本發(fā)明涉及液體樣品檢測，具體是涉及一種表面不對稱微粒探針應(yīng)用于液體性質(zhì)的原位檢測方法。

背景技術(shù)：

包括粘度、粘彈性等的液體流變學(xué)特性是應(yīng)用最廣泛的液體物化特性參數(shù)之一，可以用來辨別材料特性、預(yù)測材料功能；結(jié)合時間也可以反應(yīng)物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)過程、溫度變化過程、相變過程等；適度的流變學(xué)特性還可以促進生產(chǎn)效率、增強產(chǎn)品功能。生活中常見的液體類物質(zhì)包括油漆、化妝品、乳液、食品類、醫(yī)藥類樣品等，在其生產(chǎn)的不同階段都需檢測其流變學(xué)特性作為產(chǎn)品質(zhì)量控制的手段之一。目前常用傳統(tǒng)機械方法進行旋轉(zhuǎn)測量、振蕩測量等給出流動和粘度曲線、時間依賴性、頻率依賴性等，測試系統(tǒng)包括同心圓筒、平行板、錐板等。但傳統(tǒng)機械方法存在以下不足：一是樣品用量大(幾至幾十毫升)，不適用于高價值樣品或尚不能批量生產(chǎn)的產(chǎn)品；二是機械方法外力作用較大，對于易破損樣品損傷大；三是有些樣品的性質(zhì)內(nèi)部差異較大，傳統(tǒng)方法測的平均值無法反映實際微觀性質(zhì)。

已有一些基于微米或納米粒子的探針光學(xué)成像技術(shù)應(yīng)用于流體科學(xué)、生命科學(xué)及其它相關(guān)學(xué)科的前沿研究，依據(jù)布朗熱運動理論，建立了微粒探針與流體流變學(xué)性質(zhì)的數(shù)學(xué)關(guān)聯(lián)(T.G.Mason,K.Ganesan,J.H.van Zanten,et al.Phy.Rev.Lett.,79:3282-3285；M.L.Gardel,M.T.Valentine,J.C.Crocker,et al.Phy.Rev.Lett.,91:158302)。理論上的壁面效應(yīng)也仍適用(M.Lisicki,B.Cichocki,S.A.Rogers,et al.Soft Matter,2014,10:4312-4323)。專利CN1891720A，CN102071018B，CN103374352A等提出了納米微粒和微球生物熒光探針的制備方法，做了有益嘗試。然而這些方法采用的粒子均為普通球狀微粒，不能夠觀察到轉(zhuǎn)動，且在液體樣品性質(zhì)檢測的精密度上有待提高。以金屬半殼修飾熒光微粒后，其光亮度受金屬半殼遮擋能夠隨轉(zhuǎn)動不斷變化，借助光亮度的變化實現(xiàn)對液相粘度的分辨(C.J.Behrend,J.N.Anker,R.Kopelman,Appl.Phy.Lett.,84:154-156)。使用尺寸合適的熒光球狀微粒時，在光學(xué)顯微鏡下隨本體轉(zhuǎn)動呈現(xiàn)可分辨的不同形狀，如蛾眉月、凸月、殘月等。借助月相反映出粒子的三維方位，進而綜合平動和轉(zhuǎn)動，可以更精準地推斷出液體樣品的流變學(xué)特性(S.M.Anthony,L.Hong,M.Kim,et al.Langmuir,22:9812-9815)。對微粒動態(tài)的描述需要能夠較高效率地分析處理非圓形圖像，但當前所用方法仍較為繁瑣，且目前未有規(guī)則統(tǒng)一、較為標準、易于比較的測定方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明提供一種可實現(xiàn)樣品用量經(jīng)濟、適用性好、操作簡單、分析自動、精密度高的表面不對稱微粒探針應(yīng)用于液體性質(zhì)的原位檢測方法。

