本發(fā)明涉及體外檢測領(lǐng)域，具體地，涉及一種體外測定ACAT2活性的方法及其檢測系統(tǒng)
背景技術(shù)：
：?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)是膽固醇代謝的關(guān)鍵酶，其是細(xì)胞內(nèi)唯一以含3-β-OH的游離固醇類為底物而催化合成相應(yīng)固醇酯的酶，在維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇、脂肪酸等脂質(zhì)代謝平衡中起著極為重要的作用。目前為止的文獻報道，存在兩種ACAT家族基因，分別編碼ACAT1和ACAT2。ACAT1存在于體內(nèi)的所有組織細(xì)胞，其催化合成產(chǎn)物如膽固醇酯等進入細(xì)胞內(nèi)脂滴(Lipiddroplet，LD)；而ACAT2在體內(nèi)表達具有細(xì)胞、發(fā)育和種屬特異性，對于人則僅在腸與胚胎肝細(xì)胞中高表達、巨噬細(xì)胞中低表達(ChangCC等，ImmunologicalquantitationandlocalizationofACAT-1andACAT-2inhumanliverandsmallintestine.JBiolChem，2000，275:28083-92)。肝腸細(xì)胞中ACAT2催化合成產(chǎn)物如膽固醇酯等主要進入脂蛋白(Lipoprotein，LP)，包括乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)或類低密度脂蛋白(類LDL)分泌到細(xì)胞外(BuhmanKK等，NatMed，2000，6:1341-1347；Repaetal.，Hepatology，2004，40:1088-1097；Leeetal.，JLipidRes，2005，46:1205-1212)。至今，不管在無細(xì)胞體系、還是在完整細(xì)胞體系，ACAT1和ACAT2活性的測定方法均無差別，并且一般使用同位素標(biāo)記膽固醇或連接熒光基團固醇作為酶的底物。并且目前，在測定ACAT2的活性時，往往會受到ACAT1的干擾，因此在大規(guī)模應(yīng)用時會有結(jié)果不精確以及檢測時間過長的問題。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種能夠快速、特異性的檢測ACAT2活性的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種能夠快速、特異性的檢測ACAT2活性的方法。本發(fā)明第一方面提供一種非治療非診斷性的體外測定ACAT2活性的方法，所述方法包括步驟：(1)在培養(yǎng)體系中，在帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類的存在下，培養(yǎng)表達ACAT2的細(xì)胞一段時間T1；(2)檢測所述培養(yǎng)體系中位于所述細(xì)胞外部的且產(chǎn)生自所述可檢測標(biāo)記物的信號值S1；和(3)基于上一步驟所檢測的所述信號值S1，從而定性和/或定量確定ACAT2的活性。在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，將所檢測的所述信號值S1與標(biāo)準(zhǔn)值和/或?qū)φ罩颠M行比較，從而確定ACAT2的活性。在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)準(zhǔn)值包括標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線。在另一優(yōu)選例中，所述的對照值是來自對照組的可檢測標(biāo)記物的信號值S0c。在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)準(zhǔn)值是來自同一培養(yǎng)體系的背景信號值S0b。在另一優(yōu)選例中，所述的比較是計算信號值的差值ΔS：ΔS＝S1-S0c或ΔS＝S1-S0b并基于所述差值ΔS定性和/或定量確定ACAT2的活性。在另一優(yōu)選例中，所述的比較是計算信號值的比值RS：RS＝S1/S0c×100％或RS＝S1/S0b×100％并基于所述比值RS定性和/或定量確定ACAT2的活性。