛋黃試液中加入2.5mL 11g/L木瓜蛋白酶溶液，然后在37℃保溫15h進行酶解；酶解液用干濾紙過濾，取濾液定容至100mL；

（2）測定液制備

從V_樣1中取四份相同體積的過濾試液，體積為10.00mL，向第一份和第二份提取液中分別加入4.00mL和5.00mL濃度為 1μg/mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液；第四份加入0.5mL濃度為20g/100mL低亞硫酸鈉溶液將核黃素還原為無熒光物質(zhì)，作為本底空白；第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至15mL，然后向每份提取液中加入0.6mL冰乙酸混勻，然后加入0.6mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為35g/L，混勻，靜置，滴加3%雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，劇烈振搖樣品，使多余的氧氣溢出，最后加水定容至24mL；

（3）熒光測定

使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，分別為452nm和530nm，將步驟（2）處理好的樣品在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下進行三次平行測定，然后取其平均值，仿照公式（3）計算出干基雞蛋黃中核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω；其余同實施例2。

實施例6

利用分子熒光加標(biāo)法測定蛋黃、VB₂藥片中核黃素的方法，包括以下步驟：

（1）提取液制備（此實施例中樣品為蛋黃）：

取煮熟的雞蛋黃樣品研細(xì)，稱取18.0000g倒入250mL錐形瓶中，加入0.11moL/L鹽酸60ml，攪拌直到顆粒物分散均勻，用40mL瓷坩堝為蓋扣住瓶口，置于壓力鍋水解提取，壓力為8.0×10⁴Pa，時間為40min，水解液冷卻后，用1moLNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，蛋黃試液中加入3mL 9g/L木瓜蛋白酶溶液，然后在37℃保溫17h進行酶解；酶解液用干濾紙過濾，取濾液定容至100mL；

（2）測定液制備

從V_樣1中取四份相同體積的過濾試液，體積為10.00mL，向第一份和第二份提取液中分別加入2.00mL和3.00mL濃度為 1μg/mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液；第四份加入0.5mL濃度為20g/100mL低亞硫酸鈉溶液將核黃素還原為無熒光物質(zhì)，作為本底空白；第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至14mL，然后向每份提取液中加入0.4mL冰乙酸混勻，然后加入0.4mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為25g/L，混勻，靜置，滴加3%雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，劇烈振搖樣品，使多余的氧氣溢出，最后加水定容至26mL；

（3）熒光測定

使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，分別為452nm和530nm，將步驟（2）處理好的樣品在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下進行三次平行測定，然后取其平均值，仿照公式（3）計算出干基雞蛋黃中核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω；其余同實施例2。。

實施例7

（1）提取液制備（此實施例中樣品為VB₂藥片）：

取VB₂藥片研細(xì)干燥，稱取0.0500g倒入250mL錐形瓶中，加入0.1moL/L鹽酸80mL，攪拌直到顆粒物分散均勻，用40mL瓷坩堝為蓋扣住瓶口，置于壓力鍋水解提取，壓力為12.0×10⁴Pa，時間為30min，水解液冷卻后，用1moLNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5.5，加入3.5mL 10g/L淀粉酶溶液，然后在39℃保溫16h進行酶解；酶解液用干濾紙過濾，取濾液定容至50mL；

（2）測定液制備

取四份相同體積的提取過濾液，體積為0.500mL，向第一份和第二份提取液中分別加入1.00mL L和2.00mL濃度為 1μg /mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液；第四份加入5mL濃度為20g/100mL低亞硫酸鈉溶液將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為本底空白；第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至16mL，然后向每份提取液中加入0.5mL冰乙酸混勻，然后加入0.5mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為30g/L，混勻，靜置，滴加3%雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，劇烈振搖樣品，使多余的氧氣溢出，最后加水定容至25mL；

（3）熒光測定

使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，分別為452nm和530nm，將步驟（2）處理好的樣品在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下進行三次平行測定，然后取其平均值，根據(jù)公式（1）計算出VB₂藥片中核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω。

