本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域和生物化學(xué)領(lǐng)域，是一種基于毛細(xì)管電泳-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用的多進(jìn)樣在線(xiàn)富集細(xì)胞中硫代謝通路重要中間體的分析方法。

背景技術(shù)：

硫代謝在生物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物功能。硫代謝紊亂會(huì)破壞人體內(nèi)氧化還原態(tài)比例，與人類(lèi)衰老以及許多疾病都有著密切的關(guān)系。在植物界，硫元素是植物必需的六大營(yíng)養(yǎng)素之一，硫元素雖然不直接參與植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成，但硫代謝的正常與否直接關(guān)系到植物抗脅迫能力以及農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)。目前已經(jīng)多種檢測(cè)方法用于硫代謝分析，如液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(lc-ms)由于其高靈敏度和高分辨率的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)用于生物樣品中硫代謝相關(guān)重要代謝物的檢測(cè)。由于這些代謝物的強(qiáng)極性，通常采用柱前衍生反相液相色譜或離子交換色譜分離，但由于硫代謝物不穩(wěn)定且衍生過(guò)程及生物樣品的基質(zhì)干擾等易造成分析結(jié)果的假陽(yáng)性，嚴(yán)重影響了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)色譜分析時(shí)間較長(zhǎng)，分析通量有限。此外，這些代謝物常常在生物體內(nèi)含量很低，也給檢測(cè)方法帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)?；谶@些問(wèn)題，亟需發(fā)展一種針對(duì)硫代謝相關(guān)重要代謝物的高通量、高靈敏度的檢測(cè)新方法。

毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ce-ms)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)技術(shù)，非常適合極性化合物的分析。lisa等人利用ce-ms方法通過(guò)衍生化方法提高代謝物的檢測(cè)靈敏度，該方法在13min內(nèi)分析了10種含硫代謝物，并分析了血漿中納摩爾濃度的氧化型和還原型硫代謝物。但是由于復(fù)雜的衍生過(guò)程，增加了樣品處理時(shí)間，易造成假陽(yáng)性結(jié)果。在線(xiàn)富集方法可以免去復(fù)雜的衍生過(guò)程，樣品提取之后無(wú)需進(jìn)一步處理就可以在分離的同時(shí)實(shí)現(xiàn)富集提高檢測(cè)靈敏度。目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道利用ce-ms在線(xiàn)富集生物樣本中硫代謝重要代謝物的報(bào)道。連續(xù)多進(jìn)樣方式是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新進(jìn)樣技術(shù)，該方法將樣品連續(xù)多次進(jìn)樣在毛細(xì)管中，利用背景電解質(zhì)作為分隔區(qū)帶，即可保證樣品分離又可實(shí)現(xiàn)高通量。該方法已應(yīng)用于酶催化反應(yīng)及藥物分析等，但至今尚未見(jiàn)到將大體積連續(xù)進(jìn)樣和在線(xiàn)富集方法聯(lián)用的報(bào)道，也未見(jiàn)到將其用于生物樣本中硫代謝重要代謝物的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)硫代謝相關(guān)重要代謝物的現(xiàn)有分析方法的不足，建立了一種生物樣本中硫代謝相關(guān)重要代謝物的分析新方法，該方法不僅 可以在線(xiàn)富集低豐度的硫代謝相關(guān)代謝物提高檢測(cè)靈敏度，同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)一次分析多個(gè)樣品，極大地提高了分析通量；同時(shí)在方法開(kāi)發(fā)階段可同時(shí)考察多個(gè)不同實(shí)驗(yàn)條件，有效地降低方法優(yōu)化時(shí)間。本發(fā)明具有預(yù)處理簡(jiǎn)單、分析快速高效、重復(fù)性好以及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

其具體方法如下：

生物樣本采用毛細(xì)管電泳-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(ce-tofms)進(jìn)行分析；

采用連續(xù)壓力進(jìn)樣方式，高電導(dǎo)的待測(cè)樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣，每次進(jìn)樣后以低電導(dǎo)的背景電解質(zhì)溶液作為間隔；