在另一優(yōu)選例中，所述方法中還包括設(shè)置對照組，其中：步驟(1)包括：在測試組中，培養(yǎng)表達ACAT2的細(xì)胞，以帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類處理細(xì)胞；在對照組中，以帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類處理不含有細(xì)胞的培養(yǎng)液；步驟(2)包括：經(jīng)保溫培養(yǎng)后，測定測試組和對照組的可檢測標(biāo)記物的信號值(如熒光強度)，從而確定ACAT2的活性，若測試組的信號值S1顯著高于對照組的信號值S0c，則表明ACAT2活性顯著高于對照組。在另一優(yōu)選例中，所述“顯著高于”是指測試組的信號值S1與對照組的信號值S0c的比值Rs≥2，較佳地≥5，更佳地≥10。在另一優(yōu)選例中，所述“顯著高于”是指測試組的信號值S1與對照組的信號值S0c的差值(×105OD)≥2，較佳地≥5，更佳地≥10。在另一優(yōu)選例中，所述的背景信號值S0b是在添加了所述帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類之后的0-30分鐘(較佳地1-20分鐘，更佳地3-15分鐘)內(nèi)所測定的位于所述細(xì)胞外部的且產(chǎn)生自所述可檢測標(biāo)記物的信號值。在另一優(yōu)選例中，所述的對照組中，所培養(yǎng)的對照細(xì)胞是不表達ACAT2的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的對照組中，所培養(yǎng)的對照細(xì)胞是表達ACAT2的細(xì)胞(優(yōu)選地，所述對照細(xì)胞是與測試組中相同的細(xì)胞)。在另一優(yōu)選例中，所述可檢測標(biāo)記物選自下組：發(fā)光團、熒光團、生色團、或其組合。在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測標(biāo)記物包括熒光標(biāo)記，更佳地為NBD。在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)中，所述培養(yǎng)體系中，還存在不帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類。在另一優(yōu)選例中，所述含3-β-OH的固醇類選自下組：膽固醇，氧化膽固醇、固醇類激素及其前體、膽固醇前體、膽汁酸類、或其組合。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述的含3-β-OH的固醇類選自下組：27-羥基膽固醇、24s-羥基膽固醇和25-羥基膽固醇。在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類選自下組：NBD熒光基團標(biāo)記的含3-β-OH的固醇類(簡稱為NBD-固醇，其中NBD熒光基團可標(biāo)記于固醇的不同位點上)。在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類帶有一種或多種不同的所述可檢測標(biāo)記物。在在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)中，將不帶有可檢測標(biāo)記物的3-β-OH的固醇類和帶有可檢測標(biāo)記物的3-β-OH的固醇類可按任意次序加入，包括同時或先后加入所述培養(yǎng)體系。在另一優(yōu)選例中，所述的表達ACAT2的細(xì)胞選自下組：人和非人哺乳動物細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的表達ACAT2的細(xì)胞選自下組：肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、永生化的細(xì)胞系、白細(xì)胞、基因工程改造的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的表達ACAT2細(xì)胞選自下組：肝癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞(如結(jié)腸癌細(xì)胞)、血癌細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的表達ACAT2的細(xì)胞是來自血液樣本、體液樣本、尿液樣本、唾液樣本、腫瘤組織樣本或癌旁樣本的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤組織為肝癌組織或腸癌組織。