本申請(qǐng)要求2014年5月27日提交的申請(qǐng)?zhí)枮?2/003,221的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)的主題全部通過(guò)引用方式合并于本文中。

背景技術(shù)：

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)和相關(guān)的頭部震蕩是由于汽車(chē)事故導(dǎo)致的平民、參與諸如橄欖球、足球和曲棍球等接觸性體育運(yùn)動(dòng)的人的健康問(wèn)題以及是與美國(guó)軍事相關(guān)的主要健康擔(dān)憂。僅在美國(guó)每年就有170萬(wàn)人遭遇TBI的困擾。處理頭部損傷的成本，包括在橄欖球中涉及到的運(yùn)動(dòng)員，在經(jīng)濟(jì)上和情感上都是昂貴的。TBI是兒童和青少年中死亡和殘疾的首要原因。在美國(guó)，幾乎1-2％的人群忍受著一定程度的TBI相關(guān)的殘疾。

當(dāng)前，TBI相關(guān)癥狀的診斷通常是通過(guò)神經(jīng)檢查和神經(jīng)成像測(cè)試來(lái)實(shí)現(xiàn)的，諸如磁共振成像(MRI)和計(jì)算機(jī)斷層成像(CT)掃描。這些測(cè)試是昂貴的、耗時(shí)的，且要求極其精密的裝備和技術(shù)嫻熟的操作者。此外，結(jié)果不能以實(shí)時(shí)的方式可用，并且測(cè)試結(jié)果經(jīng)常是無(wú)結(jié)果的。此外，非對(duì)比的CT掃描對(duì)于輕微的損傷不靈敏且會(huì)由于額外的頭顱損傷或鎮(zhèn)靜和導(dǎo)氣管保護(hù)的必要而不清楚。及時(shí)管理決策在優(yōu)化TBI結(jié)果上是關(guān)鍵的。結(jié)果，由于TBI的臨床當(dāng)場(chǎng)即時(shí)檢驗(yàn)所給出的實(shí)時(shí)診斷評(píng)估的值期望促進(jìn)恰當(dāng)治療。

發(fā)明概述

本文所描述的實(shí)施方案涉及用于在身體樣本中檢測(cè)、識(shí)別、量化和/或確定諸如創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)損傷的生物標(biāo)志物的檢測(cè)系統(tǒng)以及試管內(nèi)化驗(yàn)，以及涉及用于在患有或疑似患有諸如創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)損傷和/或神經(jīng)元紊亂的受試者中診斷、識(shí)別、補(bǔ)給和/或監(jiān)測(cè)神經(jīng)損傷如創(chuàng)傷性腦損傷的檢測(cè)系統(tǒng)和試管內(nèi)化驗(yàn)。

在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)系統(tǒng)包括：至少一種反應(yīng)溶液，其用于在與身體樣本中的丙酮酸脫氫酶(PDH)結(jié)合時(shí)生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)；以及生物傳感器，其用于確定所生成的NAD⁺的水平。在一些實(shí)施方案中，至少一種反應(yīng)溶液可以包括丙酮酸鹽和NADH，丙酮酸鹽和NADH的量利于提供用于與PDH的反應(yīng)以及乳酸鹽和NAD⁺的形成的襯底。

在一些實(shí)施方案中，身體樣本可以包括身體流體，諸如唾液、血液、血漿、血清、呼吸或尿液，它們可能包含PDH。

在其它實(shí)施方案中，生物傳感器可以包括襯底、形成在襯底的表面上的工作電極、形成在襯底的表面上的對(duì)電極以及介電層，該介電層覆蓋工作電極和對(duì)電極的一部分且限定了露出工作電極和對(duì)電極的其它部分的孔口。

在另外的其它實(shí)施方案中，工作電極和對(duì)電極可以包括金屬膜。例如，工作電極和對(duì)電極可以獨(dú)立地包括金，鉑，鈀，銀，碳，其合金，及其復(fù)合物。通過(guò)將膜濺射或涂敷到表面上且隨后將膜激光燒蝕，能夠?qū)⒔饘倌ぴO(shè)置在襯底的表面上，從而形成工作電極和對(duì)電極。

