本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定量測(cè)定生物樣品中白蛋白含量的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人血漿白蛋白是血漿中含量最豐富的蛋白，約占到血漿中蛋白總量的50–60％【Biochem.Pharmacol.2005,70，1673】。人白蛋白是由肝臟合成的非糖基化單鏈蛋白，血液中濃度可以達(dá)到35-55mg/mL。人血清白蛋白在維持人體健康中發(fā)揮著不可替代的重要作用，其不僅能維持血液正常的滲透壓，還肩負(fù)運(yùn)輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多藥物分子的重任，同時(shí)還具有抗氧化、清除毒物等作用【Nat.Struct.Biol.1998,5,827】。白蛋白的多個(gè)位點(diǎn)可結(jié)合各類內(nèi)源性及外源性物質(zhì)，從而影響上述物質(zhì)在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)及處置。多種疾病，比如肝病(尤其是肝硬化)、腎病綜合癥、腫瘤、蛋白丟失性腸病、燒傷以及營(yíng)養(yǎng)不良等會(huì)導(dǎo)致血清白蛋白的水平下降，而高蛋白飲食以及慢性脫水則會(huì)造成白蛋白水平升高。因此人血中白蛋白含量的定量測(cè)定已作為臨床常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目并被廣泛用于多種疾病的輔助診斷。大量臨床實(shí)踐已證實(shí)，監(jiān)測(cè)血中白蛋白水平對(duì)于肝腎功能異?；颊叩脑缙谠\斷以及疾病的愈后都有十分重要的診斷參考價(jià)值。更為重要的是，尿液中出現(xiàn)微量白蛋白一般可作為腎臟疾病(如糖尿病、高血壓、鏈球菌感染后的腎小球腎炎)、血管內(nèi)皮功能障礙、心臟疾病以及靜脈血栓栓塞的標(biāo)志物及診斷指標(biāo)【J.Am.Soc.Nephrol.2006,17,2120】。此外，血漿及白蛋白制品在存放和運(yùn)輸過(guò)程中往往會(huì)造成部分白蛋白變性從而給患者帶來(lái)不可預(yù)料的后果。因此，準(zhǔn)確評(píng)判血漿及白蛋白制品的質(zhì)量對(duì)于臨床治療也具有重要意義。

目前，白蛋白的檢測(cè)和定量方法包括：電泳法、免疫法和染料結(jié)合法等方法。其中電泳法耗時(shí)耗力，特異性較差，易造成白蛋白濃度的高估【Clinical Chemistry:Theory,Analysis,Correlation,Mosby,5^th edition,2009】。而免疫法雖然其特異性較好，但成本較高，因此目前臨床應(yīng)用較少。染料結(jié)合顯色法應(yīng)用相對(duì)較為廣泛，溴甲酚綠(bromocresol green)和溴甲酚紫(bromocresol purple)作為簡(jiǎn)單、便宜且特異性相對(duì)較好的兩種染料分子，在臨床上被較多的用來(lái)定量白蛋白。但由于這兩種染料的靈敏度較低、無(wú)法保證定量的準(zhǔn)確性，常出現(xiàn)高估【J Clin Pathol.2003,56,780.】或低估現(xiàn)象【Clin.Chim.Acta.1986,155,83.】，且不可避免受到生物樣品中的非特異性干擾【Clin.Chem.2009,55,583.】。本發(fā)明提到的方法屬于染料結(jié)合法，相比于目前的幾種染料，其具有簡(jiǎn)單易操作、特異性高、準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)。

本發(fā)明提供了一種定量測(cè)定生物樣品中白蛋白含量的方法及應(yīng)用，具體為ACDM可與白蛋白特異性結(jié)合生成熒光綴合物。該熒光綴合物在生理pH值條件下被激發(fā)后(激發(fā)波長(zhǎng)λ_ex＝560nm)產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號(hào)(發(fā)射波長(zhǎng)λ_em＝612nm)。其熒光值強(qiáng)度與白蛋白的濃度成正比，根據(jù)檢測(cè)到的熒光值可推算出生物樣品中白蛋白的含量。該方法可用于測(cè)定血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)液等多種生物樣品中白蛋白的絕對(duì)含量，同時(shí)還具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、抗環(huán)境干擾能力強(qiáng)、易于高通量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種定量測(cè)定生物樣品中白蛋白含量的方法及其應(yīng)用。具體為ACDM可與白蛋白特異性結(jié)合生成熒光綴合物。該熒光綴合物在生理pH值條件下被激發(fā)后(激發(fā)波長(zhǎng)λ_ex＝560nm)產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號(hào)(發(fā)射波長(zhǎng)λ_em＝612nm)。其熒光值強(qiáng)度與白蛋白的濃度成正比，根據(jù)檢測(cè)到的熒光值可 推算出生物樣品中白蛋白的含量。該方法可用于測(cè)定血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)液等多種生物樣品中白蛋白的絕對(duì)含量，同時(shí)還具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、抗環(huán)境干擾能力強(qiáng)、易于高通量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。