在另一優(yōu)選例中，所述的表達ACAT2細(xì)胞選自下組：分離自循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，所述的含3-β-OH的固醇類是ACAT2特異識別的立體構(gòu)型底物，經(jīng)ACAT2特異識別固醇3-β-OH催化合成固醇酯；或所述的帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類是ACAT2特異識別的立體構(gòu)型底物，經(jīng)ACAT2特異識別固醇3-β-OH催化合成固醇酯，且其攜帶熒光標(biāo)記。在另一優(yōu)選例中，所述表達ACAT2的細(xì)胞具有分泌脂蛋白的功能。在另一優(yōu)選例中，所述表達ACAT2的細(xì)胞表達載脂蛋白B和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述的T1為0.1－24小時，較佳地為0.2-12小時，更佳地為0.5-6小時，最佳地為1-5小時，極佳地2-3小時。在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)體系的體積為1微升－100毫升，較佳地為5微升－10毫升，更佳地為10微升-1000微升，最佳地為20-500微升，極佳地50-200微升。在另一優(yōu)選例中，所述方法包括：在n個獨立的培養(yǎng)體系中進行所述步驟(1)和步驟(2)，其中n為1-10000的正整數(shù)，較佳地2-2000，更佳地5-1000，最佳地為48、96、192、384。在另一優(yōu)選例中，所述的培養(yǎng)體系被置于多孔板(如48、96、192、384孔板)中各孔中。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，所述的檢測通過肉眼、儀器測定(如拍照、圖像分析)進行。在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)和(2)之間，包括或不包括將所述細(xì)胞與所述 培養(yǎng)體系分離的步驟。在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)和(2)之間不包括將所述細(xì)胞與所述培養(yǎng)體系分離的步驟。本發(fā)明第二方面提供了一種用于檢測ACAT2活性的檢測系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：(a)表達ACAT2的細(xì)胞；(b)帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類；(c)用于檢測位于所述細(xì)胞外部的且產(chǎn)生自所述可檢測標(biāo)記物的信號值的檢測儀器。在另一優(yōu)選例中，所述的系統(tǒng)還包括用于對所述信號值進行分析的分析裝置。在另一優(yōu)選例中，所述的分析裝置存貯有用于對所述信號值進行分析的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值或標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明第三方面提供了一種確定測試化合物是否是ACAT2抑制劑或促進劑的方法，包括步驟：(a)在測試組中，在培養(yǎng)體系中，在帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類和測試化合物的存在下，培養(yǎng)表達ACAT2的細(xì)胞一段時間T1，檢測測試組所述培養(yǎng)體系中位于所述細(xì)胞外部的且產(chǎn)生自所述可檢測標(biāo)記物的信號值S1’；并且在不存在所述測試化合物且其他條件相同的對照組中，檢測對照組所述培養(yǎng)體系中位于所述細(xì)胞外部的且產(chǎn)生自所述可檢測標(biāo)記物的信號值S1”；(b)將上一步驟所檢測的所述信號值S1’和S1”進行比較，從而確定所述測試化合物是否是ACAT2抑制劑或ACAT2促進劑，其中，如果信號值S1’顯著高于S1”，則表示所述測試化合物是ACAT2促進劑；如果信號值S1’顯著低于S1”，則表示所述測試化合物是ACAT2抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述“顯著高于”指S1’/S1”≥2,較佳地，≥3，更佳地≥4。在另一優(yōu)選例中，所述“顯著低于”指S1’/S1”≤1/2,較佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。