實施例8

（1）提取液制備（此實施例中樣品為VB₂藥片）：

取VB₂藥片研細(xì)干燥，稱取0.0600g倒入250mL錐形瓶中，加入0.09moL/L鹽酸70 mL，攪拌直到顆粒物分散均勻，用40mL瓷坩堝為蓋扣住瓶口，置于壓力鍋水解提取，壓力為10.0×10⁴Pa，時間為20min，水解液冷卻后，用1moLNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，加入3mL 11g/L淀粉酶溶液，然后在37℃保溫15h進行酶解；酶解液用干濾紙過濾，取濾液定容至100mL；

（2）測定液制備

取四份相同體積的提取過濾液，體積為1.00mL，向第一份和第二份提取液中分別加入4.00mL L和5.00mL濃度為 1μg /mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液；第四份加入5mL濃度為20g/100mL低亞硫酸鈉溶液將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為本底空白；第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至15mL，然后向每份提取液中加入0.6mL冰乙酸混勻，然后加入0.6mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為35g/L，混勻，靜置，滴加3%雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，劇烈振搖樣品，使多余的氧氣溢出，最后加水定容至24mL；

（3）熒光測定

使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，分別為452nm和530nm，將步驟（2）處理好的樣品在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下進行三次平行測定，然后取其平均值，根據(jù)公式（1）計算出VB₂藥片中核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω。

實施例9

（1）提取液制備（此實施例中樣品為VB₂藥片）：

取VB₂藥片研細(xì)干燥，稱取0.0400g倒入250mL錐形瓶中，加入0.11moL/L鹽酸60 mL，攪拌直到顆粒物分散均勻，用40mL瓷坩堝為蓋扣住瓶口，置于壓力鍋水解提取，壓力為8.0×10⁴Pa，時間為40min，水解液冷卻后，用1moLNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.5，加入3mL 11g/L淀粉酶溶液，然后在37℃保溫15h進行酶解；酶解液用干濾紙過濾，取濾液定容至100mL；

（2）測定液制備

取四份相同體積的提取過濾液，體積為2.00mL，向第一份和第二份提取液中分別加入2.00mL L和3.00mL濃度為 1μg /mL的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液；第四份加入5mL濃度為20g/100mL低亞硫酸鈉溶液將核黃素還原為無熒光物質(zhì)作為本底空白；第三份既不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，也不加低亞硫酸鈉，為原過濾試液；各管加水至14mL，然后向每份提取液中加入0.4mL冰乙酸混勻，然后加入0.4mL的高錳酸鉀溶液，高錳酸鉀溶液濃度為25g/L，混勻，靜置，滴加3%雙氧水溶液至高錳酸鉀顏色褪去，劇烈振搖樣品，使多余的氧氣溢出，最后加水定容至26mL；

（3）熒光測定

使用核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液在熒光分光光度計下掃描圖譜，根據(jù)圖譜獲得最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長，分別為452nm和530nm，將步驟（2）處理好的樣品在最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長下進行三次平行測定，然后取其平均值，根據(jù)公式（1）計算出VB₂藥片中核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω。

試驗例

1、波長的選擇

無論核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度如何變化，發(fā)射波長和激發(fā)波長都不變。取配置好的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液（1μg/mL），掃描圖譜，根據(jù)圖譜可得最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長分別為452nm和530nm。因此，本實驗選取的最大激發(fā)波長和最大熒光發(fā)射波長分別為452nm和530nm。

2、單因素試驗

2.1蛋黃

2.1.1鹽酸提取溶液體積的確定

將煮熟的雞蛋黃研細(xì)，稱取質(zhì)量為20.0000g雞蛋黃置于250mL錐形瓶中，分別加入0. 1mol/L鹽酸50mL、60mL、70mL、80mL和90mL，攪拌直到顆粒物分散均勻，然后按照實施例2記載方法進行水解、酶解、過濾、氧化去雜質(zhì)后，定容至25mL，平行測定三次，取平均值，實驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，分別加入0.1mol/L鹽酸50mL、60mL、70mL、80mL、90mL，測得的相對熒光值相差不大。當(dāng)加入50mL、60mL、70mL鹽酸時相對熒光值呈上升趨勢，說明隨著鹽酸體積的增加，核黃素提取得越多；而加入70mL、80mL、90mL鹽酸時相對熒光值呈下降趨勢，表明隨著鹽酸體積的增加，酸度增大，穩(wěn)定性下降，說明核黃素只有在酸度適宜的溶液中穩(wěn)定。因此，加入0. 1mol/L鹽酸70mL提取液較為適宜。

