本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種真菌檢測(cè)熒光染色液及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

真菌(Fungus)是一種真核生物。最常見的真菌是各類蕈類，另外真菌也包括霉菌和酵母。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了七萬(wàn)多種真菌，估計(jì)只是所有存在的一小半。大多真菌原先被分為動(dòng)物或植物。

目前，真菌在分類學(xué)上已獨(dú)立為界，與動(dòng)物界、植物界、原核生物界和原生生物界平行。真菌具有堅(jiān)固的細(xì)胞壁和真正的細(xì)胞核，不含葉綠素，是異養(yǎng)性的，以寄生或腐生方式生存，典型者兼有有性生殖和無(wú)性生殖，產(chǎn)生各種形態(tài)的孢子。根據(jù)生長(zhǎng)特性與形態(tài)差異，可將真菌簡(jiǎn)單分為酵母、真菌和蕈(蘑菇)。其中對(duì)人類有致病性的真菌約有300多個(gè)種類。除新型隱球菌和蕈外，醫(yī)學(xué)上有意義的致病性真菌幾乎都是霉菌。根據(jù)侵犯人體部位的不同，臨床上將致病真菌分為淺部真菌和深部真菌。真菌性腸炎即屬于深部真菌病。淺部真菌(癬菌)僅侵犯皮膚、毛發(fā)和指(趾)甲，而深部真菌能侵犯人體皮膚、黏膜、深部組織和內(nèi)臟，甚至引起全身播散性感染。深部真菌感染腸道即表現(xiàn)為真菌性腸炎，可獨(dú)立存在如嬰兒念珠菌腸炎，或?yàn)槿硇哉婢腥镜谋憩F(xiàn)之一，如艾滋病并發(fā)播散性組織胞漿菌病。

楊通等(熒光染色劑Calcofluor White在活檢組織中真菌染色的應(yīng)用.分子診斷與治療雜志，2014，6(5)：307-311)采用CFW法進(jìn)行真菌檢測(cè)，采用原料包括CFW M2R熒光增白劑、伊文思藍(lán)、10％氫氧化鉀溶液，該方法10％氫氧化鉀、CFW M2R熒光增白劑溶液需獨(dú)立配置，現(xiàn)用現(xiàn)混合，否則染色液會(huì)有結(jié)晶和分層現(xiàn)象，并且被檢樣本無(wú)法長(zhǎng)期保存留檔，組織切片染色過(guò)程中容易脫片等的問(wèn)題。

徐紅、顧菊林(醫(yī)學(xué)真菌檢驗(yàn).中國(guó)真菌學(xué)雜志，2006,1(2)：111-116)采用直接鏡檢進(jìn)行真菌檢驗(yàn)，所用復(fù)方氫氧化鉀溶液配方包括氫氧化鉀、二甲基亞砜(DMSO)、甘油，配方加入DMSO促進(jìn)角質(zhì)溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氫氧化鉀結(jié)晶，但采用該配方制作產(chǎn)品，仍存在組織背景與真菌顯色對(duì)比不明顯，陽(yáng)性檢出率低等的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種通過(guò)熒光染色快速檢測(cè)真菌的染色液，染色液穩(wěn)定性及染色效果好，并且提供了該真菌熒光染色液在真菌形態(tài)學(xué)中的應(yīng)用，在臨床致病菌的檢測(cè)和診斷中具有重要作用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種真菌檢測(cè)熒光染色液，包括獨(dú)立的染色A液和復(fù)染B液，以重量百分比計(jì)，所述的染色A液包括：

以重量百分比計(jì)，所述的復(fù)染B液包括：

依文思藍(lán) 0.1-0.5％

水 99.50-99.90％。

本發(fā)明中染色A液和復(fù)染B液為單獨(dú)包裝，組份中：

氫氧化鉀能夠溶解皮屑、甲屑標(biāo)本中的角質(zhì)細(xì)胞及其他雜質(zhì)，更好的呈現(xiàn)真菌形態(tài)。氫氧化鉀濃度過(guò)低，檢出效果差，過(guò)高會(huì)造成氫氧化鉀結(jié)晶析出。優(yōu)選的，染色A液中，所述的氫氧化鉀的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-10％。

