本發(fā)明屬于醫(yī)藥學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種天然藥物活性成分的篩選方法。

背景技術(shù)：

中藥或天然藥物復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，具備長(zhǎng)期民間應(yīng)用基礎(chǔ)，是新藥研發(fā)主要來(lái)源。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明由于中藥或天然藥物復(fù)方成分復(fù)雜、多樣，它們是以多途徑、多靶點(diǎn)、多受體形式發(fā)揮治療作用。目前，從中藥或天然藥物復(fù)方篩選活性成分的方法主要是提取分離法，它與藥理學(xué)相結(jié)合，為活性成分的發(fā)現(xiàn)與分離作出積極貢獻(xiàn)；近年，分離技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，大大加快藥物活性成分的篩選速度，發(fā)現(xiàn)了一大批活性成分。但值得關(guān)注的是，天然藥物分離技術(shù)忽略了中藥或天然藥物中多組分共存，在藥物提取過(guò)程中相互作用的特點(diǎn)。所以，在未考慮整個(gè)復(fù)雜體系中多種化學(xué)成分相互作用關(guān)系的前提下，傳統(tǒng)的溶劑提取法易于將多數(shù)的活性成分在分離過(guò)程中丟失。另外，由于不能夠及時(shí)地進(jìn)行活性跟蹤，花費(fèi)大量時(shí)間分離得到的化學(xué)成分往往沒(méi)有活性，造成了大量人力、物力及資源的浪費(fèi)。

中藥復(fù)方是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，根據(jù)經(jīng)典的“君臣佐使”配伍規(guī)律而組成。中藥復(fù)方活性成分研究有助于闡明中藥復(fù)方配伍的組成原理及作用機(jī)制，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，也為創(chuàng)新中藥奠定理論基礎(chǔ)。中藥復(fù)方作為一個(gè)復(fù)雜的科學(xué)系統(tǒng)，通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮作用，其主要藥效物質(zhì)是中藥活性成分的組合。任何中藥(單味或復(fù)方)的任何一種生物效應(yīng)，均來(lái)自該中藥的一種特定中藥分子組合(包括種類與數(shù)量)，但其活性成分組合的總體效應(yīng)不能用每一成分單獨(dú)作用結(jié)果的線性疊加來(lái)表示。拆方研究是中藥復(fù)方配伍規(guī)律的重要手段之一，采取整體藥理試驗(yàn)，并以藥效學(xué)指標(biāo)為依據(jù)對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行拆分研究。但上述研究均是以動(dòng)物生理機(jī)能改變、生化指標(biāo)變化或組織形態(tài)學(xué) 變化等作為觀測(cè)其藥理作用和探討其作用機(jī)理的指標(biāo)。這些指標(biāo)無(wú)法體現(xiàn)復(fù)方成分的加減或劑量改變對(duì)藥效的影響，難以闡明復(fù)方組成藥材或單一成分在復(fù)方中的貢獻(xiàn)。

代謝組學(xué)作為一門新興的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，主要用于研究生物體受到外界環(huán)境、疾病、藥物等干預(yù)后其代謝產(chǎn)物種類和數(shù)量的變化及變化規(guī)律。代謝組學(xué)能夠描述病癥的整個(gè)代謝過(guò)程所產(chǎn)生內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化，能忠實(shí)反映外界干預(yù)對(duì)機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程的微觀變化，其研究思路與中醫(yī)學(xué)整體觀及辯證論治等思維方式基本吻合。近年來(lái)代謝組學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究方興未艾，主要包括中醫(yī)癥候診斷、中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、中藥作用機(jī)制和中藥安全性評(píng)價(jià)等方面。研究結(jié)果表明，中藥尤其是復(fù)方藥物起效是通過(guò)多種成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)、涉及多基因和多生化通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，對(duì)機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整體調(diào)節(jié)，因此代謝組學(xué)這一技術(shù)適用于中醫(yī)藥研究?；谝嘿|(zhì)聯(lián)用技術(shù)的中藥或天然藥物復(fù)方化學(xué)成分定性、定量分析方法，被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)基礎(chǔ)研究并作為評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有效工具，但無(wú)法提供中藥或天然藥物復(fù)方的藥效學(xué)信息，無(wú)法使復(fù)方化學(xué)成分研究與藥效學(xué)研究進(jìn)行有機(jī)結(jié)合。

綜上所述，如何將各化學(xué)成分與藥效學(xué)有機(jī)結(jié)合且不破壞整體用藥的特點(diǎn)，是從中藥或天然藥物中活性成分篩選方法亟待解決的問(wèn)題。

己糖激酶(hexokinase，HK)是催化己糖使之磷酸化的酶，在正常組織中表達(dá)量很少。它是糖酵解途徑的第一個(gè)酶，也是糖酵解途徑的限速酶。己糖激酶在腫瘤組織中表達(dá)的量及活性的增加，使得腫瘤組織在缺乏氧的情況下，仍能保證足夠的能源，并且糖酵解的許多中間產(chǎn)物可以被瘤細(xì)胞所利用，以合成蛋白質(zhì)、核酸及脂類等，從而為瘤細(xì)胞本身的生長(zhǎng)和增生提供了必需的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤具有高糖代謝的特點(diǎn)：腫瘤細(xì)胞中大約60％的ATP來(lái)源于糖酵解途徑。鑒于己糖激酶對(duì)于各種腫瘤細(xì)胞活動(dòng)的重要意義，研究人員合理推測(cè)，若能尋找到有效的己糖激酶抑制劑，抑制該酶的活性，則抑制了腫瘤細(xì)胞的糖酵解，使腫瘤細(xì)胞不能獲得足夠的6-磷酸葡萄糖，ATP無(wú)法轉(zhuǎn)換為ADP為細(xì)胞 各種活動(dòng)提供能量，繼而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡。

現(xiàn)有制備工藝會(huì)消耗大量能源和有機(jī)溶劑，提取過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng)，提取的活性成分會(huì)含有大分子雜物，影響提取物的穩(wěn)定性。