一種定量測(cè)定生物樣品中白蛋白的方法，將ACDM與白蛋白特異性結(jié)合并形成熒光綴合物，該綴合物在pH值1-9的條件下可被激發(fā)產(chǎn)生穩(wěn)定的熒光信號(hào)，其熒光值強(qiáng)度與白蛋白的濃度成正比，根據(jù)檢測(cè)到的熒光值可推算出生物樣品中白蛋白的含量；反應(yīng)式如下：

該方法具體按照以下步驟進(jìn)行：

(1)A液配制：配制pH 5.5-9.5磷酸鹽緩沖液0.1M，

(2)將待測(cè)樣本加入A液中混勻并孵育1-3min，孵育溫度為0-60℃，

(3)B液配制：以ACDM作為特異性結(jié)合配體，配制2mM的ACDM溶液，溶劑選擇二甲基亞砜、甲醇或乙腈；

(4)樣本測(cè)定：將步驟(2)中孵育好的溶液加入B液，混勻后用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)560nm，發(fā)射波長(zhǎng)612nm；讀取熒光值；同步測(cè)定無(wú)待測(cè)樣本的本底熒光值；

(5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制不同濃度的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液(0,5,10,20,50,75,100,200,300,400mg/L)，采用上述流程測(cè)定其熒光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(6)將樣本實(shí)測(cè)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算白蛋白的含量。

質(zhì)控液配制：配制50mg/L的白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(溶于緩沖液中)作為質(zhì)控樣本， 定期進(jìn)行方法質(zhì)控。

所述磷酸鹽緩沖液pH優(yōu)選7.4；孵育溫度優(yōu)選為37℃。

一種定量測(cè)定生物樣品中白蛋白的方法的應(yīng)用，該方法可用于多種白蛋白類產(chǎn)品的質(zhì)量控制，包括重組表達(dá)的白蛋白、白蛋白注射液及含有白蛋白的制劑等各類醫(yī)藥產(chǎn)品。

一種定量測(cè)定生物樣品中白蛋白的方法的應(yīng)用，該方法可用于臨床樣本的體外常規(guī)檢驗(yàn)，包括人血漿、尿液等臨床樣品中白蛋白含量的定量測(cè)定。

一種定量測(cè)定生物樣品中白蛋白的方法的應(yīng)用，該方法可用于體外定量評(píng)判肝細(xì)胞合成白蛋白的功能。

該方法檢測(cè)原理如下：在生理pH條件下，一分子ACDM與一分子白蛋白特異性結(jié)合后產(chǎn)生一分子熒光綴合物，其熒光強(qiáng)度與白蛋白的含量成正比。該方法具有熒光強(qiáng)度增益明顯，檢測(cè)靈敏度高、適于高通量檢測(cè)等特點(diǎn)。

本發(fā)明提供的白蛋白定量測(cè)定方法借助熒光檢測(cè)儀實(shí)現(xiàn)不同生物樣品中目標(biāo)蛋白的快速超靈敏檢測(cè)，該方法可用于重組表達(dá)的白蛋白、含有白蛋白的各類醫(yī)藥產(chǎn)品、人血漿、尿液等臨床樣品、體外人肝細(xì)胞中白蛋白的定量測(cè)定。

本發(fā)明所述白蛋白的定量檢測(cè)方法具有以下突出優(yōu)勢(shì)：

(1)高特異性：該方法具有良好的特異性(如圖1所示)，ACDM可與白蛋白高特異性地結(jié)合成熒光綴合物(如圖4所示)；

(2)高靈敏度：ACDM具有良好的熒光發(fā)射光譜特性(560nm)，該底物與白蛋白結(jié)合產(chǎn)物具有熒光發(fā)射光譜特征，能較好的進(jìn)行檢測(cè)(如圖4所示)。