本發(fā)明的具體步驟如下：

1)制備表面不對稱微粒探針，具體方法如下：將微米級球形粒子的水相分散液滴加于基底片上的Teflon環(huán)內(nèi)，蒸發(fā)液相后，得到緊密組裝的微粒單層；將基底片和微粒單層蒸鍍金屬薄膜后，超聲，使微粒從基底片上脫落，再依次經(jīng)離心、乙醇洗滌、再離心、雙蒸水洗滌，重新得到表面不對稱微粒探針(以下簡稱探針)的水相分散液；

2)在載玻片上刻蝕兩個樣品池，制成樣品片，將樣品片和蓋玻片經(jīng)食人魚溶液浸泡、雙蒸水潤洗干凈、氮氣吹干；

3)將探針分散于待測液體樣品中；

4)觀察樣品池的準備，具體方法如下：向步驟2)得到的樣品片樣品池內(nèi)加入步驟3)得到的含探針的待測液體樣品中，蓋上蓋玻片，以密封膠封裝蓋玻片四周形成2個裝滿待測液體樣品的密閉觀察區(qū)域；

5)圖像的獲?。簩⒉襟E4)中的樣品片固定在光學(xué)顯微鏡下并找到數(shù)量適宜的探針聚焦，可以清晰看到單個探針及其邊界，用照相機連續(xù)拍攝2000～3000幀圖像，再寫入PC，每個樣品池拍攝4個樣品點，以獲得足夠多的粒子運動圖像；

6)圖像處理和數(shù)據(jù)分析：將步驟5)得到的圖像序列以ImageJ和MATLAB程序進行追蹤處理及數(shù)據(jù)分析后，得到待測液體樣品的流變學(xué)性質(zhì)；

7)回收樣品片：以丙酮浸泡+超聲處理使密封膠溶脹并脫離，樣品片再經(jīng)食人魚溶液浸泡、雙蒸水潤洗干凈、氮氣吹干，可重復(fù)使用。

在步驟1)中，所述球形粒子可選自球形聚苯乙烯粒子、球形二氧化硅粒子、球形PMMA粒子等中的一種；球形粒子的直徑可為2～4μm；所述基底片可采用玻璃載玻片或硅片；所述蒸發(fā)液相可在室溫下蒸發(fā)液相；所述將基底片和微粒單層蒸鍍金屬薄膜可將基底片和微粒單層置于物理氣相沉積或濺射鍍膜設(shè)備中蒸鍍金屬薄膜；所述蒸鍍金屬薄膜的厚度可為20～30nm，所述蒸鍍金屬薄膜的金屬可采用金或鉑等貴金屬；所述超聲可在蒸餾水中超聲10～30min。

在步驟2)中，所述兩個樣品池的尺寸可為10mm×10mm×(20～40)μm、10mm×10mm×(40～100)μm或Φ10mm×(40～100)μm；此種設(shè)計能將探針限定于近二維運動；所述蓋玻片可采用(15～20)mm×(15～20)mm的標準正方形蓋玻片。

在步驟3)中，所述待測液體樣品可為蒸餾水、丙三醇、聚乙二醇、不溶解微粒、蒸鍍薄膜、不與探針進行化學(xué)反應(yīng)的液相樣品、不與探針進行化學(xué)反應(yīng)的藥品等中的至少一種；所述將探針分散于待測液體樣品中的具體方法可為：取探針加入待測液體樣品至低濃度分布，所述低濃度分布是濃度以最終能覆蓋觀察樣品池底面1％～2％的面積。

在步驟4)中，所述含探針的待測液體樣品的加入量最好每一樣品片樣品池加80～120μL；所述密封膠可采用環(huán)氧樹脂AB膠類化學(xué)穩(wěn)定性較好、凝固較快的相變膠。