目前，在醫(yī)藥、化工以及食品等行業(yè)中，涉及有效成份提取及濃縮方面的技術(shù)改進(jìn)大部分只是針對(duì)與各單獨(dú)的步驟，如針對(duì)提取階段應(yīng)用微波、超聲等手段加快提取效率，針對(duì)濃縮階段提出的微波濃縮及真空濃縮等；而且國(guó)內(nèi)的大部分制造廠商對(duì)于這兩種工序都是單獨(dú)設(shè)計(jì)單獨(dú)制造的，操作時(shí)也是分步操作，造成了提取劑及物料的極大浪費(fèi)，且易揮發(fā)的提取劑容易對(duì)環(huán)境造成污染。

在掃描成像過(guò)程中目前的掃描和成像方法，耗時(shí)較長(zhǎng)，因此對(duì)物品存在一定程度的缺陷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種天然藥物活性成分的篩選方法，旨在解決現(xiàn)有天然藥物活性成分提取方法浪費(fèi)提取劑及物料，提取劑容易對(duì)環(huán)境造成污染，在掃描成像過(guò)程中存在一定程度的缺陷的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種天然藥物活性成分的篩選方法，通過(guò)提取天然藥物的顯微圖像的特征，以ATP為底物的己糖激酶催化反應(yīng)，通過(guò)對(duì)ATP以及產(chǎn)物ADP的定量分析，篩選出中藥材中具己糖激酶抑制作用的活性組分，該天然藥物活性成分的篩選方法包括以下步驟：

步驟一、采集天然藥物原始圖像，對(duì)原始圖像進(jìn)行預(yù)處理，分割出目標(biāo)區(qū)域的輪廓，進(jìn)行圖像去噪；

步驟二、將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)PCNN與圖像對(duì)應(yīng)，將中心神經(jīng)元與圖像的像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)，中心神經(jīng)元的鄰域與鄰域像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)，神經(jīng)元的輸入為像素點(diǎn)的灰度值；

步驟三、基于Gabor函數(shù)計(jì)算所述像素點(diǎn)的K×K鄰域內(nèi)各個(gè)像素點(diǎn)的M的方向相似性；其中，K為所確定的W的矩陣的行數(shù)或列數(shù)；如果所述方向相似性在指定范圍內(nèi)，對(duì)所述K×K鄰域內(nèi)的像素點(diǎn)進(jìn)行一次點(diǎn)火，得到所述K×K鄰域內(nèi)的像素點(diǎn)的圖像分析數(shù)據(jù)，根據(jù)分析數(shù)據(jù)優(yōu)選出用于活性提取的天然藥物；

步驟四、建立高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法，在流動(dòng)相中添加5mM的醋酸銨，對(duì)ATP以及產(chǎn)物ADP檢測(cè)及定量分析；

步驟五、利用PCNN模型處理天然藥物顯微圖像，提取各顯微圖像的一維時(shí)間序列信號(hào)特征并存儲(chǔ)特征信息，作為PCNN處理的另一圖像特征，并結(jié)合天然藥物顯微圖像體視學(xué)要求的圖像目標(biāo)特征，提取天然藥物顯微圖像空域特征；

步驟六、基于高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)ATP進(jìn)行定量分析，測(cè)定以ATP作為底物的己糖激酶活性；

步驟七、對(duì)篩選得到的具己糖激酶抑制劑活性的中藥提取物進(jìn)行測(cè)定及計(jì)算。

進(jìn)一步，利用下列公式運(yùn)行PCNN模型：

F_ij[n]＝S_ij

L_ij[n]＝VLΣ_wijklY_kl[n-1]

U_ij[n]＝F_ij[n](1+βL_ij[n])

I_ij[n]＝N-n

式中：U_ij[n]為內(nèi)部活動(dòng)項(xiàng)，Y_ij[n]為PCNN脈沖輸出，I_ij[n]為索引值；

當(dāng)n＝1時(shí)，L_ij[1]＝0，則U_ij[1]＝F_ij[1]＝Sij，θ_ij[1]＝LT(N-1)＝S_{ij_max}，對(duì)應(yīng)的反饋輸入中值為S_{ij_max}的神經(jīng)元將自然點(diǎn)火；神經(jīng)元點(diǎn)火后，輸出Y_ij[1]＝1，θ_ij[2]變?yōu)閂_θ，點(diǎn)火神經(jīng)元的索引值標(biāo)記為I_ij＝N-1。

原始圖像采集方法包括：

固定好圖像采集設(shè)備；

獲取天然藥物圖像掃描的投影數(shù)據(jù)；

根據(jù)所述投影數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代處理，以獲取目標(biāo)圖像；

對(duì)所述目標(biāo)圖像進(jìn)行非負(fù)處理，獲取所述目標(biāo)圖像的非負(fù)圖像；

對(duì)所述非負(fù)圖像進(jìn)行非線性分解，獲取第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像；

對(duì)所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像進(jìn)行稀疏化處理，獲取滿足目標(biāo)函數(shù)的最優(yōu)化稀疏解；

根據(jù)所述最優(yōu)化稀疏解獲取重建圖像。

所述根據(jù)所述投影數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代處理以獲取目標(biāo)圖像的步驟包括：

基于天然藥物圖像的成像模型，獲得依據(jù)所述投影數(shù)據(jù)計(jì)算目標(biāo)圖像的迭代模型，所述迭代模型的公式表示為：

其中，X為所述目標(biāo)圖像，M為系統(tǒng)矩陣，G為所述投影數(shù)據(jù)，i表示迭代次數(shù)，Xi表示第i次迭代后得到的迭代結(jié)果；λ表示收斂系數(shù)，且λ∈(0,1)，MT表示對(duì)矩陣M的轉(zhuǎn)置；

設(shè)置所述目標(biāo)圖像的初始值，并根據(jù)預(yù)先設(shè)置的迭代次數(shù)利用所述迭代模型對(duì)所述目標(biāo)圖像中的每個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行迭代更新，獲取所述目標(biāo)圖像，所述迭代模型中的像素點(diǎn)的當(dāng)前灰度值與前次迭代的灰度值一致逼近；