在另一優(yōu)選例中，所述的信號值為熒光強度。在另一優(yōu)選例中，所述的方法是非診斷和治療性的。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括步驟：將步驟(b)中所確定的ACAT2抑制劑或ACAT2促進劑，施用于動物，并測定其對ACAT2的影響或?qū)χ惔x的影響。本發(fā)明第四方面提供了一種分泌性脂蛋白復(fù)合物，所述復(fù)合物具有式I結(jié)構(gòu)：LP-(Y)m(I)式中，LP表示脂蛋白；Y為帶有可檢測標(biāo)記物的3-β-OH被酯化的固醇類酯；m≥2。在另一優(yōu)選例中，所述的分泌性脂蛋白復(fù)合物是分離的或純化的。在另一優(yōu)選例中，m≥5，較佳地為m≥10，更佳地為m≥50，最佳地為100，極佳地為200。在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合物分子量≥2500kDa。在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合物具有位于外層的脂蛋白LP以及位于內(nèi)部的Y。在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合物具有位于外層的載脂蛋白-磷脂-游離膽固醇組成的LP以及位于內(nèi)部的Y。在另一優(yōu)選例中，所述帶有可檢測標(biāo)記物的3-β-OH被酯化的固醇類酯包被于脂蛋白中。在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合物為表達ACAT2的細(xì)胞分泌至細(xì)胞外的復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，在所述復(fù)合物中，所述Y為聚集型。在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合物中所述聚集型Y所產(chǎn)生的可檢測標(biāo)記物信號顯著高于分散型Y所產(chǎn)生的可檢測標(biāo)記物信號。例如，m個Y所構(gòu)成的聚集型Y所產(chǎn)生的總信號值Stotal強于單個分散型Y所產(chǎn)生的信號值Ssingle的m倍，即Stotal≥Ssingle×m。更佳地，R＝Stotal/(Ssingle×m)≥2，較佳地R≥5，更佳地R≥50。本發(fā)明第五方面提供了一種本發(fā)明第四方面所述的分泌性脂蛋白復(fù)合物的制備方法，所述方法包括步驟：(1)在培養(yǎng)體系中，在帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類的存在下，培養(yǎng)表達ACAT2的細(xì)胞一段時間T1，從而形成所述的分泌性脂蛋白復(fù)合物；(2)從所述培養(yǎng)體系中，分離出所述的分泌性脂蛋白復(fù)合物。本發(fā)明第六方面提供了一種本發(fā)明第四方面所述的分泌性脂蛋白復(fù)合物的用途，所述復(fù)合物用于制備(a)用于檢測ACAT2活性的試劑或試劑盒；(b)用于檢測或輔助檢測癌癥或癌癥易感性的試劑盒；(c)用于檢測或輔助檢測癌癥轉(zhuǎn)移的試劑盒；和/或(d)用于制備血清檢測或血液檢測的試劑盒。在另一優(yōu)選例中，在所述試劑盒中，含有所述的分離的分泌性脂蛋白復(fù)合物作為陽性對照。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒包括：第一容器，所述容器含有所述分泌性脂蛋白復(fù)合物；標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于體外檢測ACAT2活性。本發(fā)明第七方面提供了一種非治療非診斷性的體外測定ACAT2活性的方法，所述方法包括步驟：(1)提供一待檢測樣本；(2)對所述樣本進行處理，獲得經(jīng)處理的混合物，并檢測所述混合物中本發(fā)明第四方面所述的分泌性脂蛋白復(fù)合物所產(chǎn)生的自所述可檢測標(biāo)記物的信號值S1；和(3)基于上一步驟所檢測的所述信號值S1，從而定性和/或定量確定所述樣本中的ACAT2的活性。在另一優(yōu)選例中，所述的樣本包括細(xì)胞樣本、血液樣本、體液樣本。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說明圖1顯示了細(xì)胞培養(yǎng)后的熒光強度測定結(jié)果其中，圖1A顯示了L02、Huh7細(xì)胞和無細(xì)胞培養(yǎng)液(Nocell)在同樣保溫培養(yǎng)后的熒光強度測定結(jié)果，以無細(xì)胞培養(yǎng)液測定結(jié)果作為對照；**P<0.01。