連續(xù)多次進(jìn)樣結(jié)束后，毛細(xì)管兩端加高壓，利用待測(cè)樣品與背景電解質(zhì)基質(zhì)的不同而引起的電場(chǎng)強(qiáng)度差異實(shí)現(xiàn)樣本的在線(xiàn)富集；

采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)硫代謝相關(guān)的重要代謝物進(jìn)行定量分析。

所述的毛細(xì)管電泳-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法為：

(1)ce條件：分離柱使用未涂層的毛細(xì)管柱，毛細(xì)管的長(zhǎng)度為80cm，內(nèi)徑為50μm；毛細(xì)管溫度20℃，樣品盤(pán)溫度為5℃；鞘液分流比為1：100，流速為10μl/min；鞘液為50％甲醇水溶液，鞘液含有濃度為0.1μm的六(1h,1h,2h-全氟乙氧基)鄰氮烯為參比用于質(zhì)譜的實(shí)時(shí)校正；毛細(xì)管的分離電壓27kv，分離時(shí)間20min；

(2)tofms條件：毛細(xì)管分離電壓為27kv，分離時(shí)間20min；氮?dú)鈮毫?psi，干燥氣溫度為300℃，干燥氣流速為7l/min；離子去簇電壓108v，錐孔電壓50v；毛細(xì)管電壓為4000v；質(zhì)量掃描范圍為60～1000，質(zhì)譜掃描速度為1.5張譜圖/s。

所述高電導(dǎo)的待測(cè)樣品溶液為含有200mm醋酸銨和2％甲酸(v/v)的水溶液，低電導(dǎo)背景電解質(zhì)溶液為4％甲酸(v/v)水溶液。

50～200mm醋酸銨是實(shí)現(xiàn)富集的關(guān)鍵，沒(méi)有鹽則無(wú)法實(shí)現(xiàn)富集。鹽濃度過(guò)高則有離子抑制。

所述連續(xù)壓力進(jìn)樣方式的樣品進(jìn)樣壓力為100mbar，進(jìn)樣時(shí)間40s，連續(xù)進(jìn)樣五次，每次進(jìn)樣后以壓力100mbar，持續(xù)時(shí)間為40s的背景電解質(zhì)溶液為間隔。進(jìn)樣次數(shù)是實(shí)現(xiàn)高通量的關(guān)鍵。進(jìn)樣次數(shù)大于7則易受雜質(zhì)干擾，小于3次則通量低。間隔帶是實(shí)現(xiàn)多進(jìn)樣方法的關(guān)鍵，小于10s則樣品區(qū)帶分離度差，大于40s則增加進(jìn)樣時(shí)間。

所述采用內(nèi)標(biāo)法定量，根據(jù)線(xiàn)性定量曲線(xiàn)進(jìn)行定量分析；內(nèi)標(biāo)及其含量為2.5μg/ml苯丙氨酸-d5

所述的生物樣品為冷凍干燥后的動(dòng)物、人或植物細(xì)胞的提取物。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)在線(xiàn)富集可有效提高檢測(cè)靈敏度，同時(shí)采用多進(jìn)樣方式極大的縮短了分析時(shí)間，提高了檢測(cè)通量；本發(fā)明還可同時(shí)優(yōu)化多個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，有效地降低方法開(kāi)發(fā) 時(shí)間?？傊?，本發(fā)明方法具有預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)單、分析快速、高通量、靈敏度高，線(xiàn)性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明的原理示意圖。

圖2連續(xù)多進(jìn)樣方法的條件優(yōu)化。樣本溶液的鹽濃度(a)，樣本溶液的酸濃度(b)，進(jìn)樣時(shí)間(c)。

圖3連續(xù)多進(jìn)樣間隔時(shí)間和進(jìn)樣次數(shù)優(yōu)化(a)進(jìn)樣間隔為10s，(b)進(jìn)樣間隔為40s，(c)進(jìn)樣間隔為60s，(d)進(jìn)樣次數(shù)n＝3，(e)進(jìn)樣次數(shù)n＝5，(f)進(jìn)樣次數(shù)n＝7。

圖4本發(fā)明方法與常規(guī)方法用于細(xì)胞中硫代謝相關(guān)代謝物的ce-tofms提取離子圖，本發(fā)明方法(右)，常規(guī)方法(左)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附表和附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明：實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例一