在步驟5)中，所述光學(xué)顯微鏡可采用立式熒光顯微鏡、倒立式熒光顯微鏡、立式白光顯微鏡或倒立式白光顯微鏡等；所述光學(xué)顯微鏡下的光學(xué)放大倍數(shù)可為20～50倍；所述連續(xù)拍攝的拍攝速度可為6～20fpm；所述寫入PC可以.avi，.seq，.gif等與ImageJ軟件和MATLAB兼容的格式。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是：

去除了機械外力作用和影響，對樣品干擾??；裝置搭建和操作簡單；測試樣品僅需μL量級，測試微粒探針用量少；優(yōu)化了非圓形圖像的分析和數(shù)據(jù)處理；檢測精度高，檢測信息量更豐富，能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的區(qū)域性性質(zhì)分辨。

本發(fā)明可以實現(xiàn)：

(1)表面不對稱微粒探針的批量制備，可以根據(jù)應(yīng)用環(huán)境的改變選擇微粒探針的材質(zhì)。

(2)測試樣品池的搭建和重復(fù)使用。

(3)簡單易行的圖像獲得和分析。

(4)以少數(shù)探針獲得相對精準的液體樣品流變學(xué)性質(zhì)分析。

附圖說明

圖1是實施例1中表面不對稱微粒探針的制備流程圖。圖中：1是Teflon環(huán)，2是硅片基底，3是未修飾前的微粒，4是金屬沉積，5是重新分散后的探針。

圖2是實施例1中制得的探針的掃描電子顯微鏡圖。

圖3是實施例2中樣品池和探針觀測裝置搭建示意圖。在圖3中：5是分散在其中的探針，6是樣品片上刻蝕的兩個凹槽樣品池。

圖4是實施例2中探針的光學(xué)圖像。每兩圖之間間隔時間10s。

圖5是實施例1中制得的探針的光學(xué)圖像隱含的兩個不同方位示意圖。在圖5中，其中7是探針的未修飾熒光部分在光學(xué)顯微鏡下形成的彎月形封閉區(qū)域，θ是天頂角，表明未修飾熒光部分-金屬半殼部分的分隔平面8與圖像平面9的夾角；φ是方位角，表明彎月形封閉區(qū)域在圖像平面9中的方向。

圖6是實施例3中探針光學(xué)圖像和利用ImageJ功能“Fit Ellipse”實現(xiàn)的在月相圖形上擬出的橢圓(實線框)。

圖7是實施例3中探針月相圖形中心和體中心幾何關(guān)系的示意圖。在圖7中：空白區(qū)域是粒子熒光部分，陰影線區(qū)域是金屬半殼部分，φ是方位角，θ是天頂角，(x,y)是月相圖形7的亮度加權(quán)中心，(x_C,y_C)是實際體中心投影，d是兩中心之間距離。

圖8是實施例4中探針實際體中心的平動均方位移隨運動時間的變化。

圖9是實施例4中探針的轉(zhuǎn)動均方位移隨運動時間的變化。

圖10是實施例5中探針實際體中心的平動均方位移隨運動時間的變化。

圖11是實施例5中探針的轉(zhuǎn)動均方位移隨運動時間的變化。

具體實施方式

以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。

本發(fā)明實施例的具體步驟如下：

1)制備表面不對稱微粒探針：將微米級球形粒子的水相分散液滴加于基底片2上的Teflon環(huán)1內(nèi)，蒸發(fā)液相后，得到緊密組裝的微粒單層3；將基底片2和微粒單層3蒸鍍金屬薄膜4后，超聲，使微粒從基底片2上脫落，再依次經(jīng)離心、乙醇洗滌、再離心、雙蒸水洗滌，重新得到表面不對稱微粒探針5(以下簡稱探針)的水相分散液；所述蒸發(fā)液相可在室溫下蒸發(fā)液相；所述將基底片2和微粒單層3蒸鍍金屬薄膜4可將基底片2和微粒單層3置于物理氣相沉積或濺射鍍膜設(shè)備中蒸鍍金屬薄膜4；所述超聲可在蒸餾水中超聲10～30min。