對(duì)所述目標(biāo)圖像進(jìn)行非負(fù)處理的步驟包括：將所述目標(biāo)圖像中灰度值小于0的像素點(diǎn)置零；

獲取掃描的投影數(shù)據(jù)的步驟之前，原始圖像采集方法還包括：獲取掃描的投影圖像序列集，對(duì)所述投影圖像序列集進(jìn)行預(yù)處理獲取所述投影數(shù)據(jù)；

對(duì)所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像進(jìn)行稀疏化處理的步驟包括：

從所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像中提取可以部分重疊的多個(gè)圖像塊；獲取所述多個(gè)圖像塊對(duì)應(yīng)的稀疏系數(shù)；對(duì)所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像進(jìn)行最優(yōu)化求解，得到滿足所述目標(biāo)函數(shù)的最優(yōu)化稀疏解。

進(jìn)一步，原始圖像采集系統(tǒng)包括：

圖像采集設(shè)備、數(shù)據(jù)采集模塊、處理器模塊；處理器模塊包括目標(biāo)圖像獲 取模塊、非負(fù)圖像獲取模塊、分解模塊、稀疏化處理模塊和重建模塊；所述圖像采集設(shè)備用于掃描投影天然藥物，并將獲取的天然藥物的投影數(shù)據(jù)傳輸?shù)綌?shù)據(jù)采集模塊，數(shù)據(jù)采集模塊將接受的投影數(shù)據(jù)傳輸?shù)侥繕?biāo)圖像獲取模塊，所述目標(biāo)圖像獲取模塊、非負(fù)圖像獲取模塊、分解模塊、稀疏化處理模塊、重建模塊依次連接；

所述目標(biāo)圖像獲取模塊，用于接收數(shù)據(jù)采集模塊傳輸?shù)耐队皵?shù)據(jù)并進(jìn)行迭代處理，以獲取目標(biāo)圖像；

所述非負(fù)圖像獲取模塊，用于對(duì)所述目標(biāo)圖像進(jìn)行非負(fù)處理，獲取所述目標(biāo)圖像的非負(fù)圖像；

所述分解模塊，用于對(duì)所述非負(fù)圖像進(jìn)行非線性分解，獲取第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像；

所述稀疏化處理模塊，用于對(duì)第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像進(jìn)行稀疏化處理，獲取滿足預(yù)定條件的最優(yōu)化稀疏解；

所述重建模塊，用于對(duì)獲取的滿足預(yù)定條件的最優(yōu)化稀疏解進(jìn)行重建；

所述目標(biāo)圖像獲取模塊還用于基于天然藥物圖像的成像模型，獲得依據(jù)所

述投影數(shù)據(jù)計(jì)算目標(biāo)圖像的迭代模型，所述迭代模型的公式表示為：

其中，X為所述目標(biāo)圖像，M為系統(tǒng)矩陣，G為所述投影數(shù)據(jù)，i表示迭代次數(shù)，Xi表示第i次迭代后得的迭代結(jié)果；λ表示收斂系數(shù)，且λ∈(0,1)，MT表示對(duì)矩陣M的轉(zhuǎn)置；設(shè)置所述目標(biāo)圖像的初始值，并根據(jù)預(yù)先設(shè)置的迭代次數(shù)利用所述迭代模型對(duì)所述目標(biāo)圖像中的每個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行迭代更新，獲取最終的目標(biāo)圖像，所述迭代模型中的像素點(diǎn)的當(dāng)前灰度值與前次迭代的灰度值一致逼近；

所述稀疏化處理模塊包括：圖像塊提取模塊、稀疏系數(shù)獲取模塊、最優(yōu)化求解模塊；

圖像塊提取模塊，用于從所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像中提取部分重疊的多個(gè)圖像塊；

稀疏系數(shù)獲取模塊，用于獲取所述多個(gè)圖像塊對(duì)應(yīng)的稀疏系數(shù)；

最優(yōu)化求解模塊，用于對(duì)對(duì)所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像進(jìn)行最優(yōu)化求解，得到滿足所述目標(biāo)函數(shù)的最優(yōu)化稀疏解，

所述目標(biāo)函數(shù)為：

其中，R_i∈R^M×N，Δ表示所述第一非負(fù)圖像或所述第二非負(fù)圖像，R_iΔ表示從Δ中提取的圖像塊，||||₂表示2-范數(shù)，||||₁表示1-范數(shù)，γ為正則化參數(shù)，D表示過(guò)完備字典，α_i為第i個(gè)圖像塊R_iΔ對(duì)應(yīng)的稀疏系數(shù)，Γ為所有圖像塊的稀疏系數(shù)集合；

所述非負(fù)圖像獲取模塊還用于將所述目標(biāo)圖像中灰度值小于0的像素點(diǎn)置零；

所述原始圖像采集系統(tǒng)還包括預(yù)處理模塊，所述預(yù)處理模塊用于對(duì)圖像采集設(shè)備掃描獲取的投影圖像序列集進(jìn)行預(yù)處理以獲取所述投影數(shù)據(jù)。

進(jìn)一步，該天然藥物活性成分的智能篩選方式包括以下步驟：

步驟一、將天然藥物于45-60℃干燥12-17小時(shí)后，粉碎成40-300目的粉末，冷藏保存，備用；

步驟二、超臨界CO₂萃?。?/p>

將步驟一中所得粉末裝入萃取釜中，萃取溫度25～35℃，萃取壓力20～60MPa，CO₂流速10mL/min；

萃取物在分離釜中進(jìn)行兩級(jí)減壓分離，一級(jí)分離釜的壓力為10～18MPa，溫度為25～35℃；二級(jí)分離釜壓力為5～8MPa，溫度為25～50℃，收集產(chǎn)物，備用；

步驟三、超聲波強(qiáng)化浸提：將步驟二所得產(chǎn)物按重量比加入3～10倍的 提取溶劑，超聲波強(qiáng)化浸提溫度為20～50℃，超聲功率為120～250w，超聲時(shí)間為30～60min；浸提液在-5～0℃、以5000r/min速度離心10～20min；然后沉淀部分加入3～5倍重量比的同種溶劑，重復(fù)上述步驟；合并所得上清液，備用；