基于ce-tofms的高通量在線(xiàn)富集硫代謝相關(guān)重要代謝物的分析方法的建立及驗(yàn)證

圖1給出了本發(fā)明的原理示意圖。首先，采用連續(xù)多進(jìn)樣的方式，將含有高電導(dǎo)(高鹽濃度)待測(cè)樣品大體積進(jìn)樣到毛細(xì)管中，并通過(guò)低電導(dǎo)、(低鹽濃度)背景電解質(zhì)溶液作為間隔帶，并同時(shí)保持一定的長(zhǎng)度，使其在毛細(xì)管兩端加高電壓之后可利用不同電解質(zhì)電場(chǎng)強(qiáng)度的不同，實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)富集。連續(xù)進(jìn)樣的樣品區(qū)帶可以保持清晰的界限而逐次通過(guò)毛細(xì)管柱實(shí)現(xiàn)分離。

方法建立采用了19種硫代謝相關(guān)代謝物標(biāo)準(zhǔn)樣品，包括1-氨基環(huán)丙烷羧酸(acc)、天冬氨酸(asp)、天冬酰胺(asn)、精氨酸琥珀酸(argininosuccinicacid)、谷氨酸(glu)、谷氨酰胺(gln)、蛋氨酸(met)、絲氨酸(ser)、瓜氨酸(cit)、色氨酸(trp)、半胱氨酸(cys)、胱氨酸(cystine)、半胱酰胺甘氨酸(cys-gly)、胱硫醚(cystathionine)、g-谷氨酸-半胱氨酸(gama-glu-cys)、s-(5’-腺苷)-高半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine)、s-乳酰谷胱甘肽(s-lactoylglutathione)、羧甲半胱氨酸(s-carboxymetylcycteine)、纈氨酸(val)。

ce-tofms條件為：

毛細(xì)管電泳條件：分離柱使用未涂層的毛細(xì)管柱，毛細(xì)管的長(zhǎng)度為80cm，內(nèi)徑為50μm；毛細(xì)管溫度20℃，樣品盤(pán)溫度為5℃；鞘液分流比為1：100，流速為10μl/min；鞘液為50％甲醇水溶液，鞘液含有濃度為0.1μm的六(1h,1h,2h-全氟乙氧基)鄰氮烯為參比用于質(zhì)譜 的實(shí)時(shí)校正；毛細(xì)管的分離電壓27kv，分離時(shí)間20min；飛行時(shí)間質(zhì)譜條件：毛細(xì)管分離電壓為27kv，分離時(shí)間20min；氮?dú)鈮毫?psi，干燥氣溫度為300℃，干燥氣流速為7l/min；離子去簇電壓108v，錐孔電壓50v；毛細(xì)管電壓為4000v；質(zhì)量掃描范圍為60～1000，質(zhì)譜掃描速度為1.5張譜圖/s。