2.1.2酶解pH的選擇

在0.1mol/L鹽酸為70mL的條件下，在pH4～8之間進行酶解。將煮熟的雞蛋黃研細(xì)，稱取質(zhì)量為20.0000g雞蛋黃于250mL錐形瓶中，分別加入0.1mol/L鹽酸70mL，按照實施例2記載方法進行水解提取，水解液冷卻后，滴加1moL/L氫氧化鈉，分別調(diào)節(jié)pH為4.500、5.500、6.500、7.500、8.500。然后按照實施例2記載方法進行酶解、過濾、氧化去雜質(zhì)后，平行測定三次，取平均值，實驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，pH分別為4.500、5.500、6.500、7.500、8.500時，測得的相對熒光值無明顯變化，而pH等于5.500時，測得的相對熒光值最大。因此，本實驗選擇pH=5.500為最佳實驗條件。

2.1.3低亞硫酸鈉溶液體積的選擇

將煮熟的雞蛋黃研細(xì)，稱取質(zhì)量為20.0000g雞蛋黃置于250mL錐形瓶中,然后按照實施例2記載方法進行水解提取、酶解、過濾和定容至100mL后，分別于6個25mL的帶蓋刻度試管中加入10mL雞蛋黃提取液，按照實施例2記載方法進行氧化去雜質(zhì)，定容至25mL，混勻后，加入0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL 20g/100mL低亞硫酸鈉溶液，混勻后，平行測定三次，取平均值，測定結(jié)果如圖3所示。

圖3可以看出，當(dāng)加入0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL低亞硫酸鈉時，相對熒光值隨著低亞硫酸鈉體積的增加而逐漸降低，說明隨著低亞硫酸鈉體積的增加，雞蛋黃中核黃素逐漸被還原為無熒光物質(zhì)；當(dāng)加入0.40mL、0.50mL、0.60mL低亞硫酸鈉時，相對熒光值隨著低亞硫酸鈉體積的增加而基本保持不變，說明雞蛋黃中的核黃素已經(jīng)全部被還原為無熒光物質(zhì)，而加入0.40mL低亞硫酸鈉時，雞蛋黃中核黃素已經(jīng)全部被還原了。因此，實驗選擇低亞硫酸鈉體積為0.50mL。

2.1.4核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液體積的確定

將煮熟的雞蛋黃研細(xì)，稱取質(zhì)量為20.0000g雞蛋黃于250mL錐形瓶中，按照實施例2記載方法進行水解提取、酶解、過濾、定容后，分別于8個25mL的帶蓋刻度試管中加入10.00mL雞蛋黃提取液，在3、4、5、6、7、8號管中分別加入1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL1μg/mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液，1號管和2號管不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，向1號管中加入0.50mL 20g/100mL低亞硫酸鈉溶液，各管加水至16mL，按照實施例2記載方法進行氧化去雜質(zhì)，定容至25mL，混勻，各管在相同條件下平行測定三次，取平均值，仿照公式(3)計算出干基雞蛋黃核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，然后和國標(biāo)方法進行比較，結(jié)果如表1。

由表1可知，加入不同體積核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液測得的干基雞蛋黃中核黃素含量相近。但加標(biāo)1.00mL、2.00mL測得雞蛋黃核黃素含量和國標(biāo)法最接近，因此，本實驗選擇加標(biāo)1.00mL、2.00mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液為最佳實驗條件。

