本發(fā)明涉及一種利用Hoechst 33258熒光染料對活細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的檢測方法，屬于生物活性細(xì)胞檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

體外細(xì)胞模型是一種在離體狀態(tài)下模擬生物體生長環(huán)境，檢測外界刺激對細(xì)胞影響的技術(shù)。采用細(xì)胞作為試驗對象，具有敏感性高、能夠大大縮短試驗周期、作用機(jī)制易于探明等優(yōu)勢，不僅提高了毒理學(xué)檢測的效率還減少了動物的使用，是生物學(xué)評價體系中重要的平臺。氧化損傷機(jī)制是多種污染物的重要致毒機(jī)制。在采用體外細(xì)胞模型評價污染物毒性的過程中，常常需要檢測細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)含量以表征機(jī)體受到的氧化損傷。傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)ROS檢測方法通過選擇合適的熒光探針對細(xì)胞進(jìn)行孵育，然后通過記錄細(xì)胞所發(fā)射的熒光信號值強(qiáng)弱確定細(xì)胞內(nèi)ROS含量。儀器記錄的熒光信號值是由每個細(xì)胞所發(fā)出的熒光強(qiáng)度和總的細(xì)胞數(shù)所決定的。但在現(xiàn)有的技術(shù)中，常常忽略細(xì)胞數(shù)量變化所導(dǎo)致的最終熒光強(qiáng)度的改變，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。在污染物暴露過程中，由于污染物的影響可能會導(dǎo)致處理組和對照組之間活細(xì)胞數(shù)目的差異，因此有必要對各孔剩余的活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行定量以補(bǔ)償細(xì)胞數(shù)量不同所造成的熒光信號值的差異。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用Hoechst 33258熒光染料對活細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的檢測方法，該方法能夠得到不同濃度下暴露污染物對應(yīng)的單個活細(xì)胞的DCF熒光信號值。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種利用Hoechst 33258熒光染料對活細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的檢測方法，包括如下步驟：

步驟1，選擇人肝癌細(xì)胞株HepG2作為試驗用細(xì)胞株，并對試驗用細(xì)胞株進(jìn)行消化吹打處理形成細(xì)胞懸液；

步驟2，用血球計數(shù)板測定細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度，以每孔10000個細(xì)胞的密度將細(xì)胞種入96孔板中；

步驟3，種板24h后，對細(xì)胞進(jìn)行染毒暴露，將不同濃度的暴露污染物分別加入不同的孔板中；

步驟4，染毒24h后，將每個孔板中原有培養(yǎng)基采用50μL DCF孵育液替換，于37℃下孵育25min，孵育后用PBS緩沖液清洗，采用酶標(biāo)儀檢測各孔板內(nèi)細(xì)胞的DCF熒光信號值；

步驟5，再向每個孔板加入100μL Hoechst 33258孵育液，于37℃下孵育15min，孵育后用PBS緩沖液洗滌，采用酶標(biāo)儀檢測各孔板內(nèi)細(xì)胞的Hoechst 33258熒光信號值，得到每個孔板中活細(xì)胞的數(shù)量；

步驟6，將步驟4得到的每個孔板中的DCF熒光信號值除以對應(yīng)孔板中細(xì)胞的Hoechst 33258熒光信號值，得到不同暴露污染物濃度下對應(yīng)單個活細(xì)胞的DCF熒光信號值。

其中，步驟1中，先將試驗用細(xì)胞株用PBS緩沖液清洗；清洗后用胰蛋白酶-EDTA溶液消化細(xì)胞；細(xì)胞消化后用含血清的培養(yǎng)基終止消化；最后將得到的細(xì)胞懸液吹勻即可。

其中，步驟3中，所述暴露污染物為砷。

其中，步驟4中，所述DCF孵育液的濃度為10μM。

其中，步驟4中，所述DCF孵育液對應(yīng)的DCFH-DA熒光染料的激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為530nm。

其中，步驟5中，所述Hoechst 33258孵育液的濃度為5μg/ml。

其中，步驟5中，所述Hoechst 33258孵育液對應(yīng)的Hoechst 33258熒光染料的激發(fā)波長為630nm，發(fā)射波長為710nm。

與現(xiàn)有檢測方法相比，本發(fā)明利用Hoechst 33258熒光染料對活細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的檢測方法具有的有益效果為：

本發(fā)明對細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的檢測方法檢測結(jié)果精確，克服了由于污染物暴露導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量變化從而使最終熒光強(qiáng)度測量不準(zhǔn)確的問題，本發(fā)明檢測方法能夠真實反映在某個濃度下對應(yīng)的單個細(xì)胞熒光信號值，從而能夠真實準(zhǔn)確反映污染物暴露對細(xì)胞的損傷，為體外細(xì)胞模型在污染物毒性評價中的應(yīng)用打下了更為扎實的基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為不同濃度的As暴露后各孔板內(nèi)活細(xì)胞的數(shù)量變化圖；