(3)易高通量檢測(cè)：該方法可在實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)各類熒光酶標(biāo)儀及臨床大生化儀上測(cè)定，可利用96或386微孔板進(jìn)行批量檢測(cè)。

(4)抗干擾能力強(qiáng)：內(nèi)源性物質(zhì)與離子等對(duì)該方法定量的影響較小(如圖3 所示)。

附圖說(shuō)明

圖1.特異性篩選結(jié)果；

圖2.ACDM與白蛋白的結(jié)合動(dòng)力學(xué)；

圖3.抗離子及內(nèi)源性物質(zhì)干擾試驗(yàn)結(jié)果；

圖4.ACDM-白蛋白綴合物的熒光發(fā)射光譜圖(激發(fā)波長(zhǎng)560nm)；

圖5.白蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。

所述B液：以ACDM作為特異性結(jié)合配體，配制2mM的ACDM溶液，溶劑選擇二甲基亞砜、甲醇或乙腈。

實(shí)施例1.

檢測(cè)方法的特異性

(1)含有轉(zhuǎn)鐵蛋白、肌紅蛋白、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、碳酸酐酶、巨球蛋白、C反應(yīng)蛋白(10mg/L)、血漿(0.1％)、人血清白蛋白(150mg/L)的A液198μL，于37℃條件下震蕩混勻；

(2)加入2μL的B液，以使待測(cè)樣品中的ACDM的終濃度為20μM(如圖2所決定)；37℃震蕩混勻；

(3)5秒后，檢測(cè)ACDM-白蛋白綴合物(λ_ex＝560nm，λ_em＝612nm)在采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值(見(jiàn)圖4)。

實(shí)施例2.

白蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

(1)采用1mg/mL的人血清白蛋白(HSA)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用A液稀釋成 不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液(0,5,10,20,50,75,100,200,300,400mg/L)(見(jiàn)表2)，37℃下震蕩混勻；

(2)向每個(gè)所述溶液樣本(198μL)中加入2μL的B液，使待測(cè)樣品中的ACDM的終濃度為20μM(如圖2所決定)；37℃震蕩混勻5s；

表2制備系列濃度的HSA標(biāo)準(zhǔn)液

(3)分別檢測(cè)ACDM-白蛋白的綴合物(λ_ex＝560nm，λ_em＝612nm)在采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值，將熒光強(qiáng)度比值對(duì)HSA濃度進(jìn)行線性擬合作圖，建立白蛋白的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；曲線方程為Y＝241.0×X+1277，相關(guān)系數(shù)平方為0.9994(見(jiàn)圖5)。

實(shí)施例3.

人血漿樣本中白蛋白的定量分析

(1)吸取1μL(約1小滴)人血漿樣本，采用,A液稀釋1000倍，于37℃條件下震蕩混勻；

(2)吸取198μL樣品，加入2μL的B液，以使待測(cè)樣品中的ACDM的終濃度為20μM(如圖2所決定)；37℃震蕩孵育5秒左右；

(3)檢測(cè)ACDM-白蛋白綴合物(λ_ex＝560nm，λ_em＝612nm)在采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值；將熒光比值代入實(shí)施例2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求得血漿中的白蛋 白濃度為41.91mg/mL。

實(shí)施例4.

人尿液樣本中白蛋白的定量分析

(1)吸取198μL人尿液樣本，37℃下混勻；

(2)加入2μL的B液，以使待測(cè)樣品中的ACDM的終濃度為20μM(如圖2所決定)；37℃震蕩混勻；

(3)檢測(cè)ACDM-白蛋白綴合物(λ_ex＝560nm，λ_em＝612nm)在采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值；在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對(duì)應(yīng)的白蛋白濃度值，計(jì)算出待測(cè)樣品中的白蛋白濃度為26.61mg/L。

實(shí)施例5.

人肝細(xì)胞白蛋白合的定量分析

(1)吸取198μL培養(yǎng)24h的人肝細(xì)胞培養(yǎng)基液，37℃下混勻；

(2)加入2μL的B液，以使待測(cè)樣品中的ACDM的終濃度為20μM(如圖2所決定)；37℃震蕩混勻；

(3)檢測(cè)ACDM-白蛋白綴合物(λ_ex＝560nm，λ_em＝612nm)在采集波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度值；在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對(duì)應(yīng)的白蛋白濃度值，計(jì)算出待測(cè)樣品中的白蛋白濃度為21.22mg/L。