步驟四、濃縮上清液：將步驟三所得上清液在50～60℃，0.01MPa下減壓蒸發(fā)并真空干燥得膏狀物，備用；

步驟五、制得活性成分：將步驟四所得膏狀物用蒸餾水進(jìn)行溶解，再用酸調(diào)節(jié)pH值1～7后，上大孔吸附樹脂，依次以0.3-1.0ml/min的流速用水、乙酸銨和甲醇混合的水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫液，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，減壓回收有機(jī)溶劑，最后得到活性成分。

本發(fā)明將ATP與中藥提取物在一定條件下混合，以LC-MS方法為手段，分別測(cè)定反應(yīng)前后，ATP的變化量及生成ADP的量，用以評(píng)價(jià)中藥提取物的己糖激酶抑制活性。在LC-MS法的實(shí)施過(guò)程中，在流動(dòng)相中加入5mM醋酸銨，極大地提高了ATP的質(zhì)譜信號(hào)及對(duì)ATP定量的穩(wěn)定性。篩選結(jié)果顯示，本發(fā)明的LC-MS法輔助的具己糖激酶抑制作用的活性提取物的篩選方法操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、靈敏度高且篩選快速。

本方法無(wú)需進(jìn)行大批量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，相比細(xì)胞試驗(yàn)，本發(fā)明提取物用量少，生化試劑節(jié)省且篩選周期短，對(duì)于中藥材中活性組分的篩選和研究有重要意義?？焖俸?jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)有效，適合中藥材中具己糖激酶活性抑制作用的活性組分的篩選。本發(fā)明方法可用于各種復(fù)雜基質(zhì)中ATP的檢測(cè)；

本發(fā)明提供的圖像采集系統(tǒng)和圖像采集方法，通過(guò)對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行非負(fù)處理，獲取目標(biāo)圖像的非負(fù)圖像，然后對(duì)非負(fù)圖像進(jìn)行非線性分解，獲取第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像，最后對(duì)第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像進(jìn)行稀疏化處理，獲取最優(yōu)化稀疏解，根據(jù)該最優(yōu)化稀疏解實(shí)現(xiàn)CT圖像重建，降低了運(yùn)算過(guò)程中的圖像矩陣的維數(shù)，提高了圖像成像的準(zhǔn)確效率。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的天然藥物活性成分的篩選方法流程圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

如圖1所示:

一種天然藥物活性成分的篩選方法，通過(guò)提取天然藥物的顯微圖像的特征，以ATP為底物的己糖激酶催化反應(yīng)，通過(guò)對(duì)ATP以及產(chǎn)物ADP的定量分析，篩選出中藥材中具己糖激酶抑制作用的活性組分，該天然藥物活性成分的篩選方法包括以下步驟：

S101、采集天然藥物原始圖像，對(duì)原始圖像進(jìn)行預(yù)處理，分割出目標(biāo)區(qū)域的輪廓，進(jìn)行圖像去噪；

S102、將神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)PCNN與圖像對(duì)應(yīng)，將中心神經(jīng)元與圖像的像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)，中心神經(jīng)元的鄰域與鄰域像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)，神經(jīng)元的輸入為像素點(diǎn)的灰度值；

S103、基于Gabor函數(shù)計(jì)算所述像素點(diǎn)的K×K鄰域內(nèi)各個(gè)像素點(diǎn)的M的方向相似性；其中，K為所確定的W的矩陣的行數(shù)或列數(shù)；如果所述方向相似性在指定范圍內(nèi)，對(duì)所述K×K鄰域內(nèi)的像素點(diǎn)進(jìn)行一次點(diǎn)火，得到所述K×K鄰域內(nèi)的像素點(diǎn)的圖像分析數(shù)據(jù)，根據(jù)分析數(shù)據(jù)優(yōu)選出用于活性提取的天然藥物；

S104、建立高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法，在流動(dòng)相中添加5mM的醋酸銨，對(duì)ATP以及產(chǎn)物ADP檢測(cè)及定量分析；

S105、利用PCNN模型處理天然藥物顯微圖像，提取各顯微圖像的一維時(shí)間序列信號(hào)特征并存儲(chǔ)特征信息，作為PCNN處理的另一圖像特征，并結(jié)合天然藥物顯微圖像體視學(xué)要求的圖像目標(biāo)特征，提取天然藥物顯微圖像空域特征；

S106、基于高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用方法對(duì)ATP進(jìn)行定量分析，測(cè)定以ATP作 為底物的己糖激酶活性；

S107、對(duì)篩選得到的具己糖激酶抑制劑活性的中藥提取物進(jìn)行測(cè)定及計(jì)算。

進(jìn)一步，利用下列公式運(yùn)行PCNN模型模型：

F_ij[n]＝S_ij

L_ij[n]＝VLΣ_wijklY_kl[n-1]

U_ij[n]＝F_ij[n](1+βL_ij[n])

I_ij[n]＝N-n

式中：U_ij[n]為內(nèi)部活動(dòng)項(xiàng)，Y_ij[n]為PCNN脈沖輸出，I_ij[n]為索引值；

當(dāng)n＝1時(shí)，L_ij[1]＝0，則U_ij[1]＝F_ij[1]＝Sij，θ_ij[1]＝LT(N-1)＝S_{ij_max}，對(duì)應(yīng)的反饋輸入中值為S_{ij_max}的神經(jīng)元將自然點(diǎn)火；神經(jīng)元點(diǎn)火后，輸出Y_ij[1]＝1，θ_ij[2]變?yōu)閂_θ，點(diǎn)火神經(jīng)元的索引值標(biāo)記為I_ij＝N-1。

所述S104中對(duì)極性分子ATP的最低定量限為5μg/mL。

所述S104中，流動(dòng)相添加5mM的醋酸銨，以質(zhì)譜為檢測(cè)器，毛細(xì)管電壓設(shè)置為3000V，監(jiān)測(cè)離子分別是ATP：m/z 508，ADP：m/z 428。