在其它實(shí)施方案中，傳感器可以包括在襯底的表面上的基準(zhǔn)電極。電介質(zhì)可以覆蓋基準(zhǔn)電極的部分。傳感器還可以包括測(cè)量裝置，該測(cè)量裝置對(duì)工作電極和對(duì)電極施加電壓電位以及測(cè)量工作電極與對(duì)電極之間的電流流動(dòng)以確定樣本如身體樣本中的NAD⁺的水平。

在另外的其它實(shí)施方案中，檢測(cè)系統(tǒng)可以包括用于檢測(cè)來(lái)自受試者的身體樣本中的、指示諸如創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)損傷的除了PDH之外的其它生物標(biāo)志物的其它生物傳感器。這些其它的生物標(biāo)志物可以包括例如S100B，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和分泌肌動(dòng)蛋白(例如SCGN，SEGN，CALBL或setgin)。生物傳感器可以包括襯底、形成在襯底表面上的工作電極、形成在襯底表面上的對(duì)電極以及覆蓋工作電極和對(duì)電極的部分且限定露出工作電極和對(duì)電極的其它部分的孔口的介電層。工作電極經(jīng)官能化或化學(xué)官能化而包含用于感興趣的生物標(biāo)志物中的至少一個(gè)的受體。該受體可以與身體樣本中的一個(gè)或多個(gè)感興趣生物標(biāo)志物選擇性地鍵合。

該檢測(cè)系統(tǒng)還可以包括測(cè)量裝置，該測(cè)量裝置用于對(duì)工作電極、對(duì)電極和/或基準(zhǔn)電極施加電壓電位且測(cè)量工作電極與對(duì)電極之間的電流流動(dòng)?？梢允褂秒娀瘜W(xué)分析技術(shù)(例如循環(huán)伏安法(CV)，差分脈沖伏安法(DPV))檢測(cè)生物標(biāo)志物和受體(例如鍵合的生物標(biāo)志物)的相互作用，以確定身體樣本中生物標(biāo)志物的存在，以及受試者是否具有神經(jīng)損傷或受試者的神經(jīng)損傷的程度。