圖1B顯示了Huh7細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)超濾處理后超濾膜之上(top)及超濾膜之下 (bottom)的培養(yǎng)液中的相對熒光強度(％)測定結(jié)果。圖2顯示了ACAT2抑制劑對細(xì)胞培養(yǎng)后的熒光強度影響結(jié)果其中，PPPA為ACAT2的選擇性特異抑制劑，5μM處理細(xì)胞能夠完全抑制高表達的ACAT2的活性。圖3顯示了ACAT2抑制劑的IC50測定結(jié)果其中圖3A利用Huh7、HepG2和Caco-2三株細(xì)胞，測定不同濃度的PPPA對細(xì)胞ACAT2活性的抑制作用。圖3B對上述測定數(shù)據(jù)，使用GraphPadPrism軟件作圖，獲得相應(yīng)細(xì)胞ACAT2相對活性(％)對PPPA濃度對數(shù)[Log(PPPAμM)]的抑制曲線。具體實施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外的開發(fā)了一種檢測ACAT2活性的方法，該方法能夠特異性的定性和/或定量檢測細(xì)胞中ACAT2的活性，并且具有很高的靈敏度。具體地，在表達ACAT2細(xì)胞中加入帶有可檢測標(biāo)記物的固醇類(如NBD－固醇)，并檢測進入分泌脂蛋白的帶有可檢測標(biāo)記物的3-β-OH被酯化的固醇類酯的信號值(如熒光強度)，通過對信號值(如熒光強度)進行分析，從而能夠很精確的確定ACAT2的活性。體外測定ACAT2活性的方法本發(fā)明提供了一種體外測定ACAT2活性的方法，包括步驟：(1)在培養(yǎng)體系中，在帶有可檢測標(biāo)記物的含3-β-OH的固醇類的存在下，培養(yǎng)表達ACAT2的細(xì)胞一段時間T1；(2)檢測所述培養(yǎng)體系中位于所述細(xì)胞外部的且產(chǎn)生自所述可檢測標(biāo)記物的信號值S1；和(3)基于上一步驟所檢測的所述信號值S1，從而定性和/或定量確定ACAT2的活性。其中，在步驟(3)中，通過將所檢測的所述信號值S1與標(biāo)準(zhǔn)值(S0b)和/或?qū)φ罩?S0c)進行比較，從而確定ACAT2的活性。所述的比較是計算信號值的差值ΔS：ΔS＝S1-S0c或ΔS＝S1-S0b并基于所述差值ΔS定性和/或定量確定ACAT2的活性?；蛘?，所述的比較是計算信號值的比值RS：RS＝S1/S0c×100％或RS＝S1/S0b×100％并基于所述比值RS定性和/或定量確定ACAT2的活性。利用本發(fā)明所述的方法檢測細(xì)胞中ACAT2的活性，能夠排除ACAT1對ACAT2活性測定的干擾，可以直接用于對內(nèi)源性ACAT2、ACAT1均表達的細(xì)胞(如肝腸細(xì)胞)進行生理和病理功能效應(yīng)及其相關(guān)抑制作用等研究。分泌性脂蛋白復(fù)合物本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了一種分離的分泌性脂蛋白復(fù)合物，所述復(fù)合物具有式I結(jié)構(gòu)：LP-(Y)m(I)式中，LP表示脂蛋白；Y為帶有可檢測標(biāo)記物的3-β-OH被酯化的固醇類酯；m≥2，較佳地m≥5，更佳地為m≥50，最佳地為100，極佳地200。其中，所述復(fù)合物分子量≥2500kDa，且所述帶有可檢測標(biāo)記物的3-β-OH被酯化的固醇類酯以聚集體的形式包被于脂蛋白中。在本發(fā)明中，復(fù)合物中聚集型Y所產(chǎn)生的可檢測標(biāo)記物信號顯著高于分散型Y所產(chǎn)生的可檢測標(biāo)記物信號。例如，m個Y所構(gòu)成的聚集型Y所產(chǎn)生的總信號值Stotal強于單個分散型Y所產(chǎn)生的信號值Ssingle的m倍，即Stotal≥Ssingle×m。更佳地，R＝Stotal/(Ssingle×m)≥2，較佳地R≥5，更佳地R≥50。本發(fā)明通過檢測分泌性脂蛋白復(fù)合物的信號值(如熒光強度)，從而能夠快速、精確的確定細(xì)胞中ACAT2的活性。試劑盒本發(fā)明提供了一種檢測ACAT2活性的試劑盒，該試劑盒包括：第一容器，所述容器含有分泌性脂蛋白復(fù)合物，其中分泌性脂蛋白復(fù)合物作為陽性對照。標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于體外檢測ACAT2活性。