2)在載玻片上刻蝕兩個樣品池6，制成樣品片，將樣品片和蓋玻片經(jīng)食人魚溶液浸泡、雙蒸水潤洗干凈、氮氣吹干；所述兩個樣品池6的尺寸可為10mm×10mm×(40～100)μm，或Φ10mm×(40～100)μm；此種設(shè)計能將探針限定于近二維運動。

3)將探針5分散于待測液體樣品中：取探針5加入待測液體樣品至低濃度分布，所述低濃度分布是濃度以最終能覆蓋觀察樣品池6底面1％～2％的面積。

4)觀察樣品池的準備：向步驟2)得到的樣品片樣品池6內(nèi)加入步驟3)得到的含探針的待測液體樣品中，蓋上蓋玻片，以密封膠封裝蓋玻片四周形成2個裝滿待測液體樣品的密閉觀察區(qū)域；所述含探針的待測液體樣品的加入量最好每一樣品片樣品池加80～120μL。

5)圖像的獲?。簩⒉襟E4)中的樣品片固定在光學(xué)顯微鏡下并找到數(shù)量適宜的探針5聚焦，可以清晰看到單個探針及其邊界，用照相機連續(xù)拍攝2000～3000幀圖像，以.avi，.seq，.gif等格式寫入PC，每個樣品池拍攝4個樣品點，以獲得足夠多的粒子運動圖像；所述光學(xué)顯微鏡下的光學(xué)放大倍數(shù)可為20～50倍；所述連續(xù)拍攝的拍攝速度可為6～20fpm。

6)圖像處理和數(shù)據(jù)分析：將步驟5)得到的圖像序列以ImageJ和MATLAB程序進行追蹤處理及數(shù)據(jù)分析后，得到待測液體樣品的流變學(xué)性質(zhì)；

7)回收樣品片：以丙酮浸泡+超聲處理使密封膠溶脹并脫離，樣品片再經(jīng)食人魚溶液浸泡、雙蒸水潤洗干凈、氮氣吹干，可重復(fù)使用。

以下給出具體實施例。

實施例1

表面不對稱微粒探針的制備

將清洗干凈、氮氣吹干的硅片和內(nèi)徑12mm、高度3～5mm的Teflon環(huán)用長尾夾夾成一個液池，將市售的粒徑4μm聚苯乙烯熒光粒子分散液直接或濃縮至10％(w/V)后，滴加在液池內(nèi)硅片基底上，室溫下靜置于水平放置的蒸發(fā)皿內(nèi)，待液體全部蒸發(fā)即組裝成粒子單層模版。形成的單層模版及基底在物理氣相沉積中依次沉積5nm厚的鈦薄膜、25nm厚的金薄膜實現(xiàn)表面不對稱。取出，洗耳球輕輕吹去可能的雜質(zhì)，在清洗干凈的旋蓋小玻璃瓶中放適量蒸餾水沒過基底硅片，將其置于超聲槽中超聲。5～10min后，大部分粒子可以從硅片基底上脫離下來。將液體分批轉(zhuǎn)移至2.0mL的離心管內(nèi)分離粒子并依次用乙醇、雙蒸水洗滌。最后仍集中重新分散于旋蓋小玻璃瓶內(nèi)2～5mL的雙蒸水中，4℃保存?zhèn)溆?。假?0％的基底表面覆蓋率和80％的回收率，一次可獲得～4×10⁶個探針。