2.2維生素B₂藥片

2.2.1鹽酸提取溶液體積的確定

稱取質(zhì)量約為0.0500g研細(xì)干燥的維生素B₂藥片于250mL錐形瓶中，分別加入0.1mol/L鹽酸50mL、60mL、70mL、80mL和90mL，攪拌直到顆粒物分散均勻，然后按照實施例3記載方法進行水解、酶解、過濾、氧化去雜質(zhì)后，定容至25mL，平行測定三次，取平均值，實驗結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，分別加入50mL、60mL、70mL、80mL、90mL鹽酸，測得的相對熒光值相差不大。當(dāng)加入50mL、60mL、70mL鹽酸時相對熒光值呈上升趨勢，說明隨著鹽酸體積的增加，核黃素提取得越多；而加入80mL、90mL鹽酸時相對熒光值呈下降趨勢，表明隨著鹽酸體積的增加，酸度增大，穩(wěn)定性下降，說明核黃素只有在酸度適宜的溶液中穩(wěn)定。因此，加入0.1mol/L鹽酸70mL為最佳實驗條件。

2.2.2酶解 pH的選擇

稱取0.0500g研細(xì)干燥的維生素B₂藥片于250mL錐形瓶中，分別加入 70mL0. 1mol/L鹽酸，按照實施例3記載方法進行水解，水解液冷卻后，滴加1moL/L氫氧化鈉，分別調(diào)節(jié)pH為4.500、5.500、6.500、7.500、8.500。然后按照實施例3記載方法進行酶解、過濾、氧化去雜質(zhì)后，平行測定三次，實驗結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，酶解液pH等于5.500時，測得的相對熒光值最大。因此，本實驗選擇pH=5.500為最佳實驗條件。

2.2.3低亞硫酸鈉溶液體積的確定

稱取0.0500g研細(xì)干燥的維生素B₂藥片倒入250mL錐形瓶中，按照實施例3記載方法進行水解提取、酶解、過濾和定容至100mL后，分別于6個25mL的帶蓋刻度試管中加入1.00mL維生素B₂藥片提取液，按照實施例3記載方法進行氧化去雜質(zhì)，定容至25mL，混勻后，加入1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL 20g/100mL低亞硫酸鈉溶液，混勻后，平行測定三次，取平均值，測定結(jié)果如圖6所示。

圖6可看出，加入1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL 低亞硫酸鈉時，相對熒光值隨著低亞硫酸鈉體積的增加而逐漸降低，說明隨著低亞硫酸鈉體積的增加，維生素B₂藥片中核黃素逐漸被還原為無熒光物質(zhì)；當(dāng)加入4.00mL、5.00mL、6.00mL低亞硫酸鈉時，相對熒光值隨著低亞硫酸鈉體積的增加而基本保持不變，說明維生素B₂藥片中的核黃素已經(jīng)全部被還原為無熒光物質(zhì)，實驗選擇低亞硫酸鈉體積為5.00mL。

2.2.4核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液體積的選擇

稱取0.0500g研細(xì)干燥的維生素B₂藥片于250mL錐形瓶中，按照實施例3記載方法進行水解提取、酶解、過濾、定容后，分別于10個25mL的帶蓋刻度試管中加入1.00mL維生素B₂藥片提取液，在3、4、5、6、7、8、9、10號管中分別加入1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL、8.00mL1μg/mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液，1號管和2號管不加標(biāo)準(zhǔn)溶液，向1號管中加入5.00mL20g/100mL低亞硫酸鈉溶液，加水至15mL，按照實施例3記載方法進行氧化去雜質(zhì)，定容至25mL，混勻?；靹蚝螅鳂悠吩谕耆嗤臈l件下平行測定三次，取平均值，根據(jù)公式(1)計算出維生素B₂藥片核黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，然后和國標(biāo)方法進行比較，結(jié)果如表2。

由表2可知，加入不同體積核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液測得的藥片中核黃素含量相近。但加標(biāo).1.00mL、2.00mL測得的結(jié)果和國標(biāo)最接近，因此，本實驗選擇加標(biāo)1.00mL、2.00mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液進行差異加標(biāo)測定。