在本發(fā)明中，通過檢測試劑盒中分泌性脂蛋白復(fù)合物的信號值(如熒光強度)，從而能夠快速、精確的確定細(xì)胞中ACAT2的活性，能夠用于大規(guī)模高效的篩選ACAT2選擇性特異抑制劑，加速肝癌等疾病的臨床診治與藥物研發(fā)。本發(fā)明的優(yōu)點包括：(1)在分泌脂蛋白且內(nèi)源性ACAT2、ACAT1均表達的細(xì)胞(如肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、白細(xì)胞)中進行ACAT2活性測定，ACAT1對ACAT2活性測定無干擾作用；(2)本發(fā)明的測定ACAT2活性的方法可以直接用于對內(nèi)源性ACAT2、ACAT1均表達的細(xì)胞(如肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、白細(xì)胞)進行生理和病理功能效應(yīng)及其相關(guān)抑制作用等研究；(3)本發(fā)明測定ACAT2活性的方法適宜于利用小體積、多孔板進行規(guī)模性高效篩選ACAT2選擇性特異抑制劑及檢測細(xì)胞對ACAT2抑制的毒性作用；(4)可成為規(guī)模性篩選ACAT2特異性抑制劑的關(guān)鍵性技術(shù)方法，不但促進高效篩選ACAT2選擇性特異抑制劑，而且加速肝癌等疾病的臨床診治與藥物研發(fā)；(5)首次公開了一種分泌性脂蛋白復(fù)合物，通過檢測該復(fù)合物的信號值(如熒光強度)，能夠快速、精確的確定細(xì)胞中ACAT2的活性。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。材料和方法1.材料和試劑細(xì)胞培養(yǎng)基Dulbecco’smodifiedEagle’smedium(DMEM)和胎牛血清購自LifeTechnologies公司(Rockville，USA)。3-β-OH的熒光標(biāo)記固醇是由熒光基團NBD取代膽固醇的22位異丙基而合成的含3-β-OH的NBD-固醇(NBD-sterol)，結(jié)構(gòu)式如下：含3-β-OH的固醇類包括膽固醇、27-hydroxycholesterol(27OH)、24s-hydroxycholesterol(24sOH)、25-hydroxycholesterol(25OH)分別購自Sigma、MedicalIsotope和EnzoLifeScience公司。ACAT2選擇性特異抑制劑PPPA購自Enzolifescience公司。超濾柱AmiconUltra-15CentrifugalFilters(濾膜孔徑10kDa)購自Millipore公司(Ireland)。熒光分析儀EnVisionMultilabelReader(PerkinElmer，USA)。2.細(xì)胞及培養(yǎng)條件人正常肝細(xì)胞株L02、人肝癌細(xì)胞株Huh7由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞株HepG2、人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2，購自ATCC(AmericanTypeCultureCollection)。Caco-2細(xì)胞用20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；其余細(xì)胞都用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞均在95％濕度、37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基都加入100U/ml的氨芐青霉素和100μg/ml鏈霉素。3.細(xì)胞培養(yǎng)后的熒光測定分析L02和Huh7細(xì)胞在過夜培養(yǎng)后，加入含3-β-OH的固醇類和熒光標(biāo)記固醇，同時以含3-β-OH的固醇類和熒光標(biāo)記固醇處理不含有細(xì)胞的培養(yǎng)液作為對照，同樣保溫培養(yǎng)后再使用熒光分析儀(E488，A535)進行熒光強度測定。4.細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)超濾后的熒光測定分析將上述條件下的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)液進行超濾處理，再使用熒光分析儀(E488，A535)分別測定濾膜上和濾膜下的液體的熒光強度，以未經(jīng)超濾處理的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)液的熒光強度為100％，計算相對熒光強度(％)。