所述S104中，對(duì)ATP以及產(chǎn)物ADP檢測(cè)及定量分析：

色譜柱：Agilent Extend C-18(3.1×100mm，3μm；Agilent，Palo Alto，CA，USA)；

流動(dòng)相：5mM乙酸銨(pH7.5)∶甲醇＝6∶4；流速：0.3mL/min；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μL；離子源：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用接口：電噴霧接口(ESI)，正離子模式(positive ion)；干燥氣流速：10mL/min；干燥氣溫度：300℃；霧化氣壓力：30psi(上限60psi)；毛細(xì)管電壓：3000V；質(zhì)量分析器：檢測(cè)方式：選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)；檢測(cè)區(qū)間：0-1.6min；碎片電壓：100V；監(jiān)測(cè)離子：ATP，準(zhǔn)分子離子峰(m/z 508)；ADP，準(zhǔn)分子離子峰(m/z428)。

中藥提取物為中藥材木鱉子的四種提取物MBZA，MBZB，MBZC和MBZD。

所述S106中，對(duì)篩選得到的具己糖激酶抑制劑活性的中藥提取物MBZA進(jìn)行測(cè)定及計(jì)算。

原始圖像采集方法包括：

固定好圖像采集設(shè)備；

獲取天然藥物圖像掃描的投影數(shù)據(jù)；

根據(jù)所述投影數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代處理，以獲取目標(biāo)圖像；

對(duì)所述目標(biāo)圖像進(jìn)行非負(fù)處理，獲取所述目標(biāo)圖像的非負(fù)圖像；

對(duì)所述非負(fù)圖像進(jìn)行非線性分解，獲取第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像；

對(duì)所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像進(jìn)行稀疏化處理，獲取滿足目標(biāo)函數(shù)的最優(yōu)化稀疏解；

根據(jù)所述最優(yōu)化稀疏解獲取重建圖像。

所述根據(jù)所述投影數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代處理以獲取目標(biāo)圖像的步驟包括：

基于天然藥物圖像的成像模型，獲得依據(jù)所述投影數(shù)據(jù)計(jì)算目標(biāo)圖像的迭代模型，所述迭代模型的公式表示為：

其中，X為所述目標(biāo)圖像，M為系統(tǒng)矩陣，G為所述投影數(shù)據(jù)，i表示迭代次數(shù)，Xi表示第i次迭代后得到的迭代結(jié)果；λ表示收斂系數(shù)，且λ∈(0,1)，MT表示對(duì)矩陣M的轉(zhuǎn)置；

設(shè)置所述目標(biāo)圖像的初始值，并根據(jù)預(yù)先設(shè)置的迭代次數(shù)利用所述迭代模型對(duì)所述目標(biāo)圖像中的每個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行迭代更新，獲取所述目標(biāo)圖像，所述迭代模型中的像素點(diǎn)的當(dāng)前灰度值與前次迭代的灰度值一致逼近；

對(duì)所述目標(biāo)圖像進(jìn)行非負(fù)處理的步驟包括：將所述目標(biāo)圖像中灰度值小于0的像素點(diǎn)置零；

獲取掃描的投影數(shù)據(jù)的步驟之前，原始圖像采集方法還包括：獲取掃描的投影圖像序列集，對(duì)所述投影圖像序列集進(jìn)行預(yù)處理獲取所述投影數(shù)據(jù)；

對(duì)所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像進(jìn)行稀疏化處理的步驟包括：

從所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像中提取可以部分重疊的多個(gè)圖像塊；獲取所述多個(gè)圖像塊對(duì)應(yīng)的稀疏系數(shù)；對(duì)所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像進(jìn)行最優(yōu)化求解，得到滿足所述目標(biāo)函數(shù)的最優(yōu)化稀疏解。

進(jìn)一步，原始圖像采集系統(tǒng)包括：

圖像采集設(shè)備、數(shù)據(jù)采集模塊、處理器模塊；處理器模塊包括目標(biāo)圖像獲取模塊、非負(fù)圖像獲取模塊、分解模塊、稀疏化處理模塊和重建模塊；所述圖像采集設(shè)備用于掃描投影天然藥物，并將獲取的天然藥物的投影數(shù)據(jù)傳輸?shù)綌?shù)據(jù)采集模塊，數(shù)據(jù)采集模塊將接受的投影數(shù)據(jù)傳輸?shù)侥繕?biāo)圖像獲取模塊，所述目標(biāo)圖像獲取模塊、非負(fù)圖像獲取模塊、分解模塊、稀疏化處理模塊、重建模塊依次連接；

所述目標(biāo)圖像獲取模塊，用于接收數(shù)據(jù)采集模塊傳輸?shù)耐队皵?shù)據(jù)并進(jìn)行迭代處理，以獲取目標(biāo)圖像；

所述非負(fù)圖像獲取模塊，用于對(duì)所述目標(biāo)圖像進(jìn)行非負(fù)處理，獲取所述目標(biāo)圖像的非負(fù)圖像；

所述分解模塊，用于對(duì)所述非負(fù)圖像進(jìn)行非線性分解，獲取第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像；

所述稀疏化處理模塊，用于對(duì)第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像進(jìn)行稀疏化處理，獲取滿足預(yù)定條件的最優(yōu)化稀疏解；

所述重建模塊，用于對(duì)獲取的滿足預(yù)定條件的最優(yōu)化稀疏解進(jìn)行重建；

所述目標(biāo)圖像獲取模塊還用于基于天然藥物圖像的成像模型，獲得依據(jù)所

述投影數(shù)據(jù)計(jì)算目標(biāo)圖像的迭代模型，所述迭代模型的公式表示為：

其中，X為所述目標(biāo)圖像，M為系統(tǒng)矩陣，G為所述投影數(shù)據(jù)，i表示迭代次數(shù)，Xi表示第i次迭代后得的迭代結(jié)果；λ表示收斂系數(shù)，且λ∈(0,1)，MT表示對(duì)矩陣M的轉(zhuǎn)置；設(shè)置所述目標(biāo)圖像的初始值，并根據(jù)預(yù)先設(shè)置的迭代次數(shù)利用所述迭代模型對(duì)所述目標(biāo)圖像中的每個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行迭代更新，獲取最終的目標(biāo)圖像，所述迭代模型中的像素點(diǎn)的當(dāng)前灰度值與前次迭代的灰度值一致逼近；

