肺癌和結直腸癌中的BARD1同工型、其檢測方法及其應用與流程

文檔序號：11824639閱讀：820來源：國知局

技術領域

本發(fā)明涉及對肺癌和結直腸癌具有特異性的新型BARD1同工型、其檢測方法和用于治療和/或預防肺癌和結直腸癌的方法。

背景技術：

肺癌是全世界癌癥死亡的主要原因。外科手術之外的治療方法不是非常有效并且會引起抗性。因此，迫切需要了解肺癌及其發(fā)展的病因學。結直腸癌是癌癥相關死亡的另一主要原因，是全球第四大常見癌癥。結直腸癌患者的存活和預后取決于診斷時的腫瘤階段。早期結直腸癌是可以被治愈的。不幸的是，在診斷時超過57％的患者該疾病已經區(qū)域性擴散或遠端擴散。盡管在處理癌癥中進行了巨大投資并取得了發(fā)展，但是對于晚期結直腸癌患者而言五年存活率僅為15％。

最近，許多研究組通過將腫瘤中的蛋白、RNA和微RNA與健康組織進行比較而提出了驅動肺癌的機制。除了TP53(肺癌中最常缺失或突變的基因)之外，認為p53-ARF途徑的組分也缺失、突變或在表觀遺傳學上經修飾。對于結直腸癌，挑戰(zhàn)在于理解分子基礎，和確定引起形成(development)和驅動發(fā)展的因素。涉及結直腸癌發(fā)生和轉移性發(fā)展的分子事件僅被部分地分類。最近的研究已經揭示了結直腸癌中的分子和生化標志物在預測化療的后果和對化療的反應上的潛在應用，如MLH1、MSH2、β-連環(huán)蛋白和p53。

分子譜圖作為非小細胞肺癌(NSCLC)的預測和預后參數而出現(xiàn)，包括DNA損傷修復中涉及的基因，例如ERCC1、RRM1和BRCA1。提出了將乳癌易感基因BRCA1的上調表達作為對NSCLC治療的反應的預后和預測標志物。關于結直腸癌，BRCA1的研究主要受限于結直腸癌風險和BRCA1突變。數種研究試圖將BRCA1突變與結直腸癌風險關聯(lián)起來，但沒有任何明確的結論。基于當前有限的可利用證據，應當認為BRCA突變攜帶者具有較高額度結直腸癌風險。但是結直腸癌中BRCA1表達的具體作用是不清楚的。

BRCA1在許多增生組織中表達并且在DNA修復途徑和細胞周期控制中充當腫瘤抑制劑。BRCA1蛋白穩(wěn)定性和功能取決于其與BARD1(BRCA1相關的RING結構域蛋白1)的相互作用。BRCA1-BARD1異二聚體具有E3泛素連接酶活性，由此通過泛素化控制關鍵靶蛋白的穩(wěn)定性。BARD1還參與p53-依賴性凋亡，在大多數肺癌中p53-依賴性凋亡是有缺陷的。BARD1穩(wěn)定p53和促進其磷酸化，p53在導致凋亡的信號傳導中發(fā)揮正確功能需要BARD1的表達。因此，BARD1在腫瘤抑制中起雙重作用，同時為BRCA1和p53的結合伴侶。數個研究已經顯示，BARD1在有絲分裂過程中上調，通過E2F進行轉錄和通過磷酸化進行翻譯后修飾，并且重要的是，其對于有絲分裂是重要的。根據其它研究，BRCA1和BARD1都顯示與hMSH2(通常與遺傳性非息肉病性結直腸癌(HNPCC)相關的基因)相互作用，hMSH2的突變似乎占HNPCC的約30～40％。BRCA1-hMSH2信號傳導過程的缺陷導致對腫瘤形成的易感性增加。

WO98/12327(Board of Regents，德克薩斯大學系統(tǒng))公開了在基于與乳癌蛋白BRCA1結合的篩選檢測中鑒定出的數種基因。這些基因中的一種稱為BARD1，是與BRCA1相互作用的RING蛋白，并且設想了其在各種癌癥相關診斷和治療方法中的應用，特別是與乳癌、卵巢癌和子宮癌相關的診斷和治療方法中的應用。

WO2008/119802(日內瓦大學)公開了在婦科癌癥中，帶有缺失的BARD1同工型過表達，異常地定位到細胞質，并且它們的表達與乳癌和卵巢癌的預后不良相關。這些同工型的結構分析表明，它們缺乏與BRCA1相互作用或誘導凋亡的區(qū)域。這些同工型對于婦科癌癥具有特異性，被命名為α、β、η、γ、ε、δ和θ。

由于肺癌和結直腸癌的嚴重性和不可治愈性，仍然需要開發(fā)可鑒別這些癌癥的有效檢測方法，和需要進一步開發(fā)治療或預防這些癌癥的有效方法和組合物。主要問題在于，迄今為止尚未開發(fā)出解決該問題的有效方法或策略。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種用于檢測獲自受試對象的生物樣品中對肺癌和結直腸癌具有特異性的BARD1同工型的存在的方法，所述方法包括檢測所述樣品中對肺癌和結直腸癌具有特異性的至少一種BARD1同工型的步驟，所述至少一種BARD1同工型選自包含以下同工型的組：

同工型π，同工型π包含SEQ ID NO：1、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的序列，和

同工型κ，同工型κ包含SEQ ID NO：2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：2具有至少95％同源性的序列，

其中，在獲自所述受試對象的樣品中所述對肺癌和結直腸癌具有特異性的BARD1同工型的存在是所述受試對象罹患肺癌和/或結直腸癌、患肺癌和/或結直腸癌的風險增加、以及/或者治療肺癌和/或結直腸癌后具有復發(fā)的風險的標志。

本發(fā)明還提供一種在權利要求1～6所述的方法中用作生物標志物的分離和/或純化的多肽，所述分離和/或純化的多肽包含SEQ ID NO：1、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的序列；和提供一種在權利要求1～6所述的方法中用作生物標志物的分離和/或純化的多肽，所述分離和/或純化的多肽包含SEQ ID NO：2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：2具有至少95％同源性的序列。

本發(fā)明另一目的是選自包含SEQ ID NO：13～80的組中的肽，所述肽用于本發(fā)明的檢測BARD1同工型的存在的方法。

本發(fā)明的另一目的是用于檢測獲自受試對象的樣品中對肺癌和結直腸癌具有特異性的BARD1同工型的存在的試劑盒，所述試劑盒包含：

至少一種多核苷酸引物或探針，其中所述多核苷酸引物或探針對編碼至少一種所述BARD1同工型的多核苷酸具有特異性，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段和/或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，和/或

與至少一種所述BARD1同工型的不同表位特異性結合的抗體或其片段的組合，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，和/或

至少一種選自包含SEQ ID NO：13～80的組的肽。

本發(fā)明還涉及一種將肺癌和結直腸癌與婦科癌癥相區(qū)分的方法，所述方法包括檢測獲自受試對象的生物樣品中至少一種對肺癌和結直腸癌具有特異性的BARD1同工型的步驟，所述BARD1同工型選自包含以下同工型的組：

包含SEQ ID NO：1的同工型π、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的序列，和

包含SEQ ID NO：2的同工型κ、其生物活性片段或與SEQ ID NO：2具有至少95％同源性的序列，

其中所述對肺癌和結直腸癌具有特異性的BARD1同工型的存在是肺癌和/或結直腸癌的標志。

另外，本發(fā)明涉及在治療和/或預防肺癌和結直腸癌的方法中使用的抗體、重組siRNA和本發(fā)明的BARD1同工型的生物活性調節(jié)劑。

附圖說明

圖1顯示了NSCLC中的BARD1表達。用BARD1抗體N19、C20、PVC、WFS和BRCA1對100個NSCLC病例進行免疫組織化學分析。(A)具有上述蛋白基序作為RING指(RING)、錨蛋白重復(ANK)和BRCT結構域的BARD1外顯子(1-11)的示意性表示。標明各種抗體識別的表位的大概位置(N19、PVC、WFS、C20)。(B-D)使用BARD1抗體和BRCA1抗體的免疫組織化學染色的實例。BARD1 N19和C20顯示出細胞質顆粒狀染色，并且有時共定位在相同的細胞或區(qū)域。BARD1 PVC和WFS染色是細胞質的染色或彌漫性細胞核和彌漫性細胞質的染色。BRCA1染色與BARD1 N19染色共定位(B)。示出了未被或幾乎未被PVC和WFS(C)染色的實例和被N19和C20染色(D)可忽略不計的實例。標明了比例尺(上圖＝200μm；下圖＝100μm)。(E)觀察到的用所有四種N19、PVC、WFS和C20探測的100個NSCLC病例中的73個的染色?！?”表示陽性染色，“-”表示陰性染色。具有所有四種抗體的陽性染色是頻率最高的表達模式。(F)BARD1 N19、PVC、WFS和C20染色的成對比較。BARD1 N19和C20以及PVC和WFS強相關。在N19和PVC之間、N19和WFS之間、C20和PVC之間、C20和WFS之間觀察到弱相關或不相關。

圖2顯示了在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中的BARD1表達的比較以及與臨床特征的相關性。(A)20名(10名男性和10名女性)NSCLC患者的腫瘤組織和腫瘤周圍組織中的BARD1 N19、BARD1 C20和BRCA1染色的比較。與“正?！苯M織相比，腫瘤組織中所有抗體的染色增加。(B)在10名女性和10名男性NSCLC患者的腫瘤組織中測試BARD1 N19、BARD1 C20和BRCA1染色。與男性患者相比，來自女性患者的腫瘤中所有抗體的染色增加。(C)100個NSCLC病例中BARD抗體染色和腫瘤類型的比較。陽性染色在非-腺癌(AC)(包括鱗狀細胞癌和大細胞癌)中比在腺癌中頻率更高。PVC和WFS染色增加具有統(tǒng)計學顯著性。(D-E)BARD1表達與患者存活的相關性。(D)如圖1E所定義的根據4種抗體陽性染色的組合和小于4種抗體陽性染色的組合進行的無病存活(DFS)的Kaplan-Meyer分析。(E)如圖1E所定義的根據4種抗體陽性染色的組合和小于4種抗體陽性染色的組合進行的總存活(OS)的Kaplan-Meyer分析。

圖3顯示了在誘導了肺癌的實驗小鼠模型中BARD1同工型表達的時間過程。(A)經尿烷(urethane)處理的動物的形態(tài)學正常的肺組織(正常)中的BARD1表達。在16周(wk)時BARD1 PVC和WFS表位在一些II型肺泡上皮細胞中檢測出，但未在I型肺泡上皮細胞中檢測出。在24周和32周時所有表位都在II型和I型肺泡上皮細胞中表達，并且從24周至32周表達上調。C20染色與其它相反：在16周時強染色，在24周時弱染色，在32周時幾乎是陰性的。(B)腫瘤中的BARD1表達。在腫瘤區(qū)，從16周至32周BARD1 PVC、特別是WFS表達上調，而從16周至32周C20表達下調。(C-D)在三只小鼠的正常(C)組織和腫瘤(D)組織中的BARD1表位的表達模式。標出了染色分數、陽性細胞百分比(0表示陰性染色、1～4表示具有陽性染色的細胞的強度和數量增加)。

圖4顯示了人肺腫瘤組織和腫瘤周圍組織中BARD1轉錄物的表達和結構。(A-D)用擴增整個BARD1編碼區(qū)(一個或多個)的引物進行RT-PCR，該編碼區(qū)包含外顯子1-4或1-6。擴增GAPDH作為對照RT-PCR。分子尺寸標志物(M)示于左側。推定的FL BARD1和不同剪接的同工型示于右側。(A)正常肺組織中的BARD1RNA表達。對具有良性肺疾病的個體的肺活檢組織進行的RT-PCR(參見方法部分)顯示BARD1表達在多數樣品中不存在，并且在8個病例中的5個中顯示各同工型(γ、δ、η)的擴增。(B)使用外顯子1中的正向引物、在外顯子11或外顯子4中的反向引物對FL BARD1和截短的同工型進行的擴增。對于來自男性和女性患者的組織，顯示了成對的正常腫瘤周圍(N)組織和腫瘤(T)組織的實例。推定的FL BARD1和不同剪接的同工型示于右側。正常組織和腫瘤組織表達相同模式的同工型。(C)對外顯子1～6進行擴增以區(qū)分FL BARD1、β和新型同工型κ和π。同工型π在腫瘤中特異性表達，而在正常組織中不表達或弱表達。(D)在多數病例中發(fā)現(xiàn)了通過RT-PCR確定的雌激素受體α的表達。在男性和女性的正常樣品和腫瘤樣品中發(fā)現(xiàn)類似的表達水平。(E)已知BARD1同工型和肺癌特異性新形式的同工型κ和π的結構。.指出了FL BARD1的示意性外顯子(1～11)結構與蛋白特征(RING,ANK,BRCT)和核定位信號(NLS)，以及引物的位置。下方以灰色示出同工型的示意性假定蛋白結構，以白色示出非編碼外顯子，并且以淺灰點(點)示出選擇性開放閱讀框(β、γ和η)。示出了新型同工型κ，其外顯子3缺失并且推定的翻譯起點(ATG)在外顯子4內。將新型同工型π指定為具有外顯子4內的缺失，指出了定位到該區(qū)域內的已知BARD1突變和多態(tài)性。同工型的指定名稱示于左側，大小(氨基酸)和分子量(MW)示于右側。

