本發(fā)明涉及易攜帶、操作簡(jiǎn)單、花費(fèi)低、靈敏度高及測(cè)定結(jié)果可信度高的Pb²⁺分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說(shuō)是一種比率型三維金屬增強(qiáng)熒光Pb²⁺生物傳感器的制備。

背景技術(shù)：

Pb²⁺存在各種資源中（如食品，血液，飲用水，工業(yè)廢水等等），被稱為最有害的重金屬離子之一，它不僅引起了一系列環(huán)境污染的問(wèn)題，而且對(duì)人類身體健康也構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，尤其是兒童。例如，長(zhǎng)期暴露在富含Pb²⁺環(huán)境中，會(huì)使人類的中樞神經(jīng)和泌尿系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損壞，并且還會(huì)通過(guò)食物鏈及飲用水造成智力發(fā)展的損壞。更為嚴(yán)重的是Pb²⁺不能夠被生物分解，微量的Pb²⁺可能會(huì)對(duì)人類身體健康造成可怕的危害。因此，高靈敏的檢測(cè)重金屬離子尤為重要。為了達(dá)到這個(gè)目的，很多的重金屬離子檢測(cè)方法被建立起來(lái)，如原子吸收光譜、色譜法、比率型熒光檢測(cè)方法、電化學(xué)發(fā)光方法、分子印跡法、光電化學(xué)法及熒光方法等。在上述方法中，熒光檢測(cè)法因其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、專一等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛的關(guān)注。但在單一的熒光團(tuán)的熒光檢測(cè)方法中，因會(huì)受到待測(cè)液環(huán)境儀器因素以及熒光團(tuán)自身濃度等影響，將直接導(dǎo)致容易使檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生假陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度有待進(jìn)一步提高。

比率型熒光檢測(cè)方法，是指含有兩個(gè)熒光團(tuán)，通過(guò)測(cè)量?jī)蓚€(gè)熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度，利用二者的比值作為信號(hào)參量，從而來(lái)測(cè)定檢測(cè)物的分析方法。熒光的比值信號(hào)不受光源強(qiáng)度和儀器靈敏度的影響。因此，比率型熒光探針可以提高方法的選擇性、靈敏度和動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍，從而有效提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

微流控紙基分析設(shè)備，因其低花費(fèi)、易攜帶、制備過(guò)程簡(jiǎn)單，而且易于實(shí)現(xiàn)小型化檢測(cè)，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、生物樣品、環(huán)境診斷等領(lǐng)域。比率型熒光檢測(cè)方法與紙芯片的結(jié)合，完美的將紙芯片的低花費(fèi)、易攜帶、制備過(guò)程簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)與比率型熒光檢測(cè)方法的靈敏度高、專一、測(cè)定結(jié)果可信度高等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，有望解決偏遠(yuǎn)地區(qū)水資源中重金屬離子的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種易攜帶、操作簡(jiǎn)單、花費(fèi)低、靈敏度高及測(cè)定結(jié)果可信度高的比率型三維金屬增強(qiáng)熒光紙芯片，以實(shí)現(xiàn)Pb²⁺的快速、高靈敏度檢測(cè)。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)一種長(zhǎng)有十面體銀的紙芯片及比率型三維金屬增強(qiáng)熒光方法來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其特征是包括以下步驟：

（1）設(shè)計(jì)如附圖1所示比率型三維金屬增強(qiáng)熒光紙芯片的疏水蠟打印區(qū)域和親水工作區(qū)域；

（2）通過(guò)蠟打印機(jī)將步驟（1）中設(shè)計(jì)的紙芯片打印上疏水圖案，隨后將得到的紙芯片于60-150 oC下加熱，直到蠟融化并浸透整個(gè)紙，形成疏水層；

（3）在步驟（2）中得到的紙芯片的親水工作區(qū)域生長(zhǎng)十面體銀；

（4） 將石墨烯量子點(diǎn)功能化的催化鏈，定義為DNA₁，固定在步驟（3）所得紙芯片的親水區(qū)域，隨后用緩沖溶液進(jìn)行沖洗；

（5） 將染料和二氧化鈰功能化的Pb²⁺識(shí)別基質(zhì)鏈，定義為17DS，滴加到步驟（4）所得紙芯片的親水區(qū)域，最后用緩沖溶液進(jìn)行沖洗；

（6） 將不同濃度的Pb²⁺加入到步驟（5）所得紙芯片的親水區(qū)域，隨后放入熒光設(shè)備中，分別測(cè)定在不同濃度的Pb²⁺下石墨烯量子點(diǎn)和染料的熒光強(qiáng)度；