圖1展示了探針制備流程。圖2是所制備探針的掃描電鏡圖像，平均粒徑4μm，探針表面明暗對比度表明了金屬半殼薄膜在聚苯乙烯微粒上的存在。

實施例2

探針觀測裝置的搭建和顯微鏡觀測

取適量實施例1中的分散液，混入不同體積的丙三醇，配制成不同濃度的丙三醇水溶液，輔以振蕩使得溶液和探針混合均勻。將樣品片、蓋玻片以食人魚溶液浸泡、雙蒸水潤洗干凈、氮氣吹干并放入鋪墊一層擦鏡紙的培養(yǎng)皿。樣品片上刻蝕有2個邊緣間隔至少20mm、尺寸為10mm×10mm×100μm的凹槽樣品池。以移液槍添加分散有探針的丙三醇水溶液至兩個樣品池中，各80～120μL，然后用鑷子緩慢傾斜地蓋上蓋玻片以避免氣泡的產(chǎn)生。以軟紙巾借助毛細作用仔細吸去周邊多余液體，用環(huán)氧樹脂AB膠密封邊緣，整個樣品片裝置置于顯微鏡載物臺上以備觀測。靜置1h，微粒在樣品池內(nèi)達到動態(tài)平衡，本實施例中微粒穩(wěn)定于樣品池底表面附近，與底表面的距離由微粒與液相相對密度、兩個表面電荷分布決定，一般在200～300nm左右。使用熒光顯微鏡，在低倍下尋找到合適區(qū)域，換至40×或50×物鏡聚焦使探針圖像清晰，圖像區(qū)域內(nèi)一般有10個以下探針，面積覆蓋率約1％，理論上僅需實施例1中制備所得探針總數(shù)量的1％～2％。采用UEye CMOS照相機以10幀每s的速度連續(xù)拍攝2000幀，存為.avi文件。然后切換至不同位置及第二個樣品池，依次各拍攝2000幀連續(xù)圖像序列。

圖3展示了樣品池和觀測裝置搭建的示意圖；

圖4展示了三個探針在三個時刻A、B、C、每兩時刻之間間隔10s的光學(xué)圖像。

實施例3

非圓形的探針圖像分析

首先界定探針在照相機圖像中呈現(xiàn)的月相圖形和其在三維空間中方位的關(guān)系。如圖5所展示，天頂角θ與探針呈現(xiàn)出的月相圖形形狀即總亮度相關(guān)，方位角φ則為探針月相圖形7的兩個尖端連線與圖像平面9橫軸的夾角。

為減少圖片中的干擾因素，首先將圖片轉(zhuǎn)換為灰度、去噪、背景分離，而后逐行逐列對每一像素的亮度值進行鑒定。利用MATLAB依次分析每個圖像序列內(nèi)的每幀圖片，確定每個探針月相圖形的總亮度、其中心在圖像平面內(nèi)的方位。像素亮度在閾值以上的認為是探針月相圖形的一部分，計入總亮度，并按照月相圖形內(nèi)各像素亮度計算出其加權(quán)中心(x，y)。閾值定為該幀內(nèi)該探針的月相圖形內(nèi)最大亮度像素亮度的5％。

探針上沉積的金屬可以認為接近完美半殼，θ與月相圖形總亮度的關(guān)系如式一所示：

式一：I＝A×(1+cosθ)

式一中：I是某一個探針在圖像序列中某一幀圖片中呈現(xiàn)的月相圖形的總亮度，由上述MATLAB圖像處理分析得出；A是探針呈現(xiàn)滿月時月相圖形亮度的一半，或者呈現(xiàn)半月時的月相圖形亮度值；θ是此月相圖形的天頂角，將依據(jù)式一利用I和A的數(shù)值計算得出。

方位角由ImageJ的“Fit Ellipse”功能給出。如圖6所示，此功能給出與月相圖形最大重合的橢圓。橢圓長軸與月相圖形兩尖端的聯(lián)線平行，其與圖像平面形成的方位角即等同于微粒月相圖形在整個圖像平面中的方位角φ，再由ImageJ的“Analyze Particles”功能讀出其數(shù)值。

最后基于天頂角和方位角，根據(jù)幾何關(guān)系原理算出探針的實際體中心投影(x_C，y_C)。圖7說明了探針三維形體與其二維圖像的幾何關(guān)系。