圖5顯示了在女性和男性NSCLC患者的形態(tài)學正常的腫瘤周圍組織(左側)中和在腫瘤組織(右側)中的BARD1、BRCA1和Aurora B表達的比較。利用BARD1(N19和C20)以及C末端特異性抗體p8、BRCA1和Aurora B抗體染色進行免疫組織化學分析。符號n＝細胞核染色。

圖6顯示了外顯子4內的選擇性剪接和/或轉錄起始。(A)用外顯子(Ex)4、外顯子5和外顯子6內的正向引物(位于左側)和外顯子11中的反向引物(位于右側)擴增的BARD1的各種片段的圖。引物的位置和擴增帶的預期大小在括號中標出(bp)。(B)示出了用A所示的引物對在男性(左圖)和女性(右圖)NSCLC患者的人肺腫瘤組織(T)和鄰近的正常腫瘤周圍組織(N)中的BARD1轉錄物進行的擴增。注意用外顯子4內的引物進行的擴增在不同樣品中是可變的，但所有樣品都可以用外顯子5或外顯子6內的引物進行擴增。BARD1 mRNA和蛋白表達的變化可能歸因于該區(qū)域中轉錄的選擇性剪接或不同起始。

圖7示出了在女性和男性患者的腫瘤組織(腫瘤)和腫瘤周圍組織(正常)中BARD1 mRNA同工型表達的比較和相關性。對20對腫瘤/形態(tài)學上正常的組織樣品(包括10名男性和10名女性)的FL BARD1和BARD1同工型進行評分并將其示出。用ImageJ軟件對表達進行定量(參見方法部分)。結果在圖中表示為值的平均值±SE(標準誤差)。(A)腫瘤周圍組織和腫瘤組織中FL BARD1和同工型的比較。除了同工型β和κ之外，所有同工型在腫瘤中上調，具有統(tǒng)計學顯著性。(B-C)在男性(B)和女性(C)中，F(xiàn)L BARD1和BARD1同工型都在腫瘤組織中比在腫瘤周圍組織中更豐富。(D/E)腫瘤組織(D)中和正常組織(E)中男性和女性之間BARD1表達的比較。在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中，BARD1同工型β和κ在來自男性的組織中比來自女性的組織中表達更多。這具有統(tǒng)計學顯著性。在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中，F(xiàn)L BARD1和BARD1同工型γ、ε和η在來自女性的組織中可能比來自男性的組織中表達更多，但這不具有統(tǒng)計學顯著性。(F)在年輕(<60歲)和老年(>60歲)患者組中FL BARD1和同工型的比較。FL BARD1和同工型γ在年輕(<60歲)患者中上調。這具有統(tǒng)計學顯著性。

圖8顯示了結直腸癌中BARD1和BRCA1表達的免疫組織化學分析的實例。通過BARD1抗體N19、C20、PVC、WFS和BRCA1對148個結直腸癌病例的樣品進行了免疫組織化學分析。將所有樣品都表示為組織微陣列，每個病例一式四份。免疫組織化學檢測后145個樣品對于分析是合格的。

(A)針對BARD1的BRCA1抗體的陽性染色病例的頻率。四個抗體中的每一個的陽性染色率是可變的。BARD1 N19和C20染色以及BRCA1染色頻率較低。在多數結直腸癌病例中觀察到BARD1 PVC和WFS陽性染色。(B)結直腸癌中的BARD1表達模式?；诿總€病例的陽性(+)染色和陰性(-)染色，用4種BARD1抗體獲得表達模式。PVC和WFS陽性染色，但N19和C20陰性染色是頻率最高的表達模式，“所有四種抗體陽性”染色其次，N19陰性但PVC、WFS和C20陽性染色是觀察到的頻率第三高的表達模式。(C-F)使用BARD1抗體和BRCA1抗體的免疫組織染色的實例。BARD1 N19和C20顯示出細胞質顆粒狀染色，并且共定位在相同的細胞和區(qū)域。BARD1 PVC和WFS染色是彌漫性細胞質的。BRCA1染色在細胞質和細胞核中都是顆粒狀。示出了以下實例：使用BARD1抗體和BRCA1抗體的陽性染色(C)、使用N-19和C20(D)的可忽略不計的染色(D)、使用所有四種BARD1抗體的陽性染色(E)和使用N19(F)的陰性染色。標明了比例尺(上圖＝200μm；下圖＝50μm)。

圖9顯示了對于結直腸癌中BARD1和BRCA1的不同抗體染色之間的相關性。(A)BARD1 N19、PVC、WFS和C20染色的相關性。BARD1 N19和C20染色強相關，PVC和WFS、PVC和C20以及WFS和C20弱相關。N19和PVC之間以及N19和WFS之間未觀察到相關。(B)BRCA1和BARD1的抗體染色的相關性。BRCA1染色不與四種BARD1抗體的任何染色相關。

圖10顯示了BARD1和BRCA1的不同表位表達與結直腸癌中的臨床變量的相關性。BARD1 N19陽性染色在女性中頻率更高(P＝0.014)(A)。在不同抗體的BARD1和BRCA1染色與腫瘤組織病理學級別(級別)(B)、腫瘤大小或附近的組織浸潤(腫瘤)(C)、淋巴結累及(結)(D)、遠端轉移(轉移)(E)和腫瘤階段(階段)(F)之間未發(fā)現(xiàn)相關性。通過χ2檢驗獲得P值。

圖11顯示了結直腸癌組織(T)和正常腫瘤周圍組織(N)中BARD1轉錄物的表達和結構。(A)使用外顯子1中的正向引物和外顯子11(Ex 1-11)或外顯子4(Ex 1-4)中的反向引物對FL BARD1和/或截短的同工型進行的擴增。作為實例，示出了5名男性患者和5名女性患者的成對的腫瘤周圍組織和腫瘤組織。對于相同的樣品示出甘油醛3-磷酸脫氫酶表達作為標準物。分子標志物示于左側(M)。推定的FL BARD1和截短的同工型示于右側。腫瘤周圍組織和腫瘤組織表達不同模式的同工型：腫瘤周圍組織比腫瘤組織中的表達頻率低。也在NSCLC中鑒定出的兩種新型同工型，κ和π，在結直腸癌中表達。(B)相同樣品中雌激素受體α(ERα)的擴增，使用MCF-7作為陽性對照(右側)。在結直腸組織中，無論在男性還是女性的腫瘤周圍樣品中還是腫瘤樣品中都未觀察到ERα表達。

圖12示出了在患有結直腸癌的男性和女性患者的腫瘤組織(腫瘤)和腫瘤周圍(正常)組織中的BARD1 mRNA同工型表達的比較。對結直腸癌的20對腫瘤組織/腫瘤周圍組織樣品(包括10名男性和10名女性)的FL BARD1和BARD1同工型進行評分并將其示出?；诟鱾€腫瘤周圍樣品或腫瘤樣品(A)中的存在或不存在，和各個同工型(B、C、D)的表達的存在或不存在，對表達進行定量。(A)基于任何形式的BARD1的存在和不存在，對腫瘤周圍組織和腫瘤組織中(包括在男性樣品、女性樣品中和在聯(lián)合樣品中)BARD1表達的比較。無論在女性(P＝0.0010)中還是在男性(P＝0.0679)中，BARD1表達在來自腫瘤的組織中比在來自腫瘤周圍的組織中更豐富和頻率更高(P＝0.0003)。(B)腫瘤周圍組織和腫瘤組織中的FL BARD1和同工型表達的比較。腫瘤中所有形式都上調，具有統(tǒng)計學顯著性(對于所有形式P<0.05)。(C/D)在來自男性和女性的結直腸組織中的FL BARD1和同工型表達的比較。無論在腫瘤周圍組織(C)中還是在腫瘤組織(D)中，F(xiàn)L BARD1和同工型的表達在來自男性和女性的組織中相似(對于所有形式P<0.05)。通過χ2檢驗獲得P值。

圖13顯示FL BARD1和同工型mRNA表達與結直腸癌中的臨床病理變量的相關性。(A)在年輕(<60歲)和老年(>60歲)患者中FL BARD1和同工型表達的比較。FL BARD1和除同工型β之外的所有同工型，在老年患者中比在年輕患者中上調更多。具體而言，同工型δ和π的表達與老年患者顯著相關(P<0.01)。(B-E)通過原發(fā)腫瘤和淋巴結狀態(tài)、以及腫瘤階段和級別，比較FL BARD1和同工型表達。BARD1同工型κ表達與較大尺寸的腫瘤或附近的組織浸潤(B)、淋巴結累積(C)、以及晚期(III期和IV期)(D)顯著相關。在BARD1同工型表達和腫瘤組織病理學級別之間未發(fā)現(xiàn)相關性(E)。通過χ2檢驗獲得P值。未示出P>0.05的比較。

圖14顯示用于對血液或血清中的BARD1同工型特異性抗體檢測的ELISA測試的實例。

圖15顯示用位于ATG處和π中的缺失連接(deletion junction)處的引物進行的同工型π的擴增。鑒定出由外顯子2的另外缺失導致的第二同工型，π’。

圖16顯示了對HeLa、MCF7、RPE1和NLF細胞用抗-Bard1抗體進行的蛋白質印跡。Ab Bethyl BL518(BL)識別在中部外顯子4中編碼的表位。針對由外顯子1中的β-特異性選擇性ORF編碼的表位產生Ab PGP。識別了BARD1同工型β和BARD1同工型β-d-5(β’)和BARD1同工型η。

圖17顯示BARD1同工型的siRNA抑制。A)siRNA靶序列的位置。使用外顯子4中的兩個siRNA，K401和K423。K401位于同工型π的缺失內，K423在缺失的上游。B-C)K401比K423對生長的作用小。B)siRNA表達與GFP表達相結合。許多陽性細胞在表達K401的細胞中生長，少量在表達K423的細胞中生長。C)生長曲線確認，K423抑制細胞生長與之前報道的靶向所有形式的BARD1的K78一樣有效。

圖18顯示微RNA影響B(tài)ARD1和BARD1同工型表達。RT-PCR顯示所有形式的BARD1都被miR-203輕微抑制。蛋白質印跡顯示miR-203過表達對FL、β和π的強烈抑制。

具體實施方式

雖然可將與本文所述類似或等效的方法和材料用于本發(fā)明的實踐或測試，但合適的方法和材料描述如下。通過參考并入本文提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻的全部內容。提供本文所述的出版物和申請僅僅是為了公開在本申請的提交日之前的內容。此處決不能解釋為承認由于之前的發(fā)明導致本發(fā)明沒有資格早于此類出版物。此外，材料、方法和實例僅是說明性的，不是意圖進行限制。

在矛盾的情況下，以本說明書(包括定義)為準。

除非另外定義，本文所用所有科技術語具有與本文主題所屬領域的技術人員通常理解的含義相同的含義。如本文所用，為了便于理解本發(fā)明提供以下定義。

術語“包含”通常以包括的意思使用，也就是說允許存在一種或多種特征或成分。

如說明書和權利要求所用，單數形式的"a"、"an"和"the"包括多個指代對象，除非上下文明確做出了不同規(guī)定。例如BARD1同工型是指至少一種BARD1同工型。

如本文所用術語“同工型”是同一蛋白的數種不同形式中的一種，如本發(fā)明的BARD1蛋白。諸如BARD1等蛋白的不同形式，可以從相關基因生產，或可以由同一基因通過選擇性剪接而產生。大量同工型可由單核苷酸多態(tài)性或SNP(同一基因的等位基因之間的較小遺傳學差異)引起。這些出現(xiàn)在基因的特定的個別核苷酸位置。

如本文所用術語“受試對象”或“患者”是本領域公知的，并且在本文中用于指哺乳動物，最優(yōu)選是人。在某些實施方式中，所述受試對象是需要治療的受試對象或患有肺癌和/或結直腸癌的受試對象。但是，在其它實施方式中，所述受試對象可以是尚未發(fā)展出肺癌和/或結直腸癌癥狀的正常受試對象或已經進行針對肺癌和/或結直腸癌的治療的受試對象。該術語不指示特定的年齡或性別。因此，意圖覆蓋成年或幼年受試對象，無論男性還是女性。

如本文所用，術語“肽”、“蛋白”、“多肽”和“肽的(peptidic)”可以相互替換地使用，來指通過相鄰殘基的α-氨基和羧基之間的肽鍵連接到其它氨基酸的一系列氨基酸殘基。

與所預期的相反，申請人已經令人驚奇地在來自100例非小細胞肺癌(NSCLC)和165例結直腸癌的患者群組的每個樣品中鑒定出除已知的同工型α、β、η、γ、ε、δ和θ之外的兩個新的其它BARD1同工型。另一令人驚奇的特征是同工型α在來自100例NSCLC和165例結直腸癌的患者群組的每個樣品中都不存在。將這些新型同工型命名為κ和π。實際上BARD1同工型在NSCLC和結直腸癌的腫瘤組織中表達相似的模式，它們都表達兩種新型的同工型κ和π，同工型κ和π不同于在婦科癌癥中鑒定出的BARD1同工型(WO2008/119802)。該發(fā)現(xiàn)表明BARD1的異常表達在女性激素依賴性腫瘤組織和非女性激素依賴性腫瘤組織中可能是不同的。