二甲基亞砜能夠防止熒光增白劑和氫氧化鉀的結(jié)晶析出，濃度過(guò)低時(shí)不能夠起到防止氫氧化鉀結(jié)晶的效果，濃度過(guò)高則染色A液會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象。優(yōu)選的，染色A液中，所述的二甲基亞砜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15-20％。

甘油使待檢樣本不易干，便于涂片長(zhǎng)期保存，甘油濃度過(guò)高也會(huì)導(dǎo)致染色A液會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象。優(yōu)選的，染色A液中，所述甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2-5％。

伊文思藍(lán)能夠弱化背景顏色，使組織背景與待檢菌體顯色對(duì)比明顯，提高觀察效果。優(yōu)選的，染色B液中，所述依文思藍(lán)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3-0.5％。

優(yōu)選的，染色A液中，所述的熒光增白劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02-0.04％。

真菌熒光染色法通過(guò)特殊熒光素與真菌細(xì)胞壁結(jié)合，并吸收紫外光(波長(zhǎng)340-380nm)，使菌絲及孢子發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，在熒光顯微鏡下真菌輪廓和黑暗背景可形成明顯反差，易于在鏡下尋找及識(shí)別，其真菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)更為清晰。本發(fā)明采用上述特定種類、一定百分比范圍的組份能夠保證染色液的均一穩(wěn)定，在保證穩(wěn)定性的同時(shí)具有優(yōu)異的染色效果。

進(jìn)一步優(yōu)選的，以重量百分比計(jì)，所述的染色A液包括：

進(jìn)一步優(yōu)選的，以重量百分比計(jì)，所述的復(fù)染B液包括：

依文思藍(lán) 0.5％

水 99.5％。

所述的熒光增白劑為熒光素-28。

本發(fā)明還提供了所述的真菌檢測(cè)熒光染色液在真菌鑒別中的應(yīng)用。

真菌鑒別可以為疾病診斷中的應(yīng)用，也可以為非疾病診斷中的應(yīng)用。

真菌可以為皮膚癬菌、馬拉色菌、念珠菌、曲霉及各類變異的菌絲結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明熒光染色液適用的標(biāo)本包括皮屑、甲屑、毛發(fā)、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的真菌檢測(cè)熒光染色液具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明配制的真菌檢測(cè)熒光染色液是一款新型的快速真菌感染檢測(cè)產(chǎn)品，可用于檢測(cè)新鮮或冰凍臨床樣本，石蠟及乙二醇甲基丙烯酸酯包埋的組織中可能存在的各類真菌。染液中的熒光物質(zhì)將與各類組織中可能存在的真菌細(xì)胞壁結(jié)合，從而可以在熒光顯微鏡下觀察到真菌的具體形態(tài)。

(2)本發(fā)明配制的真菌檢測(cè)熒光染色液通用性強(qiáng)，能夠與各類真菌(霉菌及酵母)的細(xì)胞壁結(jié)合從而產(chǎn)生熒光標(biāo)記，包含皮膚癬菌、馬拉色菌、念珠菌、曲霉及各類變異的菌絲結(jié)構(gòu)，適用于皮屑、甲屑、毛發(fā)、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胸水等各種標(biāo)本。

(3)真菌熒光染色可通過(guò)反復(fù)染色使因放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而使熒光減少的樣本恢復(fù)熒光，也可通過(guò)重復(fù)染色步驟大幅減少背景熒光，使菌絲與孢子更為明顯。并且真菌熒光染色對(duì)于標(biāo)本中菌絲、孢子由于熒光的標(biāo)記使得尋找相對(duì)容易，也便于識(shí)別，真菌菌絲、孢子清晰顯現(xiàn)，檢測(cè)靈敏度大幅提高。熒光染色法特異性高，能使少量真菌著染，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的KOH濕片法在真菌數(shù)量少時(shí)檢出率不高的不足，并且染色時(shí)間短，只需2分鐘，結(jié)果直觀，能快速有效的找到標(biāo)本中的菌絲或孢子，并且結(jié)構(gòu)清晰，明顯地提高了標(biāo)本的陽(yáng)性率。