5.測定PPPA對ACAT2活性的抑制作用利用文獻報道的可完全抑制高表達ACAT2活性的選擇性特異抑制劑PPPA濃度(5μM)，同時處理上述條件下的L02、Huh7、HepG2和Caco-2細(xì)胞后，比較加與不加抑制劑之間熒光強度的差異。對PPPA抑制ACAT2活性的IC50測定，是利用PPPA梯度濃度處理上述條件下的Huh7、HepG2和Caco-2細(xì)胞后，將無PPPA處理細(xì)胞的ACAT2活性設(shè)定為100％，分別計算相應(yīng)PPPA濃度處理的相對ACAT2活性(％)，使用GraphPadPrism軟件作圖，獲得相應(yīng)細(xì)胞ACAT2相對活性對PPPA濃度對數(shù)[Log(PPPAμM)]的抑制曲線和IC50。6.統(tǒng)計分析利用unpairedStudent’sttest進行實驗差異的統(tǒng)計分析。實施例1細(xì)胞培養(yǎng)液的NBD-固醇酯主要分布在分泌脂蛋白中本發(fā)明人利用不具有分泌脂蛋白功能且ACAT2不表達的L02(正常肝細(xì)胞)和具有分泌脂蛋白功能且ACAT2高表達的Huh7細(xì)胞(肝癌細(xì)胞)，通過加入含3-β-OH的固醇類和熒光標(biāo)記固醇，同時以含3-β-OH的固醇類和熒光標(biāo)記固醇處理不含有細(xì)胞的培養(yǎng)液作為對照，同樣保溫培養(yǎng)后進行熒光強度測定。結(jié)果表明，如圖1A所示，與不具有分泌脂蛋白功能的L02細(xì)胞相比，具有分泌脂蛋白功能的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)后的熒光強度非常顯著地提高。進一步，將以上Huh7細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)部分超濾處理后的結(jié)果(圖1B)顯示，熒光主要分布于超濾膜(Ultra-10)之上(top)的培養(yǎng)液，而超濾膜之下(bottom)的培養(yǎng)液熒光非常弱，表明存在于細(xì)胞培養(yǎng)液的熒光主要源自進入分泌脂蛋白(分子量＞10kDa)的聚集型NBD-固醇酯，而不是游離型NBD-固醇(約0.5kDa)。發(fā)明人將含聚集型NBD-固醇酯的分泌脂蛋白復(fù)合物(分子量＞10kDa)進行分離純化，發(fā)現(xiàn)熒光信號來源于進入分泌脂蛋白的聚集型NBD-固醇酯。在 分泌性脂蛋白復(fù)合物中，NBD－固醇酯以聚集體的形式包被于脂蛋白中。分析后的結(jié)果表明，分泌性脂蛋白復(fù)合物的熒光強度比游離的NBD－固醇要高很多，至少高1倍，其由外層載脂蛋白-磷脂-游離膽固醇的脂蛋白和位于內(nèi)部的NBD－固醇酯兩部分組成，并且分泌性脂蛋白復(fù)合物的直徑為15-22nm，形成脂蛋白復(fù)合物之前的脂蛋白的直徑為22-80nm。實施例2分泌脂蛋白中的NBD-固醇酯由ACAT2催化合成本發(fā)明人在上述同樣實驗中，同時加入文獻報道的可完全抑制高表達ACAT2活性的選擇性特異抑制劑PPPA(5μM)處理。如圖2結(jié)果顯示，ACAT2高表達的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)后的熒光強度有非常顯著的降低，且與不具有分泌脂蛋白功能且ACAT2不表達的L02無顯著差異，進而表明Huh7細(xì)胞培養(yǎng)后在分泌脂蛋白中聚集的NBD-固醇酯量依賴于ACAT2活性。實施例3選擇性特異抑制劑PPPA對ACAT2活性的抑制作用本發(fā)明人深入的實驗研究，在具有分泌脂蛋白功能且內(nèi)源性ACAT2均高表達的另二株天然型細(xì)胞HepG2和Caco-2進行同樣的5μMPPPA處理，圖3A顯示，HepG2和Caco-2的結(jié)果與Huh7的完全一致。進一步地，測定ACAT2選擇性特異抑制劑PPPA的IC50，結(jié)果見圖3B和表1。Huh7、HepG2和Caco-2三株細(xì)胞均是內(nèi)源性ACAT2高表達，在0.008-5μM濃度范圍，PPPA的抑制曲線無明顯差異(圖3B)；且特異抑制ACAT2活性的IC50也相近(表1)。表1PPPA特異抑制ACAT2活性的IC50細(xì)胞株IC50(μM)Huh70.167HepG20.177Caco-20.141結(jié)果表明，已成功構(gòu)建了可用于ACAT2活性測定的新技術(shù)方法體系，可應(yīng)用于規(guī)模性篩選調(diào)節(jié)ACAT2的活性或表達的待測定物質(zhì)，還可應(yīng)用于通過測定血液來源細(xì)胞的ACAT2活性進行免疫功能異常或炎癥發(fā)生、肝癌或腸癌轉(zhuǎn)移的分析。