新型同工型κ帶有外顯子3的缺失，從外顯子2翻譯到外顯子4中不是框內的，但是翻譯可以在外顯子4內開始。所得的蛋白產物的抗體反應性與同工型β相似。

新型同工型π帶有在外顯子4內的編碼第301～436位氨基酸的408bp的缺失。同工型π的翻譯會產生與抗體PVC和WFS反應但卻缺少重要的NLS的蛋白(圖4C、E和圖6)。同工型π源自新的剪接機制，該剪接機制產生外顯子4的部分缺失，但保留外顯子1-3以及外顯子4的開始部分，因此保留BRCA1結合性RING指結構域。同工型π保留外顯子1-3以及外顯子4的開始部分，因此保留了被PVC和WFS識別的表位，所述表位為未在任何其它同工型中發(fā)現(xiàn)的表位的組合。同工型π可以用抗體PVC和WFS檢測，這些抗體在小鼠晚期肺腫瘤中顯示出染色增加。因此，同工型π可以是NSCLC中腫瘤發(fā)展的致癌驅動物。同工型π中外顯子4的部分缺失可能是重要的區(qū)域，因為其具有數種癌癥相關突變和NLS(圖4E)，這可能解釋PVC和WFS染色的細胞質定位。異常的胞內定位可能影響蛋白修飾，例如磷酸化和蛋白-蛋白相互作用。

同工型π對于肺癌似乎特別重要，這是因為其是唯一的在腫瘤組織中顯著上調和在腫瘤周圍組織中缺乏或僅弱表達的同工型，而所有其它BARD1同工型在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中都相似地表達(圖4B；圖7)。外顯子4的部分缺失引起B(yǎng)ARD1上重要的NLS的喪失，這可能解釋細胞質定位。

由外顯子2的缺失導致的另外的同工型π’，在肺癌和結直腸癌中與同工型π共表達。

申請人證明，F(xiàn)LBARD1(全長BARD1)和剪接同工型在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中表達，并且可能促成腫瘤發(fā)生和發(fā)展。但是，同工型π在腫瘤中特異性表達，可能參與致癌發(fā)展。FL BARD1在mRNA水平上表達，但不存在FL BARD1的蛋白翻譯。因此在蛋白水平上，BARD1同工型，而不是FL BARD1，在來自100個NSCLC和165個結直腸癌患者群組的每個樣品中表達。同工型表達和定位與BRCA1不相關，表明BRCA1-BARD1異二聚體的E3泛素連接酶功能在兩種類型的癌癥中受損。BRCA1蛋白的穩(wěn)定性和定位極大地依賴于BARD1。導致BRCA1-BARD1缺乏腫瘤抑制功能喪失的FL BARD1的缺失引起基因組不穩(wěn)定和對凋亡的抗性。除了FL BARD1的喪失的這個效果之外，過表達的差異性剪接BARD1同工型可能是腫瘤形成的驅動物。

選擇性剪接是肺癌中經常觀察到的現(xiàn)象，并且對于許多調控性蛋白都得到驗證。剪接同工型能夠翻譯成具有拮抗功能的異常蛋白同工型。對于兩種BARD1剪接變體，BARD1β和BARD1δ，這已經得到驗證，BARD1β和BARD1δ分別通過穩(wěn)定Aurora B和作用在Erα上對FL BARD1功能起拮抗作用。因此，NSCLC中的BARD1同工型表達可能不僅是旁觀者，還可能是腫瘤形成的驅動者。實際上，分別被抗體PVC和WFS識別的定位到外顯子3和4的表位的表達在誘導了肺癌的小鼠模型的肺腫瘤的侵襲階段中增加。

所有的腫瘤組織樣品和腫瘤周圍組織樣品還表達在婦科癌癥中發(fā)現(xiàn)的同工型；具體而言是同工型δ。BARD1同工型δ結合和穩(wěn)定ERα，與BRCA1-BARD1異二聚體的功能相反。由于ERα也在所有樣品中表達，BARD1同工型可能通過雌激素而得到上調并參與肺癌中的雌激素信號傳導。因此，數種BARD1同工型似乎與癌形成相關。

由于癌細胞需要BARD1或BARD1同工型以增殖，NSCLC和結直腸癌中的BARD1同工型表達不僅是旁觀者，還可能是腫瘤形成的驅動者。特別是表達定位到外顯子3和4的表位的同工型，似乎與NSCLC和結直腸癌中的較短存活都相關。這些表位在小鼠肺癌模型的侵襲性腫瘤中上調。NSCLC和結直腸癌中表達的BARD1同工型源自選擇性剪接。例如，剪接同工型能夠翻譯成具有拮抗功能的異常蛋白同工型。

所有的肺腫瘤樣品和腫瘤周圍組織樣品都表達ERα和同工型δ。但是，在系列結直腸癌病例中不存在ERαmRNA表達，并且在BARD1同工型表達和性別之間未發(fā)現(xiàn)差異。

但是，令人感興趣的是，高頻率的N19陽性染色與結直腸癌的女性性別顯著相關(P＝0.014)，并且該發(fā)現(xiàn)和NSCLC中與女性性別相關的BARD1 N端表位的表達一致(統(tǒng)計學顯著性是臨界的，P＝0.051)。NSCLC中，在女性中觀察到BARD1同工型γ、ε和η的高mRNA水平的表達，而在男性中同工型β和κ過表達。同工型γ和ε表達能夠通過BARD1 N19檢測，而同工型β、κ和η不能。因此，BARD1同工型表達的蛋白水平和mRNA水平是一致的，表明性別特異性BARD1同工型在這些癌癥中表達。

BARD1同工型在NSCLC和結直腸癌的腫瘤組織與腫瘤周圍組織中顯示了不同的表達模式。NSCLC中，除了同工型π之外的所有同工型在腫瘤周圍組織中表達并在腫瘤組織中僅輕微增加，但在獲自良性肺疾病的對照組織中觀察到任何形式的BARD1表達較少或不表達。相反，在結直腸癌中，BARD1同工型在腫瘤組織中表達的頻率較高，但在腫瘤周圍組織中不表達或表達較少。該結果可以通過根據不同細胞類型對外部刺激或某些病理學狀況和/或在肺組織和結直腸組織之間ERα表達的差異的應答而多樣性調節(jié)選擇性剪接來解釋。

用PVC抗體或WFS抗體或二者獲得的陽性染色與NSCLC患者的存活減少相關。但是，四種抗體的陽性染色模式與結直腸癌中的存活較長顯著相關，對于N19陽性染色情況也是如此；而PVC和WFS陽性染色模式，而不是它們各自的陽性染色，與存活較短強相關。事實上，不同的表達模式不僅反映了不同BARD1同工型的表達，還反映了同工型的組合的表達。根據BARD1表達的不同表位的相關性，似乎觀察到數種BARD1同工型：NSCLC和結直腸癌中的N端和C端截短形式以及內部缺失形式，以及結直腸癌中N端喪失的其它形式。四種抗體陽性染色的表達模式未表明同工型π的表達，但可能反映了BARD1的不同同工型的同時表達。

事實上，BARD1同工型π的表達與被PVC和WFS識別的表位一致，所述表位為未在任何其它同工型中發(fā)現(xiàn)的表位的組合。實際上，PVC和WFS染色是細胞質的染色。PVC和WFS的表達與NSCLC和結直腸癌的不良預后明顯相關，PVC和WFS染色還與小鼠肺癌模型中的癌癥發(fā)展相關。

PVC和WFS反應性表位的強表達，加上N端和C端表位的弱表達可能表明這些表位被空間構型和/或蛋白-蛋白相互作用封閉。FL BARD1與BARD1同工型的翻譯后調節(jié)或差異性蛋白穩(wěn)定性可能還解釋說明了在蛋白水平上FL BARD1的不存在，而其在mRNA水平上存在。

申請人證明BARD1同工型的表達在NSCLC和結直腸癌中是常見的。這些同工型的表達與NSCLC和結直腸癌的預后(不良預后或良好預后)顯著相關，強烈地表明BARD1同工型參與了腫瘤形成、發(fā)展和致死性。因此，BARD1及其同工型可以是有前景的診斷和預后標志物，不僅用于鑒定對更具侵襲性的治療具有不良預后可能的個體，還為搜尋有效的分子靶向治療指明了新方向。例如，諸如κ和π等BARD1同工型可以是肺癌和結直腸癌治療新策略的靶標。

檢測特異性同工型κ和π有助于在潛在的治愈性外科手術治療之前和/或之后鑒定有死于NSCLC和結直腸癌的最高風險的受試對象，這是因為其是選擇用輔助性化療進行隨后治療的受試對象的關鍵步驟。

本發(fā)明提供了一種用于檢測獲自受試對象的生物樣品中對肺癌和結直腸癌具有特異性的BARD1同工型的存在的方法，所述方法包括檢測所述樣品中對肺癌和結直腸癌具有特異性的至少一種BARD1同工型的步驟，所述至少一種BARD1同工型選自包含以下同工型的組：

同工型π，其包含SEQ ID NO：1、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的序列，和

同工型κ，其包含SEQ ID NO：2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：2具有至少95％同源性的序列，

其中，在獲自所述受試對象的樣品中所述對肺癌和結直腸癌具有特異性的所述BARD1同工型的存在是所述受試對象罹患肺癌和/或結直腸癌、具有升高的患肺癌和/或結直腸癌的風險、以及/或者治療肺癌和/或結直腸癌后具有復發(fā)的風險的標志。

優(yōu)選的是，所述檢測步驟包括檢測BARD1同工型π和BARD1同工型κ，BARD1同工型π包含SEQ ID NO：1、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的序列，BARD1同工型κ包含SEQ ID NO：2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：2具有至少95％同源性的序列。

還優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法包括檢測所述生物樣品中由SEQ ID NO：1組成的BARD1同工型π和由SEQ ID NO：2組成的BARD1同工型κ的步驟。

本發(fā)明的方法還包括檢測所述生物樣品中選自包含以下同工型的組中的至少一種BARD1同工型：

同工型π’，同工型π’包含SEQ ID NO：105、其生物活性片段或與SEQ ID NO：105具有至少95％同源性的序列，

同工型β，同工型β包含SEQ ID NO：5、其生物活性片段或與SEQ ID NO：5具有至少95％同源性的序列，

同工型δ，同工型δ包含SEQ ID NO：6、其生物活性片段或與SEQ ID NO：6具有至少95％同源性的序列，和

同工型γ，同工型γ包含SEQ ID NO：7、其生物活性片段或與SEQ ID NO：7具有至少95％同源性的序列，

同工型β’，同工型β’包含SEQ ID NO：106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：106具有至少95％同源性的序列。

優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法還包括檢測所述生物樣品中選自包含以下同工型的組中的至少一種BARD1同工型：

同工型π’，同工型π’包含SEQ ID NO：105、其生物活性片段或與SEQ ID NO：105具有至少95％同源性的序列，

同工型β，同工型β包含SEQ ID NO：5、其生物活性片段或與SEQ ID NO：5具有至少95％同源性的序列，

同工型β’，同工型β’包含SEQ ID NO：106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：106具有至少95％同源性的序列。

還優(yōu)選的是，本發(fā)明的方法包括檢測所述生物樣品中由SEQ ID NO：1組成的BARD1同工型π、由SEQ ID NO：2組成的BARD1同工型κ和由SEQ ID NO：5組成的BARD1同工型β的步驟。

在本發(fā)明的上下文中，“生物活性片段”是指本發(fā)明的BARD1同工型的區(qū)域，其對于BARD1同工型的正常功能，例如拮抗功能而言是必須的。生物活性片段包括包含與SEQ ID NO：1～7、105～106的氨基酸序列具有足夠同源性或源自SEQ ID NO：1～7、105～106的氨基酸序列的氨基酸序列，其包含的氨基酸比全長BARD1同工型少，并且展示至少一種拮抗活性。通常，生物活性片段包含具有至少一種拮抗活性的結構域或基序。本發(fā)明的BARD1同工型的生物活性片段可以是長度為例如10個、25個、50個、100個或更多個氨基酸殘基的多肽。此外，其中缺失其它區(qū)域的其它生物活性片段可以通過重組技術制備，并對其就本發(fā)明的天然BARD1同工型的一種或多種功能活性進行評價。

例如，同工型π的一種生物活性片段可以由SEQ ID NO：3組成，同工型κ的一種生物活性片段可以由SEQ ID NO：4組成，同工型β的一種生物活性片段可以由SEQ ID NO：4組成。

在另外的實施方式中，本發(fā)明的BARD1同工型是以下多肽，所述多肽包含與包含SEQ ID NO：1～7、105～106的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％或99％，優(yōu)選為95％同源性的氨基酸序列，并且保持包含SEQ ID NO：1～7、105～106的BARD1同工型的活性。