(4)本發(fā)明配置的染色液對(duì)脂肪滴不產(chǎn)生標(biāo)記，與傳統(tǒng)KOH濕片法對(duì)孢子和脂肪滴無(wú)法分辨相比，易于鑒別。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例2本產(chǎn)品100×熒光染色圖；

圖2為實(shí)施例2本產(chǎn)品染色結(jié)果圖；

圖3為實(shí)施例2傳統(tǒng)革蘭氏染色結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明原理和特征進(jìn)行舉實(shí)例描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例的試劑原料來(lái)源如表1所示。

表1

實(shí)施例1

1、配方組成如表2所示。

表2

2、配制方法如下：

染色A液配制：

(1)甲液：使用精密分析天平稱取配方量的熒光增白劑28，加去離子水溶解。

(2)乙液：稱取配方量氫氧化鉀加去離子水溶解，20℃慢慢在攪拌中加入甘油和配方比例重量的二甲基亞砜，至完全溶解。待液體冷卻至40℃以下。

(3)乙液在不斷的攪拌中(80-100轉(zhuǎn)/分)，滴加甲液，滴加完畢，持續(xù)攪拌5分鐘。稱重，并補(bǔ)充揮發(fā)水份至配方量。密封容器口。

室溫避光靜置24小時(shí)，分裝。

染色B液配制：

(1)用燒杯稱取配方量伊文斯藍(lán)，加去離子水預(yù)溶。

(2)稱取配方量去離子水于配料桶中(可預(yù)留部分水用于燒杯清洗，以保證伊文斯藍(lán)足量投入)，在攪拌中加入預(yù)溶的伊文斯藍(lán)溶液，并用預(yù)留部分水蕩洗燒杯。持續(xù)攪拌5分鐘。稱重，并補(bǔ)充揮發(fā)水份至配方量。密封容器口。

室溫避光靜置24小時(shí)，分裝。

3、真菌熒光染色液的使用方法

(1)顯微鏡選擇：熒光顯微鏡濾波器的選擇根據(jù)使用的顯微鏡型號(hào)不同而有所改變。紫外光，卡爾科弗盧爾熒光增白劑白色激發(fā)濾鏡(Ultra Violet，Calcofluor White Filter)340nm至380nm，配有430nm壓制濾鏡。如果在染色過(guò)程中有復(fù)染步驟，則熒光材料的顏色需為藍(lán)色，并且需要紅色的背景。H3紫藍(lán)光，寬頻異硫氰酸熒光激發(fā)濾鏡(H3Violet Plus Blue，Wide Band FITC Filter)420nm至490nm，配有515nm壓制濾鏡。如果在染色過(guò)程中有復(fù)染步驟，則熒光材料的顏色需為綠色，并且需要紅色的背景。

(2)將載物片放置在水平位置上，直接向樣本上滴幾滴染色A液。染色液以覆蓋或淹沒整個(gè)樣品為準(zhǔn)，使其中成分與多聚物進(jìn)行充分的結(jié)合反應(yīng)，持續(xù)染色兩分鐘。

(3)兩分鐘后，直接向樣本上滴一滴染色B液。染色液以覆蓋或淹沒整個(gè)樣品為準(zhǔn)，持續(xù)染色兩分鐘。

(4)蓋上蓋玻片，吸去多余染液，置于熒光顯微鏡下觀察即可。

注意：如果樣品為真菌培養(yǎng)物的話，可以在載玻片上直接滴加A液和B液。

(5)熒光顯微鏡下觀察。

實(shí)施例2 600例臨床標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率對(duì)比

對(duì)600例患者的標(biāo)本分別采用本發(fā)明實(shí)施例1的配方和背景技術(shù)中所述配方以及革蘭氏染色進(jìn)行真菌檢測(cè)，結(jié)果如下表所示：

表3

利用本產(chǎn)品和傳統(tǒng)革蘭氏染色法對(duì)真菌感染樣本進(jìn)行染色，本產(chǎn)品染色結(jié)果(圖2)背景色差大，區(qū)分明顯，真菌與熒光素結(jié)合完全發(fā)出熒光，極易分辨。傳統(tǒng)革蘭氏染色(圖3)背景不易區(qū)分，且無(wú)法分辨真菌形態(tài)，很容易被忽略。從而驗(yàn)證了本產(chǎn)品的優(yōu)越性和有效性。另外，與KOH濕片法相比，本發(fā)明染色液大大提高了陽(yáng)性檢出率。