所述稀疏化處理模塊包括：圖像塊提取模塊、稀疏系數(shù)獲取模塊、最優(yōu)化求解模塊；

圖像塊提取模塊，用于從所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像中提取部分重疊的多個(gè)圖像塊；

稀疏系數(shù)獲取模塊，用于獲取所述多個(gè)圖像塊對(duì)應(yīng)的稀疏系數(shù)；

最優(yōu)化求解模塊，用于對(duì)對(duì)所述第一非負(fù)圖像和所述第二非負(fù)圖像進(jìn)行最優(yōu)化求解，得到滿足所述目標(biāo)函數(shù)的最優(yōu)化稀疏解，

所述目標(biāo)函數(shù)為：

其中，R_i∈R^M×N，Δ表示所述第一非負(fù)圖像或所述第二非負(fù)圖像，R_iΔ表示從Δ中提取的圖像塊，||||₂表示2-范數(shù)，||||₁表示1-范數(shù)，γ為正則化參數(shù)，D表示過(guò)完備字典，α_i為第i個(gè)圖像塊R_iΔ對(duì)應(yīng)的稀疏系數(shù)，Γ為所有圖像塊的稀疏系數(shù)集合；

所述非負(fù)圖像獲取模塊還用于將所述目標(biāo)圖像中灰度值小于0的像素點(diǎn)置零；

所述原始圖像采集系統(tǒng)還包括預(yù)處理模塊，所述預(yù)處理模塊用于對(duì)圖像采集設(shè)備掃描獲取的投影圖像序列集進(jìn)行預(yù)處理以獲取所述投影數(shù)據(jù)。

在開始掃描前，根據(jù)被掃描藥品的性質(zhì)來(lái)設(shè)定掃描參數(shù)，被掃描物體的性質(zhì)可以是密度、組成成分等物理性質(zhì)，掃描參數(shù)包括圖像采集設(shè)備的數(shù)據(jù)采集 方式、電壓以及功率等，并且所有的掃描參數(shù)在后續(xù)的數(shù)據(jù)采集過(guò)程中保持不變。

分別采集暗場(chǎng)圖像及亮場(chǎng)圖像，并通過(guò)求和平均得到平均暗場(chǎng)圖像和平均亮場(chǎng)圖像。成像視場(chǎng)中不放置被掃描藥品，不打開光源獲取若干幅暗場(chǎng)圖像，例如可采集5～10幅暗場(chǎng)圖像，對(duì)暗場(chǎng)圖像按照對(duì)應(yīng)像素灰度值疊加求和并取平均得到平均暗場(chǎng)圖像。打開光源采集若干幅亮場(chǎng)圖像，并對(duì)亮場(chǎng)圖像按照像素灰度疊加求和并取平均得到平均亮場(chǎng)圖像，通過(guò)暗場(chǎng)圖像及亮場(chǎng)圖像有效地降低了采集圖像中噪聲的影響。

測(cè)量處于成像視場(chǎng)中的被掃描藥品旋轉(zhuǎn)中心到圖像采集設(shè)備的距離，對(duì)被掃描藥品進(jìn)行等角度間隔圓周掃描，得到投影圖像序列集。對(duì)被掃描藥品進(jìn)行等角度間隔掃描的步驟為：將轉(zhuǎn)臺(tái)連續(xù)等角度間隔地轉(zhuǎn)動(dòng)一周，并在每一次轉(zhuǎn)動(dòng)后對(duì)被掃描藥品進(jìn)行掃描。例如，等角度間隔掃描的過(guò)程可以是：將被掃描物體置于轉(zhuǎn)臺(tái)上，連續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)360次，每次轉(zhuǎn)動(dòng)1度，每轉(zhuǎn)動(dòng)一次就進(jìn)行一次拍攝，直至轉(zhuǎn)臺(tái)旋轉(zhuǎn)一周，得到投影圖像序列集。

目標(biāo)圖像是指初始的待重建圖像，利用預(yù)先設(shè)定的迭代模型獲取的預(yù)處理后的掃描投影數(shù)據(jù)進(jìn)行迭代處理，獲取用于重建的目標(biāo)圖像。

天然藥物圖像的成像模型可以采用以下公式表示：G＝MX，其中，G為投影數(shù)據(jù)，M為系統(tǒng)矩陣，X為目標(biāo)圖像。

設(shè)置目標(biāo)圖像的初始值，并根據(jù)預(yù)先設(shè)置的迭代次數(shù)利用迭代模型對(duì)目標(biāo)圖像中的每個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行迭代更新，獲取最終的目標(biāo)圖像。

對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行非負(fù)處理，獲取目標(biāo)圖像的非負(fù)圖像。

非負(fù)處理是指去除目標(biāo)圖像中灰度值小于零的像素點(diǎn)，這樣可以降低目標(biāo)圖像矩陣的維度，提高重建的效率。

對(duì)非負(fù)圖像進(jìn)行非線性分解，獲取第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像。

第一非負(fù)圖像是指代表非負(fù)圖像矩陣中基向量的部分，第二非負(fù)圖像表示非負(fù)圖像矩陣的權(quán)重系數(shù)。依據(jù)預(yù)先設(shè)定的分解模型對(duì)非負(fù)圖像進(jìn)行分解可以 將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，從而提高圖像重建的速度。非線性分解的模型可以采用奇異值分解算法、三角分解法、QR分解法和非負(fù)矩陣分解法等等。

將獲取的非負(fù)圖像X+采用非負(fù)矩陣分解算法進(jìn)行分解：X+＝W*H，其中，W表示第一非負(fù)圖像，即X+中的一列向量可以解釋為對(duì)左矩陣W中所有列向量的加權(quán)和，H表示第二非負(fù)圖像，即右矩陣H中對(duì)應(yīng)列向量中的元素為權(quán)重系數(shù)。

對(duì)第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像進(jìn)行稀疏化處理，獲取滿足目標(biāo)函數(shù)的最優(yōu)化稀疏解。