圖2為不同濃度的As暴露后各孔板內(nèi)細(xì)胞DCF熒光信號值變化圖；

圖3為對比實施例的檢測方法得到的不同濃度As暴露下各孔板內(nèi)細(xì)胞DCF熒光信號值變化圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說明。

實施例1

一種利用Hoechst 33258熒光染料對活細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的檢測方法，包括如下步驟：

步驟1，選擇人肝癌細(xì)胞株HepG2作為試驗用細(xì)胞株，在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)，去除原有培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞1～2次，往培養(yǎng)皿中加入1mL胰蛋白酶-EDTA溶液，對細(xì)胞進(jìn)行消化；待細(xì)胞消化結(jié)束，加入10mL含血清的新鮮培養(yǎng)基終止消化，將得到的細(xì)胞懸液吹勻；

步驟2，用血球計數(shù)板測定細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度，以每孔10000個細(xì)胞的密度將細(xì)胞種入96孔板中；

步驟3，種板24h后，對細(xì)胞進(jìn)行染毒暴露，將不同濃度的暴露污染物砷分別加入不同的孔板中；

步驟4，利用DCFH-DA探針檢測砷暴露誘導(dǎo)下細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)的含量，染毒24h后，將每個孔板中原有培養(yǎng)基采用50μL終濃度為10μM的DCF孵育液替換，于37℃下孵育25min，孵育后用PBS緩沖液清洗2次，采用酶標(biāo)儀檢測各孔板內(nèi)細(xì)胞的DCF熒光信號值；

步驟5，再向每個孔板中加入100μL終濃度為5μg/ml的Hoechst 33258孵育液，于37℃下孵育15min，孵育后用PBS緩沖液洗滌2次，采用酶標(biāo)儀檢測各孔板內(nèi)細(xì)胞的Hoechst 33258熒光信號值，得到每個孔板中活細(xì)胞的數(shù)量；

步驟6，將步驟4得到的每個孔板中的DCF熒光信號值除以對應(yīng)孔板中細(xì)胞的Hoechst 33258熒光信號值，得到不同暴露污染物濃度下對應(yīng)每個活細(xì)胞的熒光信號值。

DCFH-DA熒光染料的激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為530nm；Hoechst 33258熒光染料的激發(fā)波長為630nm，發(fā)射波長為710nm。

如圖1所示，通過Hoechst 33258熒光信號值可以看出，隨著暴露污染物砷(As)濃度的增加，各孔板中活細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)顯著性減少；圖2為經(jīng)過Hoechst 33258熒光信號值標(biāo)準(zhǔn)化后各孔板的DCF信號值，從圖2可以看出，從暴露污染物砷(As)濃度為5μM起，暴露污染物砷(As)濃度的增大顯著提高了細(xì)胞內(nèi)的ROS含量，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

對比實施例

一種對細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的檢測方法，包括如下步驟：

步驟1，選擇人肝癌細(xì)胞株HepG2作為試驗用細(xì)胞株，在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)，去除原有培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗細(xì)胞1～2次，往培養(yǎng)皿中加入1mL胰蛋白酶-EDTA溶液，對細(xì)胞進(jìn)行消化；待細(xì)胞消化結(jié)束，加入10mL含血清的新鮮培養(yǎng)基終止消化，將得到的細(xì)胞懸液吹勻；

步驟2，用血球計數(shù)板測定細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度，以每孔10000個細(xì)胞的密度將細(xì)胞種入96孔板中；

步驟3，種板24h后，對細(xì)胞進(jìn)行染毒暴露，將不同濃度的暴露污染物砷分別加入不同的孔板中；

步驟4，染毒24h后，將每個孔板中原有培養(yǎng)基采用50μL終濃度為10μM的DCF孵育液替換，于37℃下孵育25min，孵育后用PBS緩沖液清洗2次；采用酶標(biāo)儀檢測各孔板內(nèi)細(xì)胞的DCF熒光信號值。

DCFH-DA熒光染料的激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為530nm。

如圖2～3所示，未經(jīng)Hoechst 33258熒光信號值標(biāo)準(zhǔn)化的DCF熒光信號和標(biāo)準(zhǔn)化后的呈現(xiàn)很大不同：首先，本應(yīng)存在顯著性差異的暴露污染物砷(As)濃度為5μM時處理組未表現(xiàn)出顯著性差異，其原因在于細(xì)胞數(shù)量的減少使得總的DCF熒光信號值變化不明顯；其次，圖3的實驗結(jié)果沒有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，其原因同樣是忽略了細(xì)胞數(shù)量變化所導(dǎo)致的。