為了確定兩個氨基酸序列的同源性百分比，為了最佳比較目的將序列進行比對(例如，為了與第二氨基酸序列進行最佳比對，可以在第一氨基酸序列中引入空位)。然后比較在相應氨基酸位置處的氨基酸殘基。當第一序列中的位置被與在第二序列中的相應位置相同的氨基酸殘基占據時，則分子在該位置是同源的。比對和百分比同源性可以使用本領域已知的任何合適的軟件，例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等(eds)1987,Supplement 30,第7.7.18小節(jié))中描述的軟件確定。優(yōu)選的程序包括GCG Pileup程序、FASTA(Pearson等(1988)Proc.Natl,Acad.Sci USA 85：2444-2448)和BLAST(BLAST Manual,Altschul等,Natl.Cent.Biotechnol.Inf.,Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,Md.,和Altschul等,(1997)NAR 25：3389-3402)。另一優(yōu)選的比對程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,PA)，優(yōu)選使用默認參數。發(fā)現(xiàn)有用的另一序列軟件程序是Sequence Software Package Version 6.0中可獲得的TFASTA Data Searching Program(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)。

片段是與本發(fā)明的BARD1同工型的各序列在長度上共有至少40％的氨基酸的序列?？梢允褂眠@些序列，只要它們展現(xiàn)與它們所源自的天然序列相同的生物學性質，例如拮抗活性。優(yōu)選的是，這些序列與其所源自的各序列在長度上共有超過70％、優(yōu)選超過80％特別是超過90％且最優(yōu)選95％的氨基酸。這些片段可以通過本領域已知的各種方法和技術(例如化學合成)來制備。

本發(fā)明還包括BARD1同工型的變體。變體是這樣的肽或多肽，它們具有的氨基酸序列在一定程度上不同于天然序列的肽或多肽，它們是通過保守性氨基酸取代而不同于天然序列的氨基酸序列，由此一個或多個氨基酸被具有相同特征和構象作用的另外的氨基酸取代。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列內的某些位置處擁有取代、缺失、側鏈修飾和/或插入。此處將保守性氨基酸取代定義為在以下五組中的一組內的交換：

I.小的脂肪族的非極性或輕微極性的殘基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly

II.極性的帶正電的殘基：His、Arg、Lys

III.極性的帶負電的殘基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln

IV.大的芳香族殘基：Phe、Tyr、Trp

V.大的脂肪族的非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val、Cys。

應該理解，一些非常規(guī)氨基酸也可以是天然存在的氨基酸的合適的取代物。例如，Lys殘基可以被鳥氨酸、高精氨酸、nor-Lys、N-甲基-Lys、N,N-二甲基-Lys和N,N,N-三甲基-Lys取代。Lys殘基還可以被合成的堿性氨基酸取代，所述堿性氨基酸包括，但不限于，N-1-(2-吡唑啉基)-Arg、2-(4-哌啶基)-Gly、2-(4-哌啶基)-Ala、2-[3-(2S)吡咯啉基]-Gly和2-[3-(2S)吡咯啉基]-Ala。Tyr殘基可以被4-甲氧基酪氨酸(MeY)、間-Tyr、鄰-Tyr、nor-Tyr、1251-Tyr、單鹵素-Tyr、二鹵素-Tyr、O-磺-Tyr、O-磷-Tyr和硝基-Tyr取代。

Tyr殘基還可以被3-羥基或2-羥基異構體(分別為間-Tyr或鄰-Tyr)和相應的O-磺-和O-磷衍生物取代。Tyr殘基還可以被合成的含有羥基的氨基酸取代，合成的含有羥基的氨基酸包括但不限于4-羥基甲基-Phe、4-羥基苯基-Gly、2,6-二甲基-Tyr和5-氨基-Tyr。脂肪族氨基酸可以被帶有非天然脂肪族支鏈或直鏈側鏈CnH2n+2的合成衍生物取代，CnH2n+2中n是從1至最多8且包括8的數值。合適的被非常規(guī)氨基酸保守性取代的實例在WO02/064740中給出。

插入包括加入一個或多個天然存在的或非常規(guī)的氨基酸殘基。缺失包括一個或多個氨基酸殘基的缺失。

此外，由于天然肽(為L型)的固有問題是被天然酶降解，可以將本發(fā)明的生理活性蛋白制備為包括所述肽的D型和/或“逆反異構體(retro-inverso isomers)”。優(yōu)選的是，制備本發(fā)明生理活性蛋白的較短部分的逆反異構體、變體或組合。例如如Sela和Zisman在出版于FASEB J.1997 May；11(6)：449-56的綜述中所述，為已知序列的肽制備逆反肽?！澳娣串悩嬻w”是指直鏈肽的異構體，其中序列的方向相反并且各氨基酸殘基的手性反轉，因此可以不存在端基互補。

本發(fā)明還包括其中一個或多個肽鍵已經被備選類型的不容易受肽酶切割影響的共價鍵代替的類似物(“肽模擬物”)。在注入受試對象之后肽的蛋白水解降解成為問題的情況下，將特別敏感的肽鍵替換為不可切割的肽模擬物會使所得的肽更穩(wěn)定，因此作為活性物質更有用。此類模擬物以及將它們引入肽的方法是本領域公知的。

優(yōu)選的是，所述生物樣品選自包含以下樣品的組：活組織檢查樣品、組織學樣品、肺液、冷凍組織樣品、腫瘤組織樣品、糞便樣品、腦脊髓液(CSF)、循環(huán)腫瘤細胞(CTC)和血液樣品，更優(yōu)選的是受試對象是人類。最優(yōu)選的是生物樣品是源自獲自受試對象的血液樣品的血清。

檢測本發(fā)明的BARD1同工型的存在可以通過常規(guī)方法進行，例如蛋白免疫染色、蛋白免疫沉淀、免疫電泳、免疫印跡、BCA蛋白檢驗、蛋白質印跡、分光光度法。BARD1同工型的存在還可以利用常規(guī)方法經由其相應的mRNA的存在來檢測，所述常規(guī)方法例如RNA印跡、核酸酶保護檢驗(NPA)、原位雜交和逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)。優(yōu)選的是，在循環(huán)腫瘤細胞(CTC)中檢測BARD1同工型特異性RNA的表達。

在本發(fā)明的實施方式中，BARD1同工型的存在通過使用對本發(fā)明的BARD1同工型具有特異性的抗體來檢測。優(yōu)選的是，所述抗體是與至少一種BARD1同工型特異性結合的多克隆抗體或單克隆抗體或它們的片段，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。還優(yōu)選的是，所述抗體是與至少一種BARD1同工型的不同表位特異性結合的抗體或其片段的組合，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。優(yōu)選的是，所述表位是外顯子3和4。

優(yōu)選的是，所述多克隆抗體或單克隆抗體或抗體的所述組合與至少一種BARD1同工型特異性結合，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1和2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-2具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。

例如，允許檢測本發(fā)明的BARD1同工型的抗體為以下抗體：

-N19、C20和H300(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA),

-生成PVC和WSF(外顯子4的開始部分)并如之前所述應用(Irminger-Finger I等,Mol Cell 8：1255-66,2001；Feki A等,Oncogene 24：3726-36,2005；Hayami R等,Cancer Res 65：6-10,2005；Li L等,Int J Biochem Cell Biol 39：1659-72,2007；Redente EF等,Anticancer Res 29：5095-101,2009；Fabbro M等,J Biol Chem 277：21315-24,2002)，

-BL(Bethy Laboratories),

-JH2和JH3(Gautier等Cancer Rsearch,2000),

-PGP(Ryser等,Cancer Research,2000),

-ELS和KPD，由Applicants生產

-MIQ(Irminger-Finger等,JCB 1998)

所述檢測可以通過免疫組織化學分析進行，并總結于表1中：

-BARD1同工型π應該對N19(或PVC或MIQ)加上或者BL(或WFS)為陽性，并且對JH2為陰性。為了區(qū)分同工型π和π’(π-d-2)，可以通過蛋白質印跡中的尺寸(size)來完成。

-BARD1同工型κ應該對BL(或WFS)為陽性，并且對N19(或PVC或MIQ)為陰性。

-BARD1同工型β應該對PGP，以及或者WFS或BL為陽性。為了區(qū)分同工型β和β’(β-d-5)，同工型β對ELS為陽性。

-BARD1同工型δ應該對N19為陽性，對PVC(或MIQ)為陰性并且對BL(或WFS)為陰性。

-BARD1同工型γ應該對N19以及任一PVC(或MIQ)為陽性，但對C20(或KPD)為陰性。

β-D-5是同工型β’的別稱，pi-D-5是同工型π’的別稱。

在本發(fā)明的另一實施方式中，所述BARD1同工型的存在通過檢測編碼至少一種BARD1同工型的mRNA的水平(表達)來檢測，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。優(yōu)選的是，所述mRNA編碼至少一種BARD1同工型，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1和2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-2具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。所述mRNA的表達優(yōu)選在體外在獲自受試對象的循環(huán)腫瘤細胞(CTC)中進行。

在本發(fā)明的另一實施方式中，通過檢測獲自受試對象的血液樣品中，優(yōu)選血清中對本發(fā)明的BARD1同工型具有特異性的自身免疫抗體的存在，來檢測所述BARD1同工型的存在。優(yōu)選的是，所述自身免疫抗體是對BARD1同工型π和κ具有特異性的抗體。

在本發(fā)明的上下文中，“自身免疫抗體”或“自身抗體”是指針對本發(fā)明的BARD1同工型的天然存在的抗體，即使這些BARD1同工型是實際上源自該受試對象，受試對象的免疫系統(tǒng)也將其認為是外源蛋白。因此這些BARD1同工型引發(fā)免疫應答。優(yōu)選的是，所述BARD1同工型是同工型π和κ。

自身免疫抗體可以通過本領域公知的常規(guī)免疫檢驗來檢測，例如不同的ELISA技術(使用固定在板表面上的抗體或使用固定在板表面上的抗原來捕獲抗體)、放射免疫檢驗等(見Immunoassay,E.Diamandis和T.Christopoulus,Academic Press,Inc.,San Diego,CA,；1996)。用于檢測具有特定免疫學特異性的抗體的免疫檢驗需要使用對所測試的抗體展示有特異性免疫反應性的試劑(抗原)。取決于所述檢驗的形式，該抗原可以固定在固體支持體上。使要測試抗體的存在的樣品(例如血液樣品)與該抗原接觸，并且如果所需免疫特異性的抗體存在于該樣品中，它們會與該抗原免疫反應，從而形成之后可被檢測或被定量測定的抗體-抗原復合物。

因此根據本發(fā)明的實施方式，通過檢測獲自所述受試對象的血液樣品中對所述BARD1同工型具有特異性的自身免疫抗體的存在，來檢測BARD1同工型的存在，其中使用選自包含SEQ ID NO：13–80的組中的至少一種抗原(肽)、優(yōu)選至少四種抗原(肽)以檢測對所述BARD1同工型具有特異性的所述自身免疫抗體。所述BARD1同工型選自包含同工型α、β、β’、η、γ、ε、δ、θ、π、π’和κ的組。優(yōu)選的是，所述BARD1同工型選自包含同工型β、β’、δ、γ、π、π’和κ的組。更優(yōu)選的是，所述BARD1同工型選自包含同工型β、π和κ的組。最優(yōu)選的是，所述BARD1同工型選自包含同工型π和κ的組。自身免疫抗體的檢測優(yōu)選在體外對獲自受試對象的血液樣品、優(yōu)選血清進行。

更優(yōu)選的是，BARD1同工型是對肺癌和結直腸癌具有特異性的同工型π和κ，抗原選自包含SEQ ID NO：16、17、18、23、59-67、68、69、74、75、76-80的組。最優(yōu)選的是，抗原選自包含SEQ ID NO：16、17、18、23、68、69、74和75的組。

在一個實施方式中，本發(fā)明提供選自包含SEQ ID NO：13～80的組中的肽以用于檢測本發(fā)明的BARD1同工型的存在的方法。

申請人已經發(fā)現(xiàn)，選自包含SEQ ID NO：13～80的組中的抗原也可以通過檢測對選自包含同工型α、β、β’、η、γ、ε、δ、θ、π、π’和κ的組中的BARD1同工型具有特異性的自身免疫抗體的存在，而用于檢測選自乳癌、卵巢癌、前列腺癌、成神經細胞瘤和白血病的其它癌癥。例如，選自包含SEQ ID NO：13、14、15、23、59-67、69、70、75-80的組中的抗原可用于檢測乳癌、卵巢癌和前列腺癌。

因此在另一實施方式中，本發(fā)明提供選自包含SEQ ID NO：13～80的組中的肽，所述肽在檢測獲自受試對象的生物樣品中BARD1同工型的存在的方法中用作抗原，其中通過檢測對所述BARD1同工型具有特異性的自身免疫抗體的存在來檢測所述BARD1同工型的存在，并且其中所述BARD1同工型在所述樣品中的存在是所述患者罹患癌癥的標志。所述BARD1同工型選自包含同工型α、β、β’、η、γ、ε、δ、θ、π、π’和κ的組。

應該將至少一種抗原用于檢測對BARD1同工型具有特異性的自身免疫抗體的存在。優(yōu)選使用至少4種抗原，更優(yōu)選使用4～10種抗原，最優(yōu)選使用4～6種抗原。

還可以將本發(fā)明的抗原與陰性對照樣品(健康對照血液樣品)接觸以獲得基線，這有助于區(qū)分癌癥受試對象與健康受試對象(參見實施例–肺癌患者血液中抗-BARD1自身免疫抗體的檢測)?？蛇x的是，還可以將本發(fā)明的抗原與陽性對照樣品(已確認的癌癥血液樣品)接觸以獲得明確的陽性結果。