根據(jù)最優(yōu)化稀疏解獲取重建圖像。

根據(jù)獲得最優(yōu)化稀疏解稀疏解后，便可以根據(jù)上述步驟的分解模型，獲得最終的重建圖像可以為以下三種情形：

(1)、第一非負(fù)圖像W的最優(yōu)化稀疏解WDL和原第二非負(fù)圖像的乘積，即X＝W DL*H；

(2)、原第一非負(fù)圖像W和第二非負(fù)圖像的最優(yōu)化稀疏解HDL的乘積，即X＝W*H DL；

(3)、第一非負(fù)圖像W的最優(yōu)化稀疏解WDL和第二非負(fù)圖像的最優(yōu)化稀疏解HDL的乘積，即X＝WDL*HDL。

通過(guò)對(duì)目標(biāo)圖像進(jìn)行非負(fù)處理，獲取目標(biāo)圖像的非負(fù)圖像，然后對(duì)非負(fù)圖像進(jìn)行分解，獲取第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像，最后對(duì)第一非負(fù)圖像和第二非負(fù)圖像進(jìn)行稀疏化處理，獲取最優(yōu)化稀疏解，根據(jù)該最優(yōu)化稀疏解實(shí)現(xiàn)圖像重建，降低了運(yùn)算過(guò)程中的圖像矩陣的維數(shù)，提高了圖像重建的效率。

本發(fā)明另一目的在于提供一種天然藥物活性成分的智能篩選方式，該天然藥物活性成分的智能篩選方式包括以下步驟：

a.將天然藥物于45-60℃干燥12-17小時(shí)后，粉碎成40-300目的粉末，冷藏保存，備用；

b.超臨界CO₂萃?。?/p>

將步驟a中所得粉末裝入萃取釜中，萃取溫度25～35℃，萃取壓力20～60MPa，CO₂流速10mL/min；

萃取物在分離釜中進(jìn)行兩級(jí)減壓分離，一級(jí)分離釜的壓力為10～18MPa，溫度為25～35℃；二級(jí)分離釜壓力為5～8MPa，溫度為25～50℃，收集產(chǎn)物，備用；

c.超聲波強(qiáng)化浸提：將步驟b所得產(chǎn)物按重量比加入3～10倍的提取溶劑，超聲波強(qiáng)化浸提溫度為20～50℃，超聲功率為120～250w，超聲時(shí)間為30～60min；浸提液在-5～0℃、以5000r/min速度離心10～20min；

然后沉淀部分加入3～5倍重量比的同種溶劑，重復(fù)上述步驟；合并所得上清液，備用；

d.濃縮上清液：將步驟c所得上清液在50～60℃，0.01MPa下減壓蒸發(fā)并真空干燥得膏狀物，備用；

e.制得活性成分：將步驟d所得膏狀物用蒸餾水進(jìn)行溶解，再用酸調(diào)節(jié)pH值1～7后，上大孔吸附樹脂，依次以0.3-1.0ml/min的流速用水、乙酸銨和甲醇混合的水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓回收洗脫液，再用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，減壓回收有機(jī)溶劑，最后得到活性成分。

進(jìn)一步，所述步驟a中冷藏溫度為0-20℃。

進(jìn)一步，所述步驟e中所述蒸餾水與膏狀物的重量比W浸膏：W蒸餾水＝1：10-25；步驟e中大孔吸附樹脂為D101大孔吸附樹脂或AB-8大孔吸附樹脂。

本發(fā)明利用超臨界CO₂萃取技術(shù)和超聲波提取既可以使附加值高的脂溶性活性揮發(fā)油成分得到回收利用，又有助于產(chǎn)品的后期純化，首次運(yùn)用大孔吸附樹脂富集、溶劑萃取相結(jié)合的方法獲得產(chǎn)品含量高的提取物，建立了一套較為科學(xué)合理的提取分離工藝流程，該技術(shù)減少了常規(guī)提取過(guò)程中因沉淀造成的損失，提高有回收率，減少了常規(guī)提取液在后期過(guò)濾中的困難；該技術(shù)具有工藝簡(jiǎn)單、成本低、易操作、適于工業(yè)化生產(chǎn)，所得活性成分可用于保健品或藥品 等諸多場(chǎng)合。

本發(fā)明選擇中藥材木鱉子為篩選對(duì)象，以LC-MS為手段，測(cè)定ATP作為底物的己糖激酶活性，對(duì)木鱉子四種提取物(MBZA，MBZB，MBZC和MBZD)進(jìn)行己糖激酶抑制劑活性的篩選；所述的中藥材木鱉子已運(yùn)用在抗腫瘤復(fù)方中，藥理證實(shí)其具有散結(jié)消腫，攻毒療瘡的作用。

本發(fā)明基于在糖酵解過(guò)程中，己糖激酶催化ATP轉(zhuǎn)化為ADP的反應(yīng)，將ATP與中藥提取物在一定條件下混合，以LC-MS方法為手段，分別測(cè)定反應(yīng)前后(加入或不加入中藥提取物)，ATP的變化量及生成ADP的量，用以評(píng)價(jià)中藥提取物的己糖激酶抑制活性。在LC-MS法的實(shí)施過(guò)程中，在流動(dòng)相中加入5mM醋酸銨，極大地提高了ATP的質(zhì)譜信號(hào)及對(duì)ATP定量的穩(wěn)定性。

篩選結(jié)果顯示，本發(fā)明的LC-MS法輔助的具己糖激酶抑制作用的活性提取物的篩選方法操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、靈敏度高且篩選快速。

本方法無(wú)需進(jìn)行大批量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，相比細(xì)胞試驗(yàn)，本發(fā)明提取物用量少，生化試劑節(jié)省且篩選周期短，對(duì)于中藥材中活性組分的篩選和研究有重要意義。本發(fā)明中經(jīng)優(yōu)化的LC-MS中各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)于利用質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定其它類似性質(zhì)的生物分子具有很好的參考價(jià)值。

本發(fā)明方法快速簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)有效，適合中藥材中具己糖激酶活性抑制作用的活性組分的篩選。本發(fā)明方法可用于各種復(fù)雜基質(zhì)中ATP的檢測(cè)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1：木鱉子提取物中己糖激酶抑制活性組分的篩選