實際體中心投影與月相圖形加權(quán)中心的關(guān)系如式二所示：

式二：

式二中：d為月相圖形中心(x，y)和實際體中心投影(x_C，y_C)之間的距離，a是探針半徑，θ是天頂角，φ是方位角。

實施例4

運動軌跡(均方位移)數(shù)據(jù)歸納與計算

利用MATLAB數(shù)據(jù)分析程序，計算出從初始狀態(tài)t＝0開始不同運動時間探針的均方平動和轉(zhuǎn)動位移(平均值)。運動時間選取為0s、0.1s、0.2s、0.3s….4.0s。每個樣品池中每個測試點在圖像中一般展現(xiàn)5個以下探針，為增強系統(tǒng)統(tǒng)計性和測量結(jié)果準確性，采用先計算每個探針的時間平均再綜合起來進行探針間的系綜平均。

丙三醇水溶液為簡單黏性液體，理論上探針在其中的熱運動均方位移與運動間隔時間有線性關(guān)系，如式三所示：

式三：

式三中：MSD表示均方位移，下標的t表示平動，r表示轉(zhuǎn)動，D_t是平動擴散系數(shù)，D_r是轉(zhuǎn)動擴散系數(shù)，Δt是運動時間，f(a/z)、g(a/z)為無量綱壁效應(yīng)，a是探針半徑，z是探針體中心距樣品池底面距離。當a/z→0時，f、g→1。對于4μm探針在類似實施例1系統(tǒng)中，z為2.2-2.3μm，f一般在0.45，g一般在0.8。

利用上述式三，在圖8和9中綜合了20個探針在55.8wt％丙三醇水溶液中熱運動的時間-系綜平均。圖8是平動均方位移隨時間的變化，圖9是轉(zhuǎn)動均方位移隨時間的變化。

實施例5

按照上述實施例1-4的方法和步驟，不同的是丙三醇水溶液濃度為38.7wt％，圖10和11中綜合了20個探針在38.7％丙三醇水溶液中熱運動的時間-系綜平均。圖10是平動均方位移隨時間的變化，圖11是轉(zhuǎn)動均方位移隨時間的變化。

式三中均方位移與時間呈現(xiàn)線性關(guān)系，該線性關(guān)系決定的斜率與液體的粘度相關(guān)，如式四所示：

式四：

式四中，D_t是平動擴散系數(shù)，D_r是轉(zhuǎn)動擴散系數(shù)，k_B是玻爾茲曼常數(shù)，T是測試時液體樣品絕對溫度，μ是該液體樣品粘度，a是探針半徑。實驗中探針所處溫度在25±2℃，利用式四計算待測液體粘度，并將上述實施例4和5的結(jié)果綜合于表1。

表1

理論上探針越接近壁面，受拖拽作用越大，而轉(zhuǎn)動又比平動受拖拽作用相對小，所以探針轉(zhuǎn)動表觀粘度比平動表觀粘度要小得多。本發(fā)明基于表面不對稱微粒探針的檢測方法比機械測量法能獲得更多的液體樣品信息。

本發(fā)明在顯微鏡下連續(xù)成像，然后經(jīng)過圖像處理、利用微粒的光學(xué)成像不對稱性同時獲得微粒的平動和轉(zhuǎn)動動力學(xué)行為，從而推出液體介質(zhì)的流變學(xué)性質(zhì)，增加檢測準確性；進而用生物大分子修飾表面，可利用化學(xué)性質(zhì)不對稱性對轉(zhuǎn)動的影響檢測大分子間作用力。該方法樣品用量低、操作簡便、圖像處理和數(shù)據(jù)處理自動化高、精確性好，更適用于高價值的液體樣品，且原位檢測解決了機械粘度計、流變儀等傳統(tǒng)方法主要檢測平均性質(zhì)、對易破損液體樣品損傷較大等局限和缺點，是一種高效率、高準確性的檢測方法。