附圖說(shuō)明

圖1是依照本申請(qǐng)的方案的生物傳感器的示意性圖示。

圖2是由絲網(wǎng)印刷工藝制造的成行的生物傳感器陣列的俯視平面圖。

圖3示出了顯示在0-7.5μM的濃度下丙酮酸脫氫酶的循環(huán)伏安法測(cè)量的圖。丙酮酸和NADH都是375μM。

圖4示出了在0-7.5的濃度下PDH的校準(zhǔn)曲線。+0.65V用作循環(huán)伏安圖的電流的電位。

發(fā)明詳述

除非在本文具體地說(shuō)明，否則所使用的全部術(shù)語(yǔ)都具有與本申請(qǐng)的主題的領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的相同的含義。下面的定義將提供關(guān)于在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)的清楚性。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“監(jiān)測(cè)”是指使用從數(shù)據(jù)集中生成結(jié)果來(lái)提供關(guān)于個(gè)體或個(gè)體的健康或疾病狀況的有用的信息?！氨O(jiān)測(cè)”可以包括例如預(yù)后的確定，風(fēng)險(xiǎn)分層，藥物治療的選擇，正在進(jìn)行的藥物治療的評(píng)估，治療有效性的確定，結(jié)果的預(yù)測(cè)，對(duì)治療的反應(yīng)的確定，疾病或疾病并發(fā)癥的診斷，跟隨疾病的進(jìn)展或提供與隨時(shí)間推移患者的健康狀況有關(guān)的任何信息，選擇最可能受益于具有已知分子作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)性治療的患者，選擇最可能從具有已知分子機(jī)制(其中該機(jī)制對(duì)于藥物可能不具有標(biāo)簽的疾病的小子集可能是重要的)的批準(zhǔn)藥物中獲益的患者，篩選患者群體以幫助決定更有侵入性的/昂貴的測(cè)試，例如，從非侵入性的血液測(cè)試到更具侵入性的選項(xiàng)的測(cè)試級(jí)聯(lián)，例如活檢，或測(cè)試以評(píng)估用于治療另一種適應(yīng)癥的藥物的副作用。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“定量數(shù)據(jù)”或“定量水平”或“定量量”是指與可以分配數(shù)值的任何數(shù)據(jù)集組分(例如，標(biāo)志物，臨床標(biāo)志)相關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)，水平或量。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“受試者”是指會(huì)患有神經(jīng)損傷(例如創(chuàng)傷性腦損傷)但可能具有或可能不具有這種損傷的人或另一種哺乳動(dòng)物。通常，術(shù)語(yǔ)“受試者”和“患者”在本文中可互換地用于指人類個(gè)體。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“損傷或神經(jīng)損傷”旨在包括直接或間接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的正常功能的損害。例如，損傷可以是對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷；創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)；中風(fēng)相關(guān)損傷；腦動(dòng)脈瘤相關(guān)損傷；脊髓損傷，包括單癱，雙癱，截癱，偏癱和四肢麻痹；神經(jīng)增生性病癥或神經(jīng)性疼痛綜合征。CNS損傷或疾病的實(shí)例包括TBI，中風(fēng)，腦震蕩(包括腦震蕩后綜合征)，腦缺血，腦的神經(jīng)變性疾病，如帕金森氏病，拳擊員癡呆，亨廷頓舞蹈病和阿爾茨海默病，Creutzfeldt-Jakob疾病，由于輻射、暴露于電離或鐵等離子體而誘發(fā)的癲癇發(fā)作所繼發(fā)的腦損傷，神經(jīng)劑，氰化物，毒性氧濃度，由CNS瘧疾引起的神經(jīng)毒性或用抗瘧疾劑，錐蟲(chóng)，瘧疾病原體和其它CNS創(chuàng)傷治療誘導(dǎo)的發(fā)作。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“中風(fēng)”是本領(lǐng)域公認(rèn)的，并且意在包括由腦動(dòng)脈的破裂或阻塞(例如，通過(guò)血塊)引起的意識(shí)，感覺(jué)和自發(fā)運(yùn)動(dòng)的突然減少或喪失。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“創(chuàng)傷性腦損傷”是本領(lǐng)域公認(rèn)的，并且旨在包括這樣的狀況：其中頭部的創(chuàng)傷性打擊引起對(duì)腦的損害，通常不穿透顱骨。通常，初始創(chuàng)傷可導(dǎo)致擴(kuò)張性血腫，蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦水腫，顱內(nèi)壓升高(ICP)和腦缺氧，這可能由于低腦血流量(CBF)而導(dǎo)致嚴(yán)重的繼發(fā)性事件。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“疑似患有神經(jīng)損傷的受試者”是指存在指示神經(jīng)損傷(例如TBI)或正在篩選神經(jīng)損傷(例如TBI)的一種或多種癥狀的受試者。懷疑患有神經(jīng)損傷例如TBI的受試者也可能具有一種或多種風(fēng)險(xiǎn)因素。該術(shù)語(yǔ)包括未進(jìn)行神經(jīng)損傷(例如TBI)測(cè)試的個(gè)體，以及已經(jīng)接受初始診斷但是神經(jīng)損傷的程度未知的個(gè)體。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“提供預(yù)后”是指提供關(guān)于神經(jīng)損傷例如TBI的存在或程度的影響的信息(例如，通過(guò)本文所述的方法確定)。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“身體樣本”是指可以從受試者(例如人)或受試者的組分(例如組織)獲得的樣本。樣本可以是任何生物組織或流體，利用其可以測(cè)定本文所述的生物標(biāo)志物。通常，樣本將是“臨床樣本”，即源自患者的樣本。這樣的樣本包括但不限于身體流體，例如唾液，呼吸，尿，血液，血漿或血清；和具有已知診斷，治療和/或結(jié)果歷史的檔案樣本。術(shù)語(yǔ)生物樣本還包括通過(guò)處理身體樣本所得到的任何材料。身體樣本的處理可涉及過(guò)濾，蒸餾，萃取，濃縮，干擾組分的失活，試劑的添加等中的一種或多種。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“正常”和“健康”可互換使用。它們是指沒(méi)有顯示任何神經(jīng)損傷癥狀，并且沒(méi)有被診斷出患有神經(jīng)損傷的個(gè)體或個(gè)體組。優(yōu)選地，正常個(gè)體(或個(gè)體組)不服用影響神經(jīng)損傷的藥物。在一些實(shí)施方案中，正常個(gè)體與獲得待測(cè)試樣本的個(gè)體相比具有相似的性別、年齡、體重指數(shù)。術(shù)語(yǔ)“正?！痹诒疚闹幸灿糜谙薅◤慕】祩€(gè)體分離的樣本。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“對(duì)照”或“對(duì)照樣本”是指從正常(即健康)個(gè)體或個(gè)體組分離的一個(gè)或多個(gè)生物樣本。術(shù)語(yǔ)“對(duì)照”，“對(duì)照值”或“對(duì)照樣本”還可以指從分類為正常的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體和/或診斷有神經(jīng)損傷的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的樣本得到的數(shù)據(jù)的匯編。