在另一實施方式中，可以將來自受試對象的血液樣品與本發(fā)明的BARD1同工型(優(yōu)選同工型π和κ)或其片段接觸。然后可以檢測自身免疫抗體和所述BARD1同工型之間的特異性結合，從而基于自身免疫抗體和所述BARD1同工型之間的特異性結合的量確定肺癌和/或結直腸癌的存在或不存在。自身免疫抗體的檢測優(yōu)選在體外對獲自受試對象的血液樣品、優(yōu)選血清進行。

作為另一選擇，根據本發(fā)明的實施方式，本發(fā)明的BARD1同工型的存在通過以下方式來檢測：

檢測編碼至少一種BARD1同工型的mRNA的水平，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，和

檢測獲自所述受試對象的血液樣品中對所述BARD1同工型具有特異性的自身免疫抗體的存在，并且其中使用選自包含SEQ ID NO：13–80的組中的至少四種抗原以檢測對所述BARD1同工型具有特異性的所述自身免疫抗體。

本發(fā)明還提供了一種在本發(fā)明的方法中用作生物標志物的分離和/或純化的多肽，所述分離和/或純化的多肽包含SEQ ID NO：1、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的序列；還提供一種在本發(fā)明的方法中用作生物標志物的分離和/或純化的多肽，所述分離和/或純化的多肽包含SEQ ID NO：2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：2具有至少95％同源性的序列。

本發(fā)明還提供一種抗體或其片段，所述抗體或其片段與BARD1同工型π上的SEQ ID NO：143(DTKSRNEVVTPIKGDIPSVEYLLQNGS)所示的表位結合。優(yōu)選的是，本發(fā)明提供一種抗體或其片段，所述抗體或其片段與SEQ ID NO：144(NEVVTPIKGDIPSVEY)所示的表位結合。

本發(fā)明還提供一種在用于治療和/或預防肺癌和結直腸癌的方法中使用的抗體或其片段，所述抗體或其片段與SEQ ID NO：143所示的表位結合。優(yōu)選的是，本發(fā)明提供一種在用于治療和/或預防肺癌和結直腸癌的方法中使用的抗體或其片段，所述抗體或其片段與SEQ ID NO：144所示的表位結合。

本發(fā)明還包括在用于治療和/或預防肺癌和結直腸癌的方法中使用的、與至少一種BARD1同工型特異性結合的多克隆抗體或單克隆抗體或它們的片段，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，并且其中不包括以下抗體：N19、C20、H300、PVC、WSF、BL、JH2、JH3、PGP、ELS、KPD、MIQ。

本發(fā)明還包括在用于治療和/或預防肺癌和結直腸癌的方法中使用的、與至少一種BARD1同工型的不同表位特異性結合的抗體或或其片段的組合，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，并且其中不包括以下抗體：N19、C20、H300、PVC、WSF、BL、JH2、JH3、PGP、ELS、KPD、MIQ。

本發(fā)明的抗體還可用于檢測受試對象的組織樣品、受試對象的體液或受試對象的血液中的循環(huán)細胞中的BARD1同工型，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。

如本文所用，術語“抗體”是指具有特定結構的免疫球蛋白分子，其僅與用于合成該抗體(例如本發(fā)明的BARD1同工型)的抗原或與與其密切相關的抗原相互作用(即，結合)。此外，抗體可以是抗體的片段或經修飾的抗體，只要其與標志物基因編碼的一種或多種蛋白結合即可。例如，抗體片段可以是Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv)，其中來自重鏈和輕鏈的Fv片段通過合適的接頭連接(Huston J.S.等,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-83.)。更具體而言，抗體片段可以通過用酶(包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)處理抗體來產生。作為另一選擇，可以構建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體中并在合適的宿主細胞中表達(參見，例如Co M.S.等,(1994)J.Immunol.152：2968-76；Better M.和Horwitz A.H.(1989)Methods Enzymol.178：476-96.；Pluckthun A.and Skerra A.(1989)Methods Enzymol.178：497-515.；Lamoyi E.(1986)Methods Enzymol.121：652-63.；Rousseaux J.等,(1986)Methods Enzymol.121：663-9.；Bird R.E.和Walker B.W.(1991)Trends Biotechnol.9：132-7.)。

抗體可以通過與各種分子，例如聚乙二醇(PEG)綴合而進行修飾?？梢酝ㄟ^對抗體進行化學修飾而獲得經修飾的抗體。此類修飾方法在本領域是常規(guī)的。

作為另一選擇，抗體可以包括嵌合抗體或人源化抗體，所述嵌合抗體具有來自非人類抗體的可變區(qū)和來自人類抗體的恒定區(qū)，所述人源化抗體包含來自非人類抗體的互補決定區(qū)(CDR)、來自人類抗體的框架工作區(qū)(FR)和恒定區(qū)。此類抗體可以通過使用已知技術制備。人源化可以通過用嚙齒動物的一個或多個CDR序列取代人類抗體的對應序列來進行{參見，例如Verhoeyen等,(1988)Science 239：1534-6)。因此，此類人源化抗體是嵌合抗體，其中基本上小于完整的人可變結構域已經被來自非人類物種的對應序列替代。還可以使用包含除人類框架區(qū)和恒定區(qū)之外的人類可變區(qū)的全長人抗體。此類抗體可以使用本領域已知的各種技術生產。例如，體外方法包括使用在噬菌體上展示的人抗體片段的重組文庫(例如，Hoogenboom&Winter,(1992)J.MoI.Biol.227：381-8)。類似地，人抗體可以通過將人免疫球蛋白基因座引入其中內源性免疫球蛋白基因已經部分或完全失活的轉基因動物(例如小鼠)中來制造。該方法例如描述于美國專利6,150,584、5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016中。此類抗體可以通過使用已知技術制備。

本發(fā)明還提供一種在用于治療和/或預防肺癌和結直腸癌的方法中使用的重組siRNA分子，所述重組siRNA分子與單鏈或雙鏈RNA分子結合，其中所述單鏈或雙鏈RNA分子包含編碼至少一種BARD1同工型的mRNA，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，由此所述BARD1同工型的表達受到抑制。

優(yōu)選的是，所述mRNA編碼至少一種BARD1同工型，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1和2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-2具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。

在本發(fā)明的上下文中，siRNA(RNA干擾或小干擾RNA)抑制或減少BARD1同工型的表達。優(yōu)選的是，所述同工型是π、π’、κ、β、β’、δ和γ，更優(yōu)選π、κ、β，最優(yōu)選π和κ。此處，術語“siRNA”是指阻止靶mRNA的翻譯的雙鏈RNA。通常，siRNA包括針對一種或多種BARD1同工型的表達的正義核酸序列和反義核酸序列，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。

通常，siRNA可以是分離的。“分離的”siRNA是從其起始環(huán)境中取出的siRNA。例如，如果將siRNA克隆到不是天然環(huán)境的一部分的載體中時，則認為該siRNA是分離的。

siRNA可以完全通過合成來構建并由兩個互補單鏈RNA組成，或者通過生物合成來構建。將siRNA構建成兼具來自靶基因的正義序列和互補的反義序列的一個轉錄物(例如單發(fā)夾RNA或shRNA)?？梢允褂脤iRNA導入細胞的標準技術，包括其中將DNA作為轉錄RNA的模板的技術。

通常，siRNA與單鏈RNA分子結合，其中所述單鏈RNA分子包含編碼至少一種BARD1同工型的mRNA，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，該siRNA通過與正常的單鏈mRNA轉錄物結合，由此干擾BARD1同工型的翻譯并進而干擾其表達。因此，本發(fā)明的siRNA分子可以通過它們與編碼至少一種BARD1同工型的mRNA或cDNA特異性雜交的能力來定義，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。

在本發(fā)明的上下文中，siRNA的長度優(yōu)選小于500個核苷酸，優(yōu)選小于200個核苷酸，更優(yōu)選小于100個核苷酸，還更優(yōu)選小于50個核苷酸，或最優(yōu)選小于25個核苷酸。更優(yōu)選的是，siRNA的長度為約19～約25個核苷酸。為了增強siRNA的抑制活性，可以向靶序列的反義鏈的3'端添加一個或多個尿嘧啶核苷酸("u")。待添加的"u"的數量為至少2，通常為2～10，優(yōu)選為2～5。添加的"u"在siRNA的反義鏈的3'端處形成單鏈。

本發(fā)明的siRNA可以以能夠與mRNA轉錄物結合的形式直接導入細胞中。在這些實施方式中，如本領域已知，通常對本發(fā)明的siRNA分子進行修飾。其它修飾也是可行的，例如膽固醇-綴合的siRNA已經顯示出改善的藥理學性質。Song等,Nature Med.9：347-51(2003)。作為另一選擇，編碼siRNA的DNA可以攜帶在載體中。

已經鑒定出數種有用的siRNA。例如外顯子9中的siRNA(請參見圖1A和圖4E)是有效的，并引起增殖阻滯。在另一實例中，使用外顯子4內的siRNA對于BARD1同工型π是重要的(參見圖17)。一些有用的siRNA為：

K34：CATTCTGAGAGAGCCTGTG(SEQ ID NO.107)

K423：GTGCTCAGCAAGACTCATA(SEQ ID NO.108)

K401：AAGTCTCTTTACCATTGGCTG(SEQ ID NO.109)

K78：AAGTGTATGCTTGGGATTCTC(SEQ ID NO.110)

本發(fā)明還提供一種在用于治療和/或預防肺癌和結直腸癌的方法中使用的BARD1同工型的生物活性的調節(jié)劑，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。優(yōu)選的是，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1和2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-2具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。

BARD1同工型的生物活性的調節(jié)劑可以是競爭劑。優(yōu)選的是，所述競爭劑是能夠擾亂所述BARD1同工型與其受體之間的相互作用的化合物。例如，所述競爭劑還可以是抑制劑或拮抗劑。術語“抑制劑”或“拮抗劑”是指通過與蛋白或多肽結合抑制蛋白或多肽的功能的分子。諸如抑制劑或拮抗劑等競爭劑，可以直接抑制本發(fā)明的BARD1同工型與其天然配體和/或受體之間的相互作用，導致受體的生化或生物功能擾亂。競爭性抑制是其中抑制劑的結合阻止了配體的結合(反之亦然)的抑制形式。在競爭性抑制中，抑制劑與天然配體結合相同的活性位點，而無需引起反應。當抑制劑在活性位點時配體分子不能進入活性位點，并且當配體在該位點時抑制劑不能進入該位點。蛋白的“生物活性或功能”是指進行多樣性細胞功能或特異性緊密結合其它分子的能力。

同樣在本發(fā)明的上下文中，本發(fā)明的BARD1同工型的生物活性的調節(jié)劑優(yōu)選可以是調節(jié)基因表達的微RNA(miRNA)。申請人發(fā)現(xiàn)BARD1可以是許多微RNA的靶標。特異性微RNA的外源性表達抑制BARD1表達(參見圖18)。更優(yōu)選的是，在本發(fā)明的上下文中，微RNA選自包含以下微RNA的組：hsa-mir-10a MI0000266：(SEQ ID NO.111)；hsa-mir-10b MI0000267(SEQ ID NO.112)；hsa-mir-130a MI0000448(SEQ ID NO.113)；hsa-mir-130b MI0000748(SEQ ID NO.114)；hsa-mir-134 MI0000474(SEQ ID NO.115)；hsa-mir-144 MI0000460(SEQ ID NO.116)；hsa-mir-148a MI0000253(SEQ ID NO.117)；hsa-mir-148b MI0000811(SEQ ID NO.118)；hsa-mir-152 MI0000462(SEQ ID NO.119)；hsa-mir-181a-2 MI0000269(SEQ ID NO.120)；hsa-mir-181a-1 MI0000289(SEQ ID NO.121)；hsa-mir-181b-1 MI0000270(SEQ ID NO.122)；hsa-mir-181b-2 MI0000683(SEQ ID NO.123)；hsa-mir-19a MI0000073(SEQ ID NO.124)；hsa-mir-19b-1 MI0000074(SEQ ID NO.125)；hsa-mir-19b-2 MI0000075(SEQ ID NO.126)；hsa-mir-203 MI0000283(SEQ ID NO.127)；hsa-mir-301a MI0000745(SEQ ID NO.128)；hsa-mir-301b MI0005568(SEQ ID NO.129)；hsa-mir-452 MI0001733(SEQ ID NO.130)；hsa-mir-454 MI0003820(SEQ ID NO.131)；hsa-mir-517a MI0003161(SEQ ID NO.132)；hsa-mir-517c MI0003174(SEQ ID NO.133)；hsa-mir-553 MI0003558(SEQ ID NO.134)；hsa-mir-570 MI0003577(SEQ ID NO.135)；hsa-mir-576 MI0003583(SEQ ID NO.136)；hsa-mir-579 MI0003586(SEQ ID NO.137)；hsa-mir-580 MI0003587(SEQ ID NO.138)；hsa-mir-613 MI0003626(SEQ ID NO.139)；hsa-mir-618 MI0003632(SEQ ID NO.140)。

通常微RNA是短的核糖核酸(RNA)分子，具有至少約22個核苷酸，優(yōu)選約60～約100個核苷酸，其可以與靶信使RNA轉錄物(mRNA)上的互補序列結合，通常引起翻譯抑制或靶標降解和基因沉默。