實(shí)施例3 真菌熒光染色液穩(wěn)定性測(cè)試

對(duì)以下濃度范圍的熒光染色液進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。

表4

1、熱穩(wěn)定性測(cè)試：

將待檢熒光染色液樣品置于80℃水浴一周，取出，肉眼觀察液體沒有分層；滴一滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，無(wú)結(jié)晶析出；用接種環(huán)取少許紅色毛癬菌置于載玻片，滴一滴A液，1分鐘后第一滴B液，蓋上蓋玻片，輕壓后用吸水紙吸取多余液體，置熒光顯微鏡下觀察，菌絲發(fā)藍(lán)色熒光，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，背景無(wú)雜質(zhì)，熒光衰減周期大于10分鐘。

與常溫下放置的熒光染色液樣品對(duì)比無(wú)明顯差異。

2、冷穩(wěn)定性測(cè)試：

將待檢熒光染色液樣品置于-20℃，反復(fù)凍融7次，取出，肉眼觀察液體沒有分層；滴一滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，無(wú)結(jié)晶析出；用接種環(huán)取少許紅色毛癬菌置于載玻片，滴一滴A液，1分鐘后第一滴B液，蓋上蓋玻片，輕壓后用吸水紙吸取多余液體，置熒光顯微鏡下觀察，菌絲發(fā)藍(lán)色熒光，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，背景無(wú)雜質(zhì)，熒光衰減周期大于10分鐘。

將待檢熒光染色液樣品于-20℃冰箱放置一年，取出，肉眼觀察液體沒有分層；滴一滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，無(wú)結(jié)晶析出；用接種環(huán)取少許紅色毛癬菌置于載玻片，滴一滴A液，1分鐘后第一滴B液，蓋上蓋玻片，輕壓后用吸水紙吸取多余液體，置熒光顯微鏡下觀察，菌絲發(fā)藍(lán)色熒光，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，背景無(wú)雜質(zhì)，熒光衰減周期大于10分鐘。

3、常溫穩(wěn)定性測(cè)試：

將待檢樣品熒光染色液置于室溫2年，肉眼觀察液體沒有分層；滴一滴于載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，無(wú)結(jié)晶析出；用接種環(huán)取少許紅色毛癬菌置于載玻片，滴一滴A液，1分鐘后第一滴B液，蓋上蓋玻片，輕壓后用吸水紙吸取多余液體，置熒光顯微鏡下觀察，菌絲發(fā)藍(lán)色熒光，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰，背景無(wú)雜質(zhì)，熒光衰減周期大于10分鐘。

實(shí)施例4

1、二甲基亞砜

采用單因素實(shí)驗(yàn)，改變二甲基亞砜的濃度，考察二甲基亞砜對(duì)染色液效果的影響。染色的樣本為紅色毛癬菌。

表5

結(jié)果如下：

實(shí)施例5

熒光增白劑28

采用單因素實(shí)驗(yàn)，改變熒光增白劑28的濃度，考察熒光增白劑28對(duì)染色液效果的影響。染色的樣本為紅色毛癬菌。

表6

結(jié)果如下：

實(shí)施例6

氫氧化鉀

采用單因素實(shí)驗(yàn)，改變氫氧化鉀的濃度，考察氫氧化鉀對(duì)染色液效果的影響。檢測(cè)樣本為陽(yáng)性皮屑樣本。

表7

結(jié)果如下：

實(shí)施例7

甘油

采用單因素實(shí)驗(yàn)，改變甘油的濃度，考察甘油對(duì)染色液效果的影響。染色的樣本為紅色毛癬菌。

表7

結(jié)果如下：

隨甘油濃度升高，顯微鏡視野會(huì)存在輕微的分層現(xiàn)象(10％)，但是對(duì)比不明顯，對(duì)染色效果影響不明顯。

實(shí)施例8

伊文思藍(lán)

采用單因素實(shí)驗(yàn)，改變伊文思藍(lán)的濃度，考察伊文思藍(lán)對(duì)染色液效果的影響。染色的樣本為紅色毛癬菌。

表8

結(jié)果如下：