（7）繪制兩種熒光強(qiáng)度比率的變化與Pb²⁺濃度關(guān)系曲線，完成Pb²⁺的測(cè)定。

本發(fā)明所述在步驟（2）中得到的紙芯片的親水工作區(qū)域生長(zhǎng)十面體銀的步驟為：

將1.5 mL 50 mM 檸檬酸鈉，1.5 mL 6% 聚乙烯吡咯烷酮，0.15 mL 10 mM精氨酸及0.6 mL 10 mM硝酸銀加入到6 mL二次水中，隨后在攪拌下加入0.24 mL 0.1 M新鮮制備的硼氫化鈉，制得銀種子；取20 μL 的銀種子滴加到工作區(qū)域，在室溫下放置45 min，反復(fù)滴加三次；將滴加完銀種子的紙芯片放在3 W的藍(lán)燈下曝光10 h。

本發(fā)明步驟（4）中所述的DNA₁特定的堿基序列以及其5’端修飾上巰基，其3’端修飾上石墨烯量子點(diǎn)。

本發(fā)明步驟（5）中所述17DS特定的堿基序列以及其5’端修飾上二氧化鈰，其3’端修飾上染料。

本發(fā)明所述的染料為：羥基香豆素，藻紅蛋白，酞菁熒光探針Cy3，酞菁熒光探針Cy5，酞菁熒光探針Cy7，羅丹明，異硫氰酸酯，羅紅霉素，羧基熒光素。

本發(fā)明所述比率型Pb²⁺熒光測(cè)定步驟，將紙芯片放入熒光皿中，分別測(cè)定在不同濃度的Pb²⁺下石墨烯量子點(diǎn)和染料的熒光強(qiáng)度，繪制兩種熒光強(qiáng)度比率的變化與Pb²⁺濃度關(guān)系曲線，實(shí)現(xiàn)Pb²⁺的精確測(cè)定。

本發(fā)明的有益效果

（1）比率型金屬增強(qiáng)熒光方法，測(cè)定結(jié)果可信度高。

（2）比率型金屬增強(qiáng)熒光方法和紙芯片聯(lián)用，具有便攜式、高靈敏、所需費(fèi)用低、制作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，有望在資源有限的偏遠(yuǎn)地區(qū)實(shí)現(xiàn)Pb²⁺的便攜式檢測(cè)。

（3）紙上生長(zhǎng)十面體銀，增大了比表面積及有效減少紙的背景熒光，最重要的是使熒光信號(hào)放大了幾倍，大大提高了Pb²⁺檢測(cè)的靈敏度。

附圖說(shuō)明

圖1：紙芯片的疏水蠟批量打印圖案。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1

比率型三維金屬增強(qiáng)熒光生物傳感器在Pb²⁺檢測(cè)中的應(yīng)用：

（1）設(shè)計(jì)比率型三維金屬增強(qiáng)熒光紙芯片的疏水蠟打印區(qū)域和親水工作區(qū)域；

（2）通過(guò)蠟打印機(jī)將步驟1.1中設(shè)計(jì)的紙芯片打印上疏水圖案，隨后將得到的紙芯片于60-150 oC下加熱，直到蠟融化并浸透整個(gè)紙，形成疏水層；

（3）在步驟（2）中得到的紙芯片的親水工作區(qū)域生長(zhǎng)十面體銀：將1.5 mL 50 mM 檸檬酸鈉，1.5 mL 6% 聚乙烯吡咯烷酮，0.15 mL 10 mM精氨酸及0.6 mL 10 mM硝酸銀加入到6 mL二次水中，隨后在攪拌下加入0.24 mL 0.1 M新鮮制備的硼氫化鈉，制得銀種子；取20 μL 的銀種子滴加到工作區(qū)域，在室溫下放置45 min，反復(fù)滴加三次；將滴加完銀種子的紙芯片放在3 W的藍(lán)燈下曝光10 h；

（4） 將石墨烯量子點(diǎn)功能化的催化鏈，定義為DNA₁，固定在步驟（3）所得紙芯片的親水區(qū)域，隨后用緩沖溶液進(jìn)行沖洗；

（5） 將染料和二氧化鈰功能化的Pb²⁺識(shí)別基質(zhì)鏈，定義為17DS，滴加到步驟（4）所得紙芯片的親水區(qū)域，最后用緩沖溶液進(jìn)行沖洗；

（6） 將不同濃度的Pb²⁺加入到步驟（5）所得紙芯片的親水區(qū)域，隨后放入熒光設(shè)備中，分別測(cè)定在不同濃度的Pb²⁺下石墨烯量子點(diǎn)和染料的熒光強(qiáng)度；

（7）繪制兩種熒光強(qiáng)度比率的變化與Pb²⁺濃度關(guān)系曲線，完成Pb²⁺的測(cè)定。

SEQUENCE LISTING

<110> 濟(jì)南大學(xué)

<120> 比率型三維金屬增強(qiáng)熒光Pb²⁺生物傳感器的構(gòu)建

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tttttttttt ttttttttca tctcttctcc gagccggtcg aaatagtgag t 51

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

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