本發(fā)明還包括一種將肺癌和結直腸癌與婦科癌癥區(qū)分的方法，所述方法包括檢測獲自受試對象的生物樣品中至少一種對肺癌和結直腸癌具有特異性的BARD1同工型的步驟，所述BARD1同工型選自包含以下同工型的組：

同工型π，同工型π包含SEQID NO：1、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1具有至少95％同源性的序列，和

同工型κ，同工型κ包含SEQ ID NO：2、其生物活性片段或與SEQ ID NO：2具有至少95％同源性的序列，

其中，所述對肺癌和結直腸癌具有特異性的BARD1同工型的存在是肺癌和/或結直腸癌的標志。

用于將肺癌和結直腸癌與婦科癌癥區(qū)分的另一特征是BARD1同工型α在肺癌和結直腸癌中不存在。從PCT/EP2008/053881已知BARD1同工型α的氨基酸序列。因此可選的是，所述方法還包括檢測所述樣品中BARD1同工型α、其生物活性片段或與BARD1同工型α具有至少95％同源性的序列，其中所述BARD1同工型α的不存在是所述受試對象胃未罹患肺癌和/或結直腸癌的標志。

優(yōu)選的是，婦科癌癥是女性生殖系統(tǒng)的一組不同的惡性腫瘤。最常見類型的婦科惡性腫瘤是子宮頸癌、卵巢癌和子宮內膜(子宮)癌。還存在其它較不常見的婦科惡性腫瘤，包括陰道癌、外陰癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤和輸卵管癌。在本發(fā)明的上下文中，乳癌也包括在婦科癌癥中。

本發(fā)明還提供一種用于檢測獲自受試對象的樣品中對肺癌和結直腸癌具有特異性的BARD1同工型的存在的試劑盒，所述試劑盒包含：

至少一種多核苷酸引物或探針，其中所述多核苷酸引物或探針對編碼至少一種BARD1同工型的多核苷酸具有特異性，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段和/或與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，和/或

至少一種選自包含SEQ ID NO：13～80的組中的肽。

優(yōu)選的是，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-22、其生物活性片段或與SEQ ID NO：1-2具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列。

編碼至少一種BARD1同工型的多核苷酸是包含以下核酸序列的多核苷酸：選自包含SEQ ID NO：8(同工型π)、SEQ ID NO：9(同工型κ)、SEQ ID NO：10(同工型β)、SEQ ID NO：11(同工型δ)、SEQ ID NO：12(同工型γ)、SEQ ID NO：141(同工型π’)、SEQ ID NO：142(同工型β’)的組中的核酸序列；優(yōu)選的是選自包含SEQ ID NO：8和9的組中的核酸序列。

引物、探針和/或抗體可以以試劑盒的形式與其它需要的檢測試劑一起包裝。例如，它們可以包裝在分開的容器中，例如核酸或抗體(與固體基質結合或者與用于將它們結合至所述基質的試劑分開包裝)、對照試劑(陽性和/或陰性)和/或可檢測標記。試劑盒中還可以包括用于進行所述檢測的說明(例如，書面形式、磁帶、VCR、CD-ROM等)。

本發(fā)明還包括疫苗和免疫方法。例如，治療或預防罹患肺癌和/或結直腸癌的受試對象中的肺癌和/或結直腸癌的方法可以包括對受試對象施用疫苗組合物，所述組合物包含：

一種或多種BARD1同工型或其免疫活性片段，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-7、105-106、其生物活性片段、與SEQ ID NO：1-7、105-106具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，

或一種或多種選自包含SEQ ID NO：13～80的組中的肽(抗原)。

優(yōu)選的是，所述BARD1同工型包含選自包含SEQ ID NO：1-2、其生物活性片段、與SEQ ID NO：1-2具有至少95％同源性的序列的組中的氨基酸序列，并且所述肽選自包含SEQ ID NO：16、17、18、23、59-67、68、69、74、75、76-80的組中。

在本發(fā)明的上下文中，免疫活性片段是長度上比天然存在的全長蛋白短的多肽，例如BARD1同工型之一，其誘導與全長蛋白所誘導的免疫應答類似的免疫應答。例如，免疫活性片段應該在長度上為至少8個殘基，并且能夠刺激免疫細胞，例如T細胞或B細胞。免疫細胞刺激可以通過檢測細胞增殖、細胞因子(例如IL-2)的詳情或抗體的產生來檢測。參見，例如Harlow和Lane,Using Antibodies：A Laboratory Manual,1998,Cold Spring Harbor Laboratory Press；和Coligan,等,Current Protocols in Immunology,1991-2006,John Wiley&Sons。

本發(fā)明還包括一種用于治療或預防罹患肺癌和/或結直腸癌的受試對象中的肺癌和/或結直腸癌的藥物組合物，其中所述組合物包含藥學上有效量的本發(fā)明的抗體。

本發(fā)明還包括一種用于治療或預防罹患肺癌和/或結直腸癌的受試對象中的肺癌和/或結直腸癌的藥物組合物，其中所述組合物包含藥學上有效量的本發(fā)明的siRNA。

本發(fā)明還包括一種用于治療或預防罹患肺癌和/或結直腸癌的受試對象中的肺癌和/或結直腸癌的藥物組合物，其中所述組合物包含藥學上有效量的本發(fā)明的調節(jié)劑。優(yōu)選的是，所述調節(jié)劑是微RNA，其調節(jié)基因表達。

“治療”是指治療性治療和預防性或防止性措施。需要治療的對象包括已經罹患疾病，如肺癌和/或結直腸癌的對象，以及要預防所述疾病的對象。因此，本文要治療的哺乳動物，優(yōu)選人類可以已經診斷為具有所述疾病或可以傾向于患有有所述疾病或對所述疾病易感，所述疾病例如肺癌和/或結直腸癌。

如本文所用的“預防”是指施用本發(fā)明所述的調節(jié)劑、siRNA和/或抗體從而減少對肺癌和/或結直腸癌有高風險的受試對象將來確實發(fā)展成所述癌癥的可能性或概率。

“藥學有效量”是指當對人類或動物生物體施用時活性成分(例如化學或生物材料)誘導可檢測的藥理學和/或生理學效應。

各藥學有效量可以取決于待治療的具體受試對象、取決于待治療的疾病和取決于施用方法。治療通常包括多次施用藥物組合物，通常間隔為數小時、數天或數周。諸如抗體、siRNA或調節(jié)劑等本發(fā)明的活性成分的劑量單位的藥學有效量，通常為0.001ng～100mg每千克待治療受試對象的體重。應該理解，本發(fā)明活性成分的合適劑量將取決于接受者的年齡、性別、健康和體重、同時存在的治療的種類(如果有的話)和所期望效果的性質。

對于全身施用，治療有效量或劑量可以最初由體外檢驗評估。例如，可以在動物模型中配制藥劑以達到包括如細胞培養(yǎng)所確定的IC50在內的循環(huán)濃度范圍。此類信息可用于更準確地確定人類中的有用劑量。

初始劑量還可以使用本領域公知的技術從體內數據(例如動物模型)評估。本領域普通技術人員能夠基于動物數據容易地對對人類的施用進行優(yōu)化，并且當然會取決于待治療的受試對象、取決于受試對象體重、疾病嚴重性、施用方式和處方醫(yī)師的判斷。

在用于本發(fā)明時，“施用”是指將藥物組合物與受試對象，優(yōu)選人類接觸。

可以將藥物組合物溶解于或分散于本領域技術人員公知的藥學上可接受的載體中，以用于進行胃腸外施用，例如通過靜脈內注射、皮下注射或肌肉內注射或通過靜脈內滴注進行胃腸外施用。

對于胃腸外施用的藥物組合物，可以使用任何常規(guī)添加劑，例如賦形劑、佐劑、粘合劑、崩解劑、分散劑、潤滑劑、稀釋劑、吸收增強劑、緩沖劑、表面活性劑、加溶劑、防腐劑、乳化劑、等滲劑、穩(wěn)定劑、注射用增溶劑、pH調節(jié)劑等。

藥學上可以使用的有助于將活性化合物加工至制劑的可接受的載體、稀釋劑和佐劑在所用的劑量和濃度時對接受者是無毒的，并且包括緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六烴季銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、鄰丁基芐基醇(butyl orbenzyl alcohol)；烷基對羥基苯甲酸酯，例如甲基對羥基苯甲酸酯或丙基對羥基苯甲酸酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(小于約10個殘基)的多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反荷離子(counter-ion)，例如鈉；金屬復合物(例如，Zn-蛋白復合物)；和/或非離子表面活性劑，例如或聚乙二醇(PEG)。

藥物組合物的施用形式可以是全身的或局部的。例如，此類藥物組合物的施用可以是各種胃腸外途徑，例如皮下、靜脈內、皮內、肌肉內、腹膜內、鼻內、透皮、口腔途徑或經由植入裝置，并且還可以通過蠕動裝置遞送。

還可以將包含本發(fā)明的活性成分的藥物組合物引入或浸漬到生物可吸收的基質中，所述基質以基質懸浮液、凝膠或固體載體的形式施用。此外，基質還可以由生物聚合物組成。

可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適實例包括含有抗體的固體疏水性聚合物的半滲透性基質，該基質為成型制品，例如膜或微膠囊的形式。緩釋基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(甲基丙烯酸2-羥基乙基酯)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L-谷氨酸和[γ]乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、諸如LUPRON DEPOT(TM)(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)等降解性乳酸-乙醇酸共聚物和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。

用于體內施用的制劑必須是無菌的。這容易地實現(xiàn)，例如通過無菌過濾膜進行過濾而實現(xiàn)。

本領域技術人員會意識到，本文描述的本發(fā)明容易進行除具體所述的那些之外的改變或變型。應該理解，本發(fā)明包括所有此類改變或變型而無需背離其精神或基本特征。本發(fā)明還包括說明書中指出或指明的所有步驟、特征、組合物和化合物，無論是單獨的還是全體的，以及所述步驟或特征的任意兩種以上的任何組合和所有組合。因此認為本公開內容是所列舉的所有方面，而不是限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求指明，并且在等效含義和范圍內的所有變化都意圖包括在內。

參照以下實施例會更全面地理解以上描述內容。但是，此類實施例是實施本發(fā)明的方法的示例，而不是意圖限制本發(fā)明的范圍。

實施例

I-患者–肺癌

在兩個中心收集來自100個NSCLC患者的腫瘤組織(表1)。所有患者都從當地倫理委員會獲得知情同意。使用8個具有良性肺疾病的病例(5名男性和3名女性，年齡從24～66歲(中值年齡，38歲))；5個肺氣腫病例，剩下的是肺結核和類癌發(fā)育異常(carcinoid dysplasia))作為BARD1表達的對照樣品。

從Napoli獲得60名病人中48名的隨訪記錄，隨訪從1個月～69個月；圍手術期中兩名患者死亡，并且有10名患者未獲得數據。48名具有隨訪記錄的患者中，僅17名通過外科手術治療，4名在外科手術后用化療治療，一名在外科手術后用化療和放療治療，7名患者用化療和放療治療，4名僅用化療治療，1名僅用放療治療，剩下的14名至最后一次隨訪或死亡為止未進行治療。這48名患者中，35名死亡，13名在最后一次隨訪期間仍然存活。

來自Cagliari的40名患者中的17名有隨訪記錄；隨訪從5個月～95個月；11名患者在最后一次隨訪期間(2010年3月)仍然存活，并且6名患者死亡。從外科手術、開始化療或放療之日，或者未進行治療的患者的診斷之日起至最后一次隨訪或死亡為止計算總存活。

表1.患者特征–肺癌

患者特征–結直腸癌

基于WHO標準由有經驗的病理學家進行病理學診斷，并根據美國癌癥分期聯(lián)合委員會進行分期。所有患者都知情和依從，并獲得當地倫理委員會的批準。

檢查了總共168個具有結直腸癌的病例，包含20個來自Cagliari的病例和148個來自德國的病例(表2)。將來自Cagliari的20個病例(包括腫瘤組織樣品和它們周圍的形態(tài)學正常的組織(腫瘤周圍)樣品)用于逆轉錄酶PCR檢測。將來自德國的148個具有結直腸癌的病例用于組織陣列的免疫組織化學分析。這168個病例由106個結腸癌和62個直腸癌組成，它們都是腺癌?；颊呤?3名男性和75名女性，診斷時的年齡為33歲～78歲(中值年齡，61歲)。21名患者具有I期疾病，34名具有II期，50名具有III期，23名具有IV期；剩余的40名患者為未知的分期，因為不能對原發(fā)腫瘤或/和區(qū)域性淋巴結或/和遠端轉移進行評估。10名患者具有良好分化(G1)的腫瘤，116名具有中等分化(G2)的腫瘤，38名具有不良分化(G3)的腫瘤；剩余的2名患者未分級(GX)。

用于免疫化學染色的切片是組織微陣列，每個病例一式四份。148個病例中的75個具有隨訪記錄，隨訪從1個月～72個月，并且剩余的73名患者沒有存活數據。具有隨訪記錄的這75名患者中，22名死亡，48名失蹤，5名在最后一次隨訪期仍存活。