如本文所用，當(dāng)應(yīng)用于身體樣本中至少一PDH的量時(shí)，術(shù)語(yǔ)“指示神經(jīng)損傷”是指診斷神經(jīng)損傷的水平或量，從而發(fā)現(xiàn)水平或量通常在具有損傷的受試者中比在沒(méi)有受傷的受試者中(如使用常規(guī)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法設(shè)定置信水平至少95％所確定的)顯著更多。優(yōu)選地，指示神經(jīng)損傷的水平或量在至少約60％的具有神經(jīng)損傷的受試者中被發(fā)現(xiàn)，并且在小于約10％的沒(méi)有神經(jīng)損傷的受試者中發(fā)現(xiàn)。更優(yōu)選地，指示神經(jīng)損傷的水平或量在至少約70％，至少約75％，至少約80％，至少約85％，至少約90％，至少約約95％或更多的具有神經(jīng)損傷的受試者被發(fā)現(xiàn)并且在小于約10％，小于約8％，小于約5％，小于約2.5％或小于約1％的不具有神經(jīng)損傷的受試者中被發(fā)現(xiàn)。

本文所描述的實(shí)施例用于確定、識(shí)別、量化和/或確定身體樣本中神經(jīng)損傷諸如創(chuàng)傷性腦損傷的生物標(biāo)志物的檢測(cè)系統(tǒng)和試管內(nèi)化驗(yàn)，以及涉及用于在患有神經(jīng)損傷如創(chuàng)傷性腦損傷或疑似患有神經(jīng)損傷如創(chuàng)傷性腦損傷的受試者中診斷、識(shí)別、補(bǔ)給和/或監(jiān)測(cè)神經(jīng)損傷如創(chuàng)傷性腦損傷的檢測(cè)系統(tǒng)和試管內(nèi)化驗(yàn)。

本文所描述的檢測(cè)系統(tǒng)和方法提供了用于利用通過(guò)非侵入性或微創(chuàng)手段獲得的身體樣本如身體流體來(lái)進(jìn)行諸如TBI的神經(jīng)損傷的簡(jiǎn)單的臨床當(dāng)場(chǎng)即時(shí)、實(shí)時(shí)評(píng)估的單次使用的、一次性的和成本效益高的方式，其最小化用于檢測(cè)和監(jiān)測(cè)TBI和相關(guān)腦震蕩的復(fù)雜的臨床操作。已經(jīng)嘗試使用基于試紙的免疫測(cè)定試驗(yàn)檢測(cè)TBI的化學(xué)生物標(biāo)志物。不幸的是，這種測(cè)試仍然需要昂貴和不便攜的分光光度設(shè)備。此外，評(píng)估是更定性的，而不是定量的和不確定的。

在一些實(shí)施方案中，本文所描述的檢測(cè)系統(tǒng)和化驗(yàn)或方法包括：至少一種反應(yīng)溶液，其能夠用語(yǔ)生成可檢測(cè)和/或可量化分析物，該分析物指示疑似患有神經(jīng)損傷的受試者的身體樣本中的丙酮酸脫氫酶的量、濃度或水平；以及生物傳感器，其用于檢測(cè)反應(yīng)溶液中的分析物的量、水平或濃度。