3樣品的測定結(jié)果

在最佳條件下，對20.0000g雞蛋黃和0.0500g維生素B₂藥片分別平行測定6次，實驗結(jié)果如表3和表4。

由表3和表4可得干基雞蛋黃樣品中核黃素含量為402μg/100g，維生素B₂藥片核黃素含量為7.9 g/100g。雞蛋黃和維生素B₂藥片測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.88%和1.0%，測定精密度良好。

4加標(biāo)回收率

稱取20.0000g雞蛋黃和0.0500g維生素B₂藥片分別按照實施例2和實施例3進行樣品處理，然后進行加標(biāo)回收率實驗，實驗結(jié)果如下表：

由表5和表6可得雞蛋黃和維生素B₂藥片回收率分別為92%～104%和90%～96%。

5檢出限和定量限

取熒光值接近于空白，濃度較低的核黃素標(biāo)準(zhǔn)使用液進行11次平行測定，計算出標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢出限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限。得核黃素檢出限為5.79ng/mL，定量限為1.92×10^-2μg/mL。

6測定結(jié)果方法驗證

分別按照實施例2和實施例3樣品測定方法對雞蛋黃和VB₂藥片進行測定，對同一樣品和國標(biāo)法對照分析，各進行6次平行測定，檢驗無可疑值后，取平均值報告，結(jié)果如表7。

根據(jù)表7分子熒光差異加標(biāo)法和國標(biāo)法的標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均值，進行F檢驗和t檢驗：

F檢驗法

雞蛋黃

維生素B₂藥片

計算自由度f：f_大=n－1=5，f_小=n－1=5，查相關(guān)表得F_表=5.05，計算出的F₁值和F₂值都小于表中的F值。所以，這兩種方法的精密度不存在顯著性差異，結(jié)論的置信度為 95%。然后進行t檢驗法。

t檢驗法

雞蛋黃

維生素B₂藥片

計算自由度：f=6＋6－2=10，查相關(guān)表，置信度為95%時，t_表=2.23，t₁值和t₂值都小于t_表值。所以，兩種方法的平均值不存在顯著的系統(tǒng)誤差。

經(jīng)過F檢驗和t檢驗，分子熒光差異加標(biāo)法和國標(biāo)法的精密度和平均值都不存在顯著性差異，結(jié)論的置信度為 95%。分子熒光差異加標(biāo)法測量結(jié)果準(zhǔn)確，適合核黃素含量的快速測定。

本發(fā)明研究了鹽酸提取液體積、酶解pH、加標(biāo)量對雞蛋黃、維生素B₂藥片中核黃素?zé)晒庵档挠绊?，實驗確定了雞蛋黃、維生素B₂藥片提取液為0.1mol/L 鹽酸70mL，酶解最佳pH 5.500，1μg/mL核黃素最佳加標(biāo)量為1.00mL、2.00mL。測定結(jié)果：干基雞蛋黃中核黃素含量為402μg/100g，維生B₂藥片中核黃素含量為7.9 g/100g；雞蛋黃相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.88%（n=6），維生B₂藥片相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%(n=6)；雞蛋黃加標(biāo)回收率為92.0%～104%，維生素B₂藥片加標(biāo)回收率為90.0%～96.0%；檢出限為5.76n g/mL，定量限為1.92×10^-2μg/mL。該方法與國標(biāo)方法進行比較，經(jīng)過F檢驗法和t檢驗法，兩種方法的精密度和平均值都不存在顯著性差異。本發(fā)明方法只需采用兩個加標(biāo)濃度不同的試液，用四份同體積試液在相同條件下測定的發(fā)光信號，快速獲得測定結(jié)果，無需繪制工作曲線和過柱去雜質(zhì)，方法扣除了樣品試液中背景發(fā)光值以及濃度差異所可能帶來的一部分干擾，提高了測定準(zhǔn)確度和工作效率，簡便、快速，是適合樣品中核黃素含量測定的新型分析技術(shù)，有較強的創(chuàng)新性。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明整體構(gòu)思前提下，還可以作出若干改變和改進，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護范圍，該方法也可用來測定其他樣品中的諸多分子發(fā)光的物質(zhì)，包括分子熒光、分子磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等定量分析中所能夠測定的相關(guān)物質(zhì)和組分。