1.LC-MS法測(cè)定ATP和ADP

色譜柱：Agilent Extend C-18(3.1×100mm，3μm；Agilent，Palo Alto，CA，USA)；流動(dòng)相：5mM乙酸銨(pH7.5)∶甲醇＝6∶4；流速：0.3mL/min；柱溫：20℃；進(jìn)樣量：10μL離子源：液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用接口：電噴霧接口(ESI)，正離子模式(positiveion)；干燥氣流速：10mL/min；干燥氣溫度：300℃；霧化氣壓力：30psi(上限60psi)；毛細(xì)管電壓：3000V；質(zhì)量分析器：檢測(cè)方式： 選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)；檢測(cè)區(qū)間：0-1.6min；碎片電壓：100V；監(jiān)測(cè)離子：ATP，準(zhǔn)分子離子峰(m/z 508)；ADP，準(zhǔn)分子離子峰(m/z428)

專屬性：ATP保留時(shí)間為1.39分鐘，ADP保留時(shí)間為1.40分鐘，與空白色譜圖對(duì)比可知，出峰位置無(wú)明顯雜質(zhì)干擾。結(jié)果顯示，用本方法定量ATP，專屬性良好。

線性范圍在5-60μg/mL范圍內(nèi)，以ATP峰面積Y對(duì)ATP的理論濃度X，以1/x為權(quán)重系數(shù)作加權(quán)線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝3022.6X+1902.9(r＝0.998)。

靈敏度本方法對(duì)ATP的最低定量限(LLOQ)為5μg/mL(S/N≥10)，最低檢測(cè)限(LLOD)為1μg/mL(LLOD)。LLOQ的天內(nèi)及天間精密度分別為3.95％和11.36％，準(zhǔn)確度分別為105.37％和101.09％。

精密度和準(zhǔn)確度配制ATP低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品(12，35，55μg/mL)各5份，進(jìn)樣分析，并以當(dāng)天標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算天內(nèi)精密度及準(zhǔn)確度。依法連續(xù)測(cè)定3天，計(jì)算天間精密度及準(zhǔn)確度。本方法低、中、高濃度質(zhì)控樣品，天內(nèi)及天間精密度均小于10％，準(zhǔn)確度在100±5％之內(nèi)。

2.己糖激酶活性的測(cè)定(米氏常數(shù)Km的測(cè)定)

ATP系列溶液的配制用底物緩沖液(精密稱取HEPES 300.0mg，氯化鎂60.0mg，無(wú)水葡萄糖50.0mg，50ml去離子水充分溶解，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.5，得25mM HEPES緩沖液。該緩沖溶液每日新鮮配制)將ATP儲(chǔ)備液分別稀釋至5，10，15，20，25，30，35μg/mL系列溶液，供酶促反應(yīng)使用。

己糖激酶酶促反應(yīng)于1.5mL離心管中分別加入100μL己糖激酶緩沖液(精密稱取HEPES 300.0mg，氯化鎂60.0mg，50ml去離子水充分溶解，并加入5％(m/v)甘油，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.5，得25mM HEPES緩沖液)及100μLATP系列溶液，渦旋10s后進(jìn)樣。另于不同離心管中分別加入100μL底物緩沖液及100μLATP系列溶液，作為空白對(duì)照組。

己糖激酶米氏常數(shù)Km計(jì)算米氏方程為：1/V＝Km/Vm×1/[S]+1/Vm，其中1/V為反應(yīng)速度，即ATP減少量或ADP生成量(本實(shí)驗(yàn)以ATP減少量計(jì)算)，[S]為底物濃度，即ATP濃度，單位換算為。以對(duì)應(yīng)濃度空白對(duì)照組中ATP峰面積與酶促反應(yīng)組中ATP峰面積的差的倒數(shù)作為縱坐標(biāo)，ATP的濃度作為橫坐標(biāo)，則直線斜率即為己糖激酶Km。用最小二乘法計(jì)算得Km為0.36。

3.木鱉子提取物中己糖激酶抑制劑活性組分的篩選

木鱉子提取物的制備500g木鱉子去殼磨粉，在500ml石油醚中，加熱回流1小時(shí)后浸泡24小時(shí)除去油脂，重復(fù)三次。過(guò)濾后濾渣用500ml無(wú)水乙醇浸泡提取24小時(shí)，重復(fù)提取三次，合并提取液。低溫離心除去提取液中雜質(zhì)后，回旋蒸干乙醇制成流浸膏。稱取木鱉子提取物餾浸膏500mg溶于5ml 50％乙醇，充分溶解后得到淡黃色溶液，離心過(guò)濾掉少量不溶雜質(zhì)，配成100mg/mL母液，用高效液相色譜法進(jìn)行分離。分別收集流出液并命名為MBZA(4.00～7.00min)，MBZB(16.00～20.00min)，MBZC(23.00～25.50min)，MBZD(27.00～28.00min)。合并收集液，回旋蒸干后制得四種提取物干粉。

溶液配制稱取適量木鱉子提取物MBZA、MBZB、MBZC和MBZD干粉用底物緩沖液分別配成30μg/ml的溶液，離心過(guò)濾不溶成分。另配制濃度為30μg/mL ATP溶液待用。

己糖激酶抑制活性提取物篩選配制各溶液后各進(jìn)樣五次分析。進(jìn)樣后，將加入木鱉子提取物樣品進(jìn)樣五次后所得ATP峰面積的平均值與空白對(duì)照樣品及酶促反應(yīng)對(duì)照樣品(無(wú)抑制劑)的ATP峰面積比較，加入木鱉子提取物樣品的ATP峰面積明顯高于酶促反應(yīng)樣品中的ATP峰面積，說(shuō)明MBZA中含有對(duì)己糖激酶有抑制作用的活性成分。

MBZA抑制活性的測(cè)定及計(jì)算精密稱取10.0mgMBZA于10ml容量瓶中，用底物緩沖液定容至刻度，制成母液。繼續(xù)用底物緩沖液將MBZA母液稀釋至10，15，20，25，30，50，80，100μg/mL系列溶液待用。

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