表2.結直腸癌的患者特征

免疫組織化學

用針對BARD1的不同區(qū)的抗體和針對BRCA1的抗體對相鄰的切片進行免疫組織化學分析。

針對所用BARD1的不同區(qū)(即N19(外顯子1)(sc-7373)和C20(外顯子11)(sc-7372))的抗體購自Santa Cruz(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)，如之前所述生產和應用PVC(外顯子3)和WSF(外顯子4的開始部分)(Irminger-Finger I等,Mol Cell 8：1255-66,2001；Feki A等,Oncogene 24：3726-36,2005；Hayami R等,Cancer Res 65：6-10,2005；Li L等,Int J Biochem Cell Biol 39：1659-72,2007；Redente EF等,Anticancer Res 29：5095-101,2009；Fabbro M等,J Biol Chem 277：21315-24,2002)。針對BRCA1的抗體來自Santa Cruz(D16；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)。通過使用綴合有HRP的第二抗體(山羊抗兔或兔抗山羊)，以1：100稀釋液在室溫下應用1小時，將染色可視化。DAB染色在室溫下進行2分鐘～15分鐘。在脫水和封片之前用蘇木精對載玻片進行復染色。為了確定靈敏度和特異性，進行免疫組織化學分析，省去對照切片上的第一抗體。為了將BARD1或BRCA1的表達定量，對于每個腫瘤切片選擇4個不同的區(qū)；將陽性細胞百分比和染色強度組合來計算各樣品的平均分數。三個無任何臨床數據知識的人獨立地進行該定量。

對于在具有誘導的肺癌的小鼠上進行的免疫組織化學分析，在16、24和32周后處死經治療的小鼠和年齡匹配的未經治療的小鼠，并且通過使用抗體PVC、WFS和C20的免疫組織化學分析對兩只對照小鼠和三只荷瘤小鼠進行腫瘤解剖和分析。如對人類樣品所述那樣進行分析和定量。

將福爾馬林固定并且石蠟包埋的5μm組織切片在二甲苯中脫石蠟，并通過濃度遞減的乙醇(100％醇、95％醇、70％醇、dH2O)進行復水。在微波中使切片沸騰5分鐘以進行抗原修復，并且內源性過氧化物酶被封閉。在將非特異性表位進行BSA(牛血清白蛋白)封閉后用第一抗體將載玻片在加濕室中在4℃溫育過夜。用于BARD1檢測的第一抗體是N19(sc-7373,Santa Cruz Biotechnology)(1：25稀釋)、PVC(1：100稀釋)、WFS(1：100稀釋)和C20(sc-7372,Santa Cruz,CA)(1：20稀釋)，它們分別識別外顯子1、3、4和11中的表位；BRCA1抗體是C20(sc-642,Santa Cruz Biotechnology)(1：100稀釋)，識別BRCA1 C-端表位。將綴合有辣根過氧化物酶(HRP)的第二抗體(山羊抗兔或兔抗山羊)在室溫下以1：100的稀釋液應用1小時。然后在室溫下使二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色進行最大15分鐘。在脫水和封片之前用蘇木精對載玻片復染色。為了確定靈敏度和特異性，進行免疫組織化學分析，省去對照切片上的第一抗體。

半定量地測量BARD1和BRCA1的表達水平。使用染色腫瘤細胞的強度和百分比對染色進行評分。染色強度和陽性細胞百分比的值相乘以獲得最終的染色分數。各抗體的總染色分數為0～100，25以下的染色分數是明確的陰性染色(“-”)，大于25是明確的陽性染色(“+”)，并且根據總染色分數大于25～50、大于50～75和大于75來區(qū)分為“+”、“++”和“+++”。對于統(tǒng)計學分析，僅考慮陽性情況和陰性情況，除了使用染色分數的不同抗體染色的相關性之外。對于各腫瘤切片選擇了4個不同的區(qū)，并由不具有臨床數據知識的三名觀察者(Y,Z；L,L和J,W)獨立地評分。

RNA/RT-PCR分析

進行RT-PCR以定量地確定不同同工型的表達和研究其結構。使用Trizol試劑從冷凍組織切片中分離RNA。添加氯仿(0.1ml)并在4℃在14,000g將樣品離心15分鐘以分離各相。將水相轉移到不含RNA酶的Eppendorf管，加入等體積的異丙醇以進行RNA沉淀。用75％的乙醇洗滌RNA球團，并將其溶解在20μl不含RNA酶的水中。測定濃度從而確定D260/D280比為至少1.8。

對于逆轉錄，在21μl含有1μl dNTPs(10mM)、1μl寡dT、2μl DTT(0.1M)、4μl第一標準緩沖液和1μl Superscript II的逆轉錄酶緩沖液中使用1μg的RNA。在65℃反應5分鐘，然后在42℃反應2分鐘，在42℃反應50分鐘，并在70℃反應15分鐘。使用2μl cDNA作為使用不同引物的PCR的模板。

使用引物5’-ACAAGCGCCAGAGAGATGAT-3’(SEQ ID NO：81)和5’-GATGTGGGAGAGGATGAGGA-3’(SEQ ID NO：82)采用56℃的退火溫度和1分鐘的延伸時間將雌激素受體α(ERα)擴增。使用引物5’-AGCCACATCGCTCAGACACC-3’(SEQ ID NO：83)和5’-GTATCTAGCGCCAGCATCG-3’(SEQ ID NO：84)將甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)擴增作為內部對照。在含有0.1μg/ml溴化乙錠(EtBr)的瓊脂糖/TBE凝膠(對于FL為0.8％，對于其它為1％)上使用相同體積的PCR產物，以分析相同大小片段的BARD1(對于外顯子1-11為20μl，對于外顯子1-4為10μl，對于其它為5μl)并在紫外光下可視化。

在補充有溴化乙錠的1％瓊脂糖/TAE凝膠上對PCR產物(10μl)進行分析并在紫外光下使其可視化。對于引物和條件的完整列表請參見表3。

將QIAEX II試劑盒(Qiagen,Hombrechtikon,瑞士)用于DNA純化。用內部BARD1引物進行測序。

PCR的圖像分析

通過ImageJ，基于Java的圖像處理軟件(National Institutes of Health,http：//rsbweb.nih.gov/ij/)處理圖像。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用溴化乙錠染色來可視化并拍照。在轉化成分析用灰度之前將圖像保存為JPG文件。在ImageJ中打開圖像，在測量前對于各圖像將校準功能設定為未校準的OD。使用矩形工具來畫出區(qū)域以測定相同尺寸的PCR帶?；谡{整矩形的面積，使用在樣品中與目的帶尺寸接近的DNA梯度中相同尺寸的帶來在不同凝膠中獲得相對精確的值。勾畫出(outlined)峰的面積。將作為曲線下總面積的百分比的峰面積比例用于統(tǒng)計分析。

總RNA提取、逆轉錄和PCR

進行RT-PCR以定量地顯示不同同工型的表達和以確定其結構。根據RNA分離規(guī)程使用Trizol試劑從冷凍組織切片分離RNA。添加氯仿(0.1ml)并在4℃在14,000g將樣品離心15分鐘以分離各相。將水相轉移到不含RNA酶的Eppendorf管，加入等體積的異丙醇以進行RNA沉淀。用75％的乙醇洗滌RNA球團，并將其溶解在20μl不含RNA酶的水中。測定濃度從而確定D260/D280比為至少1.8。

對于逆轉錄，以含有M-MLV RT 5x反應緩沖液5μl、2μl寡dT(500μg/ml)、1.5μl 10mM dNTP’s、Recombinant RNasin核糖核酸酶抑制劑1μl(25u/μl)和1μl的M-MLV逆轉錄酶(200u/μl)的25μl終體積使用1.5μg的RNA。溫育反應：在70℃下5分鐘，然后42℃下60分鐘，和70℃下10分鐘。使用3μl cDNA作為FL BARD1擴增用模板，將2μl cDNA用于BARD1的各種片段的擴增。以50μl的終體積利用Taq聚合酶進行PCR。對于所有PCR反應，起始變性(94℃，2分鐘)和最終延伸(72℃，10分鐘)都相同。根據不同引物和預期的BARD1產物的長度，退火溫度和延伸時間是可變的(表3)。

使用引物5’-ACAAGCGCCAGAGAGATGAT-3’(SEQ ID NO：81)和5’-GATGTGGGAGAGGATGAGGA-3’(SEQ ID NO：82)采用56℃的退火溫度和1分鐘的延伸時間將雌激素受體α(ERα)擴增。使用引物5’-AGCCACATCGCTCAGACACC-3’(SEQ ID NO：83)和5’-GTATCTAGCGCCAGCATCG-3’(SEQ ID NO：84)將甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)擴增作為內部對照。將相同體積的PCR產物加載到在含有0.1μg/ml溴化乙錠(EtBr)的瓊脂糖/TBE凝膠(對于FL為0.8％，對于其它為1％)上，以在紫外光下將BARD1的片段(對于外顯子1-11為20μl，對于外顯子1-4為10μl，對于其它為5μl)可視化。

根據制造商說明使用QIAEX II試劑盒(Qiagen,Hombrechtikon,瑞士)進行RT-PCR產物的DNA純化，然后使用用于PCR的正向引物和反向引物或片段內的其它引物(如果未產生重疊序列)進行測序。

小鼠模型

如Redente EF,Dwyer-Nield LD,Barrett BS,等(Lung tumor growth is stimulated in IFN-gamma-/-mice and inhibited in IL-4Ralpha-/-mice，Anticancer Res 29：5095-101,2009)所述在BALB/c小鼠中化學誘導肺腫瘤。用1mg尿烷每克體重對6周～8周齡的雄性小鼠進行腹膜內注射，每周一次，連續(xù)7周。處理后16、24和32周處死小鼠。解剖肺組織和腫瘤，并進行處理以用于免疫化學分析。每個時間點分析來自3只小鼠的組織。

統(tǒng)計分析

施用斯皮爾曼相關系數ρ來評估BARD1的表達水平和BRCA1表位之間的相關性。使用χ2檢驗來比較腫瘤組織和腫瘤周圍組織中陽性例的百分比和BARD1表達的陽性例與臨床變量的相關性。采用T檢驗來測定BARD1表達水平與臨床變量的相關性。對于與存活的關聯(lián)，將患者根據其BARD1表達水平進一步分為兩個組。使用Kaplan–Meier法來評估存活差異，并通過對數秩檢驗來進行比較。對于所有計算，檢驗是雙向的，并且認為P<0.05的值具有統(tǒng)計學顯著性。使用Statistical Package for the Social Sciences(SPSS)for Windows version 13(SPSS Inc,Chicago,IL)進行分析。

II-結果

對腫瘤切片進行免疫組織化學分析，包括來自100個患者的不同類型、級別和階段(表1)。使用識別BARD1的4個不同表位(定位到外顯子1、3、4和11)的抗體，理論上其可以產生16種不同的染色模式。令人驚奇的是，僅觀察到少數不同的模式，并且在多數腫瘤中觀察到針對所有4種抗體的染色(圖1A-E)。相鄰切片的染色顯示，不同表位在腫瘤切片的不同區(qū)中和在不同的亞細胞區(qū)室中表達(圖1B-D)，表明BARD1的不同同工型在單個的腫瘤中表達。通常，BARD1-N19(外顯子1)和C20(外顯子11)顯示細胞質顆粒狀染色，并且共定位于腫瘤的相同區(qū)。BARD1 PVC(外顯子3)和WFS(外顯子4)免疫染色是彌漫性的并且位于細胞質中。染色的強度和細胞內定位的這些差異表明，所有4種表位的表達不反映野生型BARD1的表達，而是不同同工型的同時表達。

N19和C20的表達水平彼此強相關，與PVC和WFS的情況一樣(圖1F)，但其它抗體染色模式不相關。因此可以總結出N端和C端截短形式、以及具有內部缺失的形式在NSCLC中表達。具體而言，WFS(外顯子4的5’末端)染色在許多肺癌中上調，與卵巢癌所觀察到的表位表達模式(WFS染色稀少)相反。

研究了相鄰組織切片中BRCA1和BARD1的共表達(圖1B-D)。BRCA1在66.7％的NSCLC樣品中表達，但其不與任何BARD1表位的表達相關。由于BRCA1不與BARD1共表達，這些數據表明BRCA1-BARD1異二聚體的功能在NSCLC中喪失。

觀察到腫瘤組織和腫瘤周圍組織中的BARD1表達，不過在腫瘤中上升的更多(圖2A；圖5)。在來自女性患者的腫瘤中的表達通常比來自男性患者的腫瘤中表達更高(圖2B)。

特異性BARD1表位的表達在腺癌中比在非腺癌(包括鱗狀細胞癌和大細胞癌)中頻率低(圖2C)。但是，未發(fā)現(xiàn)抗體染色與腫瘤級別和階段的相關性(數據未示出)。

還對在具有隨訪數據的65名患者中BARD1表達的各個表位和表達模式以及無病存活(DFS)和總存活(OS)進行了評價。具有單獨PVC和WFS陽性染色的患者比陰性染色的患者具有顯著更短的DFS和更短的OS。更重要的是，具有PVC和WFS同時陽性染色模式的患者與具有不同組合的患者相比顯示出非常短的存活。在N19、C20和其它染色模式與DFS或OS之間未觀察到相關性。