對(duì)連續(xù)多進(jìn)樣方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，多進(jìn)樣方式可以在一次分離時(shí)間內(nèi)考察不同實(shí)驗(yàn)條件，快速優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)。首先，優(yōu)化樣本溶液的中醋酸銨的濃度。將醋酸銨加入配置好的硫代謝相關(guān)代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，使得溶液中醋酸銨的濃度分別為0mm、50mm、100mm、200mm和400mm。將上述加入醋酸銨的標(biāo)準(zhǔn)溶液采用連續(xù)進(jìn)樣方式，分別進(jìn)樣100mbar持續(xù)40s，以4％甲酸(v/v)溶液(背景電解質(zhì)溶液)作為間隔帶，以壓力進(jìn)樣100mbar持續(xù)40s，連續(xù)進(jìn)樣5次。圖2中以半胱氨酸為例考察了不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)ce-tofms質(zhì)譜響應(yīng)的影響。圖2a給出了醋酸銨濃度對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的影響，從圖中可知醋酸銨濃度為200mm時(shí)質(zhì)譜響應(yīng)最佳。當(dāng)鹽濃度為0mm，峰型差分離度低(圖2a)。沒(méi)有鹽則無(wú)富集效果，鹽濃度過(guò)高則離子抑制。如果用無(wú)鹽的水溶液配置標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)多進(jìn)樣，則5個(gè)樣品區(qū)帶無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離。其次使用含有200mm醋酸銨的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)一步優(yōu)化樣本溶液中甲酸的濃度。將甲酸加入配置好的含有200mm醋酸銨的硫代謝相關(guān)代謝物的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，使得溶液中甲酸的濃度分別為4％，2％，1％和0.5％(v/v)。將上述標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液采用連續(xù)進(jìn)樣方式，分別進(jìn)樣100mbar持續(xù)40s，以背景電解質(zhì)溶液進(jìn)樣100mbar持續(xù)40s作為間隔帶，連續(xù)進(jìn)樣5次。從圖2b中可以明顯看出甲酸濃度對(duì)多進(jìn)樣富集方法影響較小，為了保證硫代謝重要中間體的穩(wěn)定性以及富集效果，最終選擇含有200mm醋酸銨和2％甲酸(v/v)為最優(yōu)的生物樣本復(fù)溶溶液。然后，考察進(jìn)樣時(shí)間對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的影響。用優(yōu)化后的復(fù)溶溶液(200mm醋酸銨+2％甲酸(v/v))稀釋硫代謝重要中間體的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣壓力為100mbar，進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間分別為5s，10s，20s，40s和60s，以背景電解質(zhì)溶液進(jìn)樣100mbar持續(xù)40s作為間隔帶。從圖2c可知進(jìn)樣時(shí)間持續(xù)60s的質(zhì)譜峰面積和峰高最大，但是綜合考慮到多進(jìn)樣的分離和富集效果，最終選擇進(jìn)樣時(shí)間40s。

對(duì)連續(xù)多進(jìn)樣方法的間隔時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。以半胱氨酸為例，進(jìn)樣間隔時(shí)間采用10s、40s和60s，得到結(jié)果如圖3(a-c)所示。當(dāng)間隔時(shí)間為10s，原本獨(dú)立的5個(gè)峰不能基線(xiàn)分離。如果間隔時(shí)間為0，則5個(gè)峰堆積成一個(gè)大峰，無(wú)法分離。當(dāng)間隔時(shí)間為60s，峰型和分離度與間隔時(shí)間為40s沒(méi)有顯著區(qū)別，反而會(huì)增加進(jìn)樣時(shí)間。為了減少進(jìn)樣時(shí)間，最終選擇間隔時(shí)間為40s。對(duì)連續(xù)多進(jìn)樣方法的進(jìn)樣次數(shù)優(yōu)化。以谷氨酸為例分別采用連續(xù)進(jìn)樣次數(shù)為3、5、7次，得到結(jié)果如 從圖3(d-f)。由于時(shí)間窗口的增加，會(huì)出現(xiàn)與其它峰重疊，造成定性、定量誤差，所以最終選擇進(jìn)樣次數(shù)為5次。

確定了優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件后，對(duì)所建立方法的線(xiàn)性、檢測(cè)限、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證。首先配置一系列不同濃度含有硫代謝重要中間體的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用含有200mm醋酸銨+2％甲酸(v/v)的水溶液配置含上述19種標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)溶液母液(每種標(biāo)樣濃度均為15μg/ml)，將母液用含有200mm醋酸銨和2％甲酸(v/v)的水溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)分別為2000倍、1000倍、500倍、100倍、50倍、20倍、10倍和5倍，均加入以苯丙氨酸-d5為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)濃度為2.5μg/ml。將上述稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別連續(xù)進(jìn)樣100mbar持續(xù)40s，以背景電解質(zhì)溶液進(jìn)樣100mbar持續(xù)40s作為間隔帶，連續(xù)進(jìn)樣5次考察方法的線(xiàn)性和檢測(cè)限；以稀釋10倍、20倍和50倍的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別連續(xù)大體積壓力進(jìn)樣100mbar，進(jìn)樣時(shí)間持續(xù)40s，以4％甲酸(v/v)溶液進(jìn)樣100mbar持續(xù)40s作為間隔帶，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察所建立方法的精密度(n＝5)。為了考察所建立方法的富集倍數(shù)，還同時(shí)采用常規(guī)方法進(jìn)行分析。常規(guī)ce-tofms方法的進(jìn)樣壓力為50mbar，進(jìn)樣持續(xù)3s，單次進(jìn)樣，其他條件與本發(fā)明方法一致。富集倍數(shù)根據(jù)所建立方法與常規(guī)方法所得代謝物的峰高比值來(lái)計(jì)算。表1給出了方法富集倍數(shù)和驗(yàn)證結(jié)果，從表中可知所建立的方法對(duì)19種硫代謝重要代謝物的富集倍數(shù)在14.4-32.4之間，檢測(cè)限在在3-15ng/ml，在0.15-3μg/ml的線(xiàn)性范圍內(nèi)，精密度在2.9-9.9％之間。上述結(jié)果表明本方法具有靈敏度高，線(xiàn)性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好。