丙酮酸脫氫酶(PDH)的檢測(cè)可以采用如下反應(yīng)機(jī)制：

在上述反應(yīng)中，在反應(yīng)溶液中提供丙酮酸鹽和NADH，它們的量有效地作為與混合有反應(yīng)溶液的身體樣本中的PDH反應(yīng)以及用于產(chǎn)生NAD⁺的襯底。NAD⁺是電化學(xué)活性物質(zhì)，其可以在給定吉布斯自由能或繼而電化學(xué)電勢(shì)下被還原。還原電流可用于在固定丙酮酸和NADH濃度下將參與反應(yīng)的PDH定量?？梢允褂蒙飩鞲衅鳒y(cè)量從懷疑患有神經(jīng)損傷的受試者獲得的身體樣本中的反應(yīng)溶液和PDH的生化反應(yīng)產(chǎn)生的NAD⁺的量，濃度或水平，以確定在體液中PDH的量，濃度或水平，因此確定受試者是否具有神經(jīng)損傷。

從懷疑患有神經(jīng)損傷的受試者獲得的身體樣本中的PDH的量可以直接影響NAD⁺的產(chǎn)生。因此，可以將生成的NAD⁺的定量水平與對(duì)照值或預(yù)定值進(jìn)行比較，以確定身體樣本中PDH的水平，以及受試者是否具有神經(jīng)損傷，例如TBI。例如，與對(duì)照值相比，與反應(yīng)溶液混合的身體樣本中檢測(cè)到的NAD⁺水平的升高表示受試者具有神經(jīng)損傷，例如TBI。

例如，可以通過(guò)將量的丙酮酸鹽和NADH與磷酸鹽緩沖鹽水溶液(PBS)混合，使得丙酮酸鹽和NADH的摩爾比為約1:1來(lái)制備反應(yīng)溶液。具有6.5的pH的PBS溶液可以是通過(guò)將一堿價(jià)和二堿價(jià)磷酸鈉與去離子水混合而制備，并且可以加入200mM氯化鉀作為支持電解質(zhì)以提高緩沖劑的導(dǎo)電性。有利地，反應(yīng)溶液不包括潛在地有助于生物傳感器的背景氧化電流并且損害所產(chǎn)生的NAD⁺的檢測(cè)和定量的任何試劑或副產(chǎn)物。

如此形成的反應(yīng)溶液可以與從受試者獲得的身體樣本，例如體液(例如，唾液，血液，血清，血漿或尿液)混合。在一些方面，體液可以是從患有或疑似患有神經(jīng)損傷的受試者獲得的唾液。從受試者獲得的唾液的量可以是約0.1ml或更多。然后可將獲得的唾液加入到反應(yīng)溶液中。例如，加入到約6μl反應(yīng)溶液中的唾液的量可以是約1μl或更少。

使用用于以侵入方式(即，直接來(lái)自受試者)或非侵入性地獲得液體和/或固體身體樣本的采樣裝置，例如注射器，拭子或其他采樣裝置，可以從受試者獲得身體樣本。然后可將這些樣本儲(chǔ)存在儲(chǔ)存容器中。用于容納所收集的樣本的儲(chǔ)存容器可以包括非表面反應(yīng)性材料，例如聚丙烯。儲(chǔ)存容器通常不由未處理的玻璃或其他樣本反應(yīng)性材料制成，以防止樣本被玻璃容器的表面吸收或吸附。

收集在容器中的樣本可以在冷藏溫度下儲(chǔ)存。對(duì)于較長(zhǎng)的儲(chǔ)存時(shí)間，收集的樣本可以冷凍以阻止分解并便于儲(chǔ)存。例如，從受試者獲得的樣本可以儲(chǔ)存在獵鷹管中并冷卻至約-80°的溫度。

通過(guò)將含有PDH的身體樣本與反應(yīng)溶液混合而產(chǎn)生的NAD⁺是電化學(xué)活性物質(zhì)，其可在適當(dāng)條件下被氧化或還原，并使用NAD⁺生物傳感器檢測(cè)，以定量身體樣本中的PDH水平，并且確定受試者是否具有神經(jīng)損傷。在一些實(shí)施方案中，生物傳感器可以包括兩電極或三電極電化學(xué)生物傳感器。