進行采用Cox的比例危險度模型的單變量分析和多變量分析，以評價所分析的標志物是否具有獨立的預后意義。在單變量分析中，病理學階段也顯示了DFS和OS的預測(表5)。將病理學階段和另兩種可能的預后因素，組織類型和患者性別，輸入多變量模型中。該后一種分析表明，單獨的PVC和WFS陽性染色、PVC和WFS同時陽性染色模式、以及病理學階段對于DFS和OS都保留了獨立的預后意義(表5)。

在本發(fā)明的另一實例中，顯示了BARD1同工型與肺癌的起始和發(fā)展的相關性，其中監(jiān)視在經實驗誘導的肺癌中的BARD1表達。將尿烷多次注射到BALB/c小鼠中誘導原發(fā)性肺腫瘤，并發(fā)展到腺癌。該處理引起在16周引起肉眼可見的腫瘤，它們在24周變大，并在32周后侵入正常鄰近組織。選擇所有階段的正常組織和腫瘤區(qū)，并對抗體染色進行評分(圖3)。PVC和WFS的表達始終較弱，而C20在對照動物中始終較強。該模式在16周腫瘤中類似。但是，在24周腫瘤中，PVC和WFS的表達與C20相比增加，并且在32周腫瘤中較大地上調。這些實驗證明在腫瘤發(fā)生的不同階段BARD1表達模式發(fā)生變化，并且表明定位到外顯子3和4的BARD1表位參與腫瘤促進和向侵襲性階段的發(fā)展。

使用可擴增來自10名女性患者和10名男性患者的樣品的完整BARD1編碼區(qū)的引物，通過RT-PCR來確定NSCLC中表達的不同同工型的結構。從腫瘤組織和從正常腫瘤周圍組織中提取RNA。從具有良性呼吸道疾病的患者獲得正常肺對照組織。BARD1的表達在正常肺中不存在或非常低；通過RT-PCR(圖4A)和通過免疫組織化學分析(數據未示出)發(fā)現(xiàn)對照中BARD1僅弱表達。來自NSCLC患者的RT-PCR顯示了在多數腫瘤和腫瘤周圍樣品中FL BARD1及其數種不同的同工型的表達。在多數情況下，F(xiàn)L BARD1和同工型的特異性表達模式在正常腫瘤周圍組織和腫瘤組織中是相同的(圖4B)。

為了區(qū)分相同分子量的同工型，使用擴增外顯子1和4，或1和6的引物進行RT-PCR。發(fā)現(xiàn)除了FL BARD1之外，已知的同工型β而不是α(WO 2008/119802)的表達，以及另外兩個新型同工型κ和π的表達(圖4B、C、E、圖6和圖7)。

對女性和男性病例中通過RT-PCR獲得的同工型的表達進行定量。FL和同工型在腫瘤組織和腫瘤周圍組織中都類似地表達，與BARD1同工型在蛋白水平上的顯著上調相反(圖1A和圖5)。與女性相比，在男性中同工型BARD1β和κ的表達顯著上調(P<0.05)；而與男性相比，在女性中同工型BARD1η、BARD1γ和BARD1ε的表達上調(圖7)。

在本發(fā)明的另一實例中，在來自女性和男性的所有肺組織中，無論正常組織還是腫瘤周圍組織中都發(fā)現(xiàn)了ERα表達(圖4D)，這表明BARD1同工型可能與NSCLC中的雌激素信號傳導相關。

III-結果

通過對腫瘤切片進行IHC來對結直腸癌中的BARD1表達進行研究，所述腫瘤切片來自結直腸癌的148個石蠟包埋組織樣品，表現(xiàn)為組織微陣列，每例一式四份。IHC檢驗后145例對于分析是合格的，在該研究中對它們進行分析。使用針對BARD1的不同區(qū)(分別是外顯子1、外顯子3、外顯子4和外顯子11)的4種抗體(N19、PVC、WFS和C20)來區(qū)分位于相鄰組織切片上的不同BARD1表位(圖1A)。還使用針對BRCA1的C端表位的BRCA1 C20抗體研究BRCA1表達。

在結直腸癌中四種抗體的每一種的陽性染色是可變的(圖9A)。分別在結直腸癌的36(24.8％)、122(84.1％)、129(89％)和61(42.1％)個病例中，將BARD1 N19、PVC、WFS和C20染色歸類為陽性。觀察到142個病例具有至少一種抗體陽性染色，僅在3個病例中未發(fā)現(xiàn)BARD1的表達(圖9B)。換言之，97.9％(145中的142例)的結直腸癌病例表達BARD1的至少一種表位。

雖然原則上對于表達4種表位可能有16種不同的組合，但僅發(fā)現(xiàn)3種主要組合(圖9B)。結直腸癌中這3種BARD1表達模式包括：僅有中間表位的表達是最常見的(38.6％)(圖2B、D)，針對所有4種抗體的染色其次(18.6％)(圖8B、C、E)，N-端表位的喪失是第三常見的觀察到的表達模式(17.9％)(圖8B、F)。

與NSCLC組織中的BARD1表達類似，發(fā)現(xiàn)所有4種抗體染色是細胞質的，但位于不同的區(qū)域。BARD1 N19和C20顯示出顆粒狀染色，而PVC和WFS顯示出彌漫性染色，它們分別共定位于相同的細胞或相同的區(qū)域(圖8C-F)。為了對此進一步研究，將用各抗體獲得的表達模式定量并比較結果。在N19和C20的表達水平之間觀察到強相關性(ρ＝0.71；P＝0.000)。其它比較，例如PVC和WFS(ρ＝0.39；P＝0.000)，PVC和C20(ρ＝0.36；P＝0.000)，以及WFS和C20(ρ＝0.27；P＝0.001)顯示了弱相關性。在N19和PVC，以及N19和WFS染色之間未發(fā)現(xiàn)相關性(圖10A)。

從不同的表位的表達水平、細胞內定位、使用不同抗體的染色強度、不同BARD1表位的相關或不相關的表達、以及使用針對不同BARD1表位的4種抗體的表達模式可以推斷出，N端和C端截短形式、N端失去的形式、以及含有與本研究中所用抗體具有反應性的4種表位的形式，在結直腸癌中表達。

IV-BARD1和BRCA1的非協(xié)調表達

與BARD1不同，BRCA1染色在同一細胞內顯示出細胞質和細胞核顆粒狀染色(圖8C)。在22.1％(145中的32例)的結直腸癌病例中觀察到BRCA1陽性染色，而在24.8％(145中的36例)的病例中觀察到N19陽性染色。令人感興趣的是，為N19陽性的61個病例中僅7個也是BRCA1陽性。此外，在BARD1表達的不同表位和BRCA1表達之間未發(fā)現(xiàn)相關性(圖10B)。這些結果證明，在結直腸癌中BRCA1表達不與BARD1協(xié)調一致。

V-BARD1蛋白表達與臨床病理學特征和患者預后的相關性

N19陽性染色的頻率與女性性別顯著相關(P＝0.014)(圖11A)，這與在NSCLC中BARD1 N19在女性比在男性中過多表達的結果一致(圖2a-B)。BARD1的不同表位表達和BRCA1表達與任何其它臨床病理學變量，例如腫瘤級別、原發(fā)腫瘤、淋巴結和遠端轉移狀態(tài)以及腫瘤階段都不相關(圖4B-F)。此外，在不同表達模式和臨床病理學變量之間未獲得顯著相關(數據未示出)。

還在75個具有隨訪數據的結直腸癌病例中通過將不同BARD1表達模式(圖9B)以及BRCA1和BARD1的單獨4種表位的表達與存活進行比較來評估BARD1和BRCA1表達與存活的相關性。據發(fā)現(xiàn)(表6)，與陰性染色的患者相比，具有BARD1 N19陽性染色的患者具有較高的1年、2年和3年存活率，具有C20陽性染色的患者具有較高的1年和3年存活率。從BARD1 PVC和WFS(陰性染色案例不足以進一步分析)、BRCA1陽性染色和陰性染色與存活之間的比較得出沒有差異。

當將表達模式用來比較時(表7)發(fā)現(xiàn)，與組中僅中間表位表達的表達模式和其它表達模式相比，所有4種抗體陽性染色的表達模式與較高的1年、2年和3年存活率相關。但是，與組中的其它表達模式相比，以及與所有4種抗體陽性染色模式相比，僅中間表位表達的表達模式(用PVC和WFS檢測)與較低的1年、2年和3年存活率相關。在組中，在失去N端表位的表達模式和其它表達模式(包括所有4種抗體陽性染色模式的表達模式(除1年存活率外))、僅中間表位表達的表達模式和所有其它表達模式之間，未發(fā)現(xiàn)相關性。

總之可以概括出在結直腸癌中，所有4種陽性染色模式的BARD1表達模式以及BARD1的N端表位的表達是正面的預后因素；相反地，僅中間的兩種表位同時表達是負面的預后因素，但它們單獨的表位表達則不是。

VI-結直腸癌中表達的BARD1同工型的結構

在20個腫瘤組織和腫瘤周圍組織(包括10名男性和10名女性病例)中，通過RT-PCR評估BARD1 mRNA表達水平。從冷凍組織切片提取RNA。使用外顯子1中的正向引物以及外顯子11和外顯子4中的反向引物進行RT-PCR，以擴增BARD1編碼區(qū)(外顯子1～外顯子11，和外顯子1～外顯子4)，擴增GAPDH作為對照。同時，如NSCLC中所做一樣，從該系列的樣品還擴增ERα(圖11A)。

與NSCLC中不同，BARD1 mRNA表達模式在結直腸的腫瘤組織和腫瘤周圍組織中相當不同。FL BARD1和同工型在多數腫瘤樣品(90％，20個病例中的18個)中頻繁地表達，但是在腫瘤周圍組織中，沒有BARD1的表達是頻繁的(65％，20個病例中的13個)，7個病例(35％)僅表達FL BARD1和/或較少的同工型。這具有統(tǒng)計學顯著性(P＝0.0003)。該類似的結果在男性(分別為8/10和4/10)(P＝0.0679)中和在女性(分別為10/10和3/10)(P＝0.0010)中也觀察到(圖12A)。在NSCLC組織中表達的所有BARD1同工型，包括具有外顯子3的缺失的新型同工型κ和具有在外顯子4的3’端內的408bp的缺失的新型同工型π，也在結直腸癌組織中表達。為強調起見，F(xiàn)L BARD1和所有BARD1同工型在腫瘤組織中頻繁表達，但在腫瘤周圍組織中表達較少或不表達(對于所有都P<0.05)(圖12B)。

VII–在來自男性和女性的組織中觀察到的相似BARD1表達模式

BARD1同工型β和κ在來自男性的肺組織中顯著上調，同工型η、γ和ε在來自女性的肺組織中高度表達。與肺組織不同，F(xiàn)L BARD1和同工型表達的頻率在來自男性和女性的結直腸組織中，包括在腫瘤周圍組織(對于所有都P>0.05)(圖12C)和腫瘤組織(對于所有都P>0.05)(圖12D)中類似。

在一系列樣品的結直腸組織中，包括男性和女性的腫瘤周圍組織和腫瘤組織中，未發(fā)現(xiàn)ERα表達。該結果能夠至少部分地解釋：與肺組織中的BARD1表達相比，在結直腸組織中BARD1表達與男性和女性沒有相關性。

VIII-BARD1同工型表達與臨床變量的相關性

據發(fā)現(xiàn)FL BARD1和BARD1同工型在年齡超過60歲的患者中比年齡在60以下的患者中表達更頻繁。具體而言，BARD1同工型δ和π表達的頻率與老年患者顯著相關(P<0.01)(圖13A)。此外，BARD1同工型κ表達在頻率上與較大的腫瘤尺寸或相鄰的腫瘤侵入(T3和T4)(P＝0.0098)、淋巴結累及(N1和N2)(P＝0.0422)和晚期(III期和IV期)(P＝0.0422)顯著相關(圖6B-D)。在BARD1表達和腫瘤組織病理學級別之間未觀察到相關性(圖13E)。

IX–肺癌患者血液中抗-BARD1自身免疫抗體的檢測

方法

使用本發(fā)明的抗原(BARD1肽)基于免疫吸附檢驗開發(fā)了測試，以用于捕獲肺癌患者血液中的自身免疫抗體。用于所進行的測試的方法是改進的標準ELISA抗體捕獲測試。具體而言應用以下方案：

-用于PBS中稀釋的BARD1肽[10微克/ml]包被微量滴定板(96孔)并在4℃溫育過夜。

-用封閉劑(例如5％BSA)代替磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)，在室溫于攪動下將孔封閉1小時。

-向孔中添加稀釋于含1％封閉劑的PBS中的患者血清和對照，并在室溫于攪動下進行溫育2小時。

-用PBS將孔沖洗3次。

-向孔中添加稀釋于PBS和1％封閉劑中的與HRP或Sulfo-Tag或等效的檢測試劑偶聯(lián)的抗人的第二抗體，并在室溫于攪動下溫育1小時。

-用PBS將孔洗滌3次。

-通過添加HRP底物或用于等效檢測方法的底物而進行讀出，立即測量反應。

測試

對來自肺癌患者的血清樣品和對來自健康血液供體的對照樣品進行以下抗原(肽)測試：SEQ ID NO：46、33、48、20、50、19、22、16、32、26。