實(shí)施例2.本發(fā)明方法用于細(xì)胞中硫代謝重要中間體分析

(1)細(xì)胞預(yù)處理：從培養(yǎng)箱中取出u251細(xì)胞，用液氮迅速猝滅以保持穩(wěn)定的代謝水平。隨后加入甘露醇溶液洗滌3次。加入1ml甲醇將細(xì)胞刮下轉(zhuǎn)移到ep管中，斡旋30s，再加入400μl超純水，渦旋30s，最后加入1ml氯仿，渦旋30s。靜置1min后，在15000rpm/min轉(zhuǎn)速下離心10min。取上清液凍干。加入50μl含有200mm醋酸銨，2％甲酸(v/v)及內(nèi)標(biāo)濃度為2.5μg/ml的苯丙氨酸-d5的水溶液復(fù)溶細(xì)胞樣品。

(2)ce-tofms分離條件：分離柱使用未涂層的毛細(xì)管柱，毛細(xì)管的長(zhǎng)度為80cm，內(nèi)徑為50μm；毛細(xì)管溫度20℃，樣品盤(pán)溫度為5℃；鞘液分流比為1：100，流速為10μl/min；鞘液為50％甲醇水溶液，鞘液含有濃度為0.1μm的六(1h,1h,2h-全氟乙氧基)鄰氮烯為參比用于質(zhì)譜的實(shí)時(shí)校正；樣品進(jìn)樣為100mbar，持續(xù)時(shí)間40s，連續(xù)5次，并用背景電解質(zhì)溶液100mbar，40s作為間隔帶。毛細(xì)管的分離電壓27kv，分離時(shí)間20min；飛行時(shí)間質(zhì)譜條件：毛細(xì)管分離電壓為27kv，分離時(shí)間20min；氮?dú)鈮毫?psi，干燥氣溫度為300℃， 干燥氣流速為7l/min；離子去簇電壓108v，錐孔電壓50v；毛細(xì)管電壓為4000v；質(zhì)量掃描范圍為60～1000，質(zhì)譜掃描速度為1.5張譜圖/s。

(3)將處理好的細(xì)胞樣品用優(yōu)化好的復(fù)溶劑和水復(fù)溶之后分別以本發(fā)明方法和常規(guī)方法進(jìn)樣。常規(guī)ce-tofms方法的進(jìn)樣壓力為50mbar，進(jìn)樣持續(xù)3s，單次進(jìn)樣，其他條件與本發(fā)明方法一致。圖3給出10種硫代謝相關(guān)重要代謝物高通量富集方法(圖4右)與常規(guī)方法(圖4左)的提取離子圖。采用內(nèi)標(biāo)法定量，細(xì)胞樣品中硫代謝重要中間體代謝物的含量見(jiàn)表1，從表1和圖4中可以看出常規(guī)方法只能檢測(cè)到1個(gè)代謝物(谷氨酸)，而本發(fā)明方法可以檢測(cè)到10個(gè)硫代謝相關(guān)的代謝物，對(duì)谷氨酸有21.6倍的富集效果，與標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的富集效果相當(dāng)，且分析時(shí)間從常規(guī)方法的20分鐘/樣本縮短至4分鐘/樣本。

表1方法評(píng)價(jià)及富集倍數(shù)

a富集倍數(shù)根據(jù)所建立方法與常規(guī)方法(進(jìn)樣壓力為50mbar，進(jìn)樣持續(xù)3s，單次進(jìn)樣)所得代謝物的峰高比值來(lái)計(jì)算。