實施例4篩選促進或抑制ACAT2活性的測試化合物的方案利用前面所述所構(gòu)建的新技術(shù)方法體系，進行規(guī)模性篩選促進或抑制ACAT2活性的測試化合物，通過將測試化合物測試組的熒光強度(S1’)和不存在測試化合物且其他條件相同的對照組的熒光強度(S1”)進行比較，從而確定測試化合物是否是ACAT2抑制劑或ACAT2促進劑。如果信號值S1’顯著高于S1”，如高于2倍以上，則表示測試化合物是ACAT2促進劑；如果信號值S1’顯著低于S1”，如低于50％以上，則表示測試化合物是ACAT2抑制劑，其潛在地可研發(fā)成為一種抑制腫瘤或抗動脈粥樣硬化病變的藥物。實施例5測定血液來源細(xì)胞的ACAT2活性進行免疫功能異?；蜓装Y發(fā)生、肝癌或腸癌轉(zhuǎn)移分析的方案利用前面所述所構(gòu)建的新技術(shù)方法體系，通過測定健康者血液分離細(xì)胞培養(yǎng)后的熒光強度，獲得具有統(tǒng)計學(xué)意義的測試標(biāo)準(zhǔn)；通過測定受試者血液分離細(xì)胞培養(yǎng)后的熒光強度，比較受試者和測試標(biāo)準(zhǔn)的熒光強度，用來分析受試體檢者的健康水平和受試患者相關(guān)疾病的輔助診斷；若是受試者的熒光強度顯著低于測試標(biāo)準(zhǔn)，則表明該受試者血液分離細(xì)胞的ACAT2活性偏低而免疫功能異常抑制，如感染性炎癥；若是受試者的熒光強度顯著高于測試標(biāo)準(zhǔn)，則表明該受試者血液分離細(xì)胞的ACAT2活性偏高而免疫功能異常激活，如過敏性炎癥或非可控性炎癥(nonresolvinginflammation)；若是受試者的熒光強度非常顯著高于測試標(biāo)準(zhǔn)，則表明該受試者血液含有高表達ACAT2的轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，如肝癌或腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。實施例6試劑盒制備本實施例提供了一種檢測ACAT2活性的試劑盒及其制備，該試劑盒包括：第一容器，所述容器含有分泌性脂蛋白復(fù)合物，其中分泌性脂蛋白復(fù)合物作為陽性對照。標(biāo)簽或說明書，所述標(biāo)簽或說明書注明所述試劑盒用于體外檢測ACAT2活性。對比例1采用本發(fā)明相同的方法，對人神經(jīng)瘤細(xì)胞(如SK-N-SH)進行ACAT2活性的測定。結(jié)果表明，人神經(jīng)瘤細(xì)胞(如SK-N-SH)不表達ACAT2，也不分泌脂蛋白，熒光強度不增加，檢測不到ACAT2的活性。對比例2采用本發(fā)明相同的方法，對人肝癌細(xì)胞(如Hep3B)進行ACAT2活性的測定，結(jié)果表明，人肝癌細(xì)胞(如Hep3B)不表達ACAT2，雖然能夠分泌脂蛋白，但是熒光強度不增加，因此檢測不到ACAT2的活性。討論如表2所示，發(fā)明人對大量的細(xì)胞株進行研究后發(fā)現(xiàn)，不是所有能夠分泌脂蛋白的細(xì)胞株均能夠用本發(fā)明所述的方法檢測ACAT2的活性，并且不分泌脂蛋白的細(xì)胞株也檢測不到ACAT2的活性。因此，在分泌脂蛋白且內(nèi)源性ACAT2、ACAT1均表達的細(xì)胞(如肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、白細(xì)胞)中測定ACAT2的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACAT1對ACAT2活性的測定無明顯干擾作用，而且該方法測定的是內(nèi)源性ACAT2的活性，因此該方法可直接用于對內(nèi)源性ACAT2、ACAT1均表達的細(xì)胞(如肝細(xì)胞、腸細(xì)胞、白細(xì)胞)進行生理和病理功能效應(yīng)及其相關(guān)抑制作用等方面的研究。表2用本發(fā)明所述方法測定不同細(xì)胞株的ACAT2活性細(xì)胞株細(xì)胞類型脂蛋白分泌熒光強度增加ACAT2活性Huh7人肝癌細(xì)胞能非常顯著高HepG2人肝癌細(xì)胞能非常顯著高Caco-2人腸癌細(xì)胞能非常顯著高THP-1人單核白細(xì)胞能顯著低Hep3B人肝癌細(xì)胞能無無L02人正常肝細(xì)胞能無無SK-N-SH人神經(jīng)瘤細(xì)胞否無無AC29倉鼠卵母細(xì)胞否無無在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3