圖1示出了根據(jù)本申請(qǐng)的實(shí)施例的生物傳感器10。傳感器10是三電極傳感器，其包括形成在襯底的表面上的對(duì)電極12，工作電極14和參考電極16。介電層40覆蓋工作電極12，對(duì)電極14和參考電極16的一部分。介電層40包括孔口20，其限定工作電極12，對(duì)電極14和參考電極16的暴露于其中檢測(cè)到PDH水平的樣本的檢測(cè)區(qū)域。

電壓源22連接到工作電極14和參考電極16。電流測(cè)量裝置24連接到工作電極14和對(duì)電極12，以測(cè)量當(dāng)反應(yīng)溶液和身體樣本的混合物接觸傳感器10的檢測(cè)區(qū)域20時(shí)通過(guò)NAD⁺的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的電流。

工作電極14是NAD⁺的氧化還原反應(yīng)且發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移的部位。對(duì)電極12的功能是完成電路，允許電荷流經(jīng)傳感器10。工作電極14和對(duì)電極12優(yōu)選地由相同的材料形成，但是這不是要求。能夠用于工作電極14和對(duì)電極12的材料的示例包括但不限于金，鉑，鈀，銀，碳，其合金，及其復(fù)合物。

可用于形成參考電極16的材料的實(shí)例是銀-氯化銀和汞-汞氯化物(Calomel)。優(yōu)選銀-氯化銀。銀可以以銀油墨的形式施加到襯底上，銀油墨是市售的，或者可以使用細(xì)分散的金屬顆粒，溶劑和粘合劑來(lái)制成。各個(gè)銀接觸墊30,32和34與電極12,14和16中的每一個(gè)連接。該參考電極可以厚膜印刷在工作電極和對(duì)電極的相同的襯底上，并且還可以在外部使用。

在一些實(shí)施方案中，工作電極14和對(duì)電極12可包括顆粒層，例如活性炭或多孔碳的微米，中等尺寸或納米尺寸的顆粒?；钚蕴技{米顆粒可以與金屬催化劑顆粒結(jié)合，所述金屬催化劑顆粒提高與NAD⁺的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)的速率，并提供在比沒(méi)有催化劑顆粒存在時(shí)更低的氧化電位下NAD⁺的檢測(cè)。在實(shí)際應(yīng)用中，金屬催化劑顆?？梢钥s短反應(yīng)時(shí)間，降低用于反應(yīng)溶液和生物樣本的混合物中NAD⁺檢測(cè)的所施加的電化學(xué)電位。降低所施加的電位通常導(dǎo)致電化學(xué)氧化的最小化或所呈現(xiàn)的其它物質(zhì)的還原，導(dǎo)致由混雜物質(zhì)的不希望的反應(yīng)引起的干擾的最小化。結(jié)果，可以獲得和生產(chǎn)高度特異性的生物傳感器。

金屬催化劑顆?？梢园ㄒ辉饘?M)，二元金屬(M-X)，一元金屬氧化物(MOy)，二元金屬氧化物(MOy-XOy)，金屬-金屬氧化物復(fù)合材料(M-MOy)或其組合的納米尺寸、中等尺寸或微米尺寸的顆粒，其中y小于3，M和X獨(dú)立地選自Li，Na，Mg，Al，K，Ca，Cr，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Cu，Zn，Ga，Sr，Y，Zr，Nb，Mo，Ru，Rh，Pd，Ag，Cd，In，Sn，Ba，La，Ce，Pr，Nd，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Lu，Ta，W，Os，Ir，Pt，Au和Pb構(gòu)成的組。在一個(gè)實(shí)施方案中，例如，金屬催化劑顆?？梢杂梢辉饘伲辉饘傺趸?，二元金屬或二元金屬氧化物構(gòu)成，如銥，氧化銥，鉑，釕，鉑-釕，鉑-鎳和鉑-金。

電壓源可以向工作電極14和參考電極16和/或?qū)﹄姌O12施加電壓電位，取決于傳感器10的設(shè)計(jì)?？衫脺y(cè)量裝置或計(jì)量器來(lái)測(cè)量工作電極14與對(duì)電極16之間的電流。該電流是由于在工作電極12處反應(yīng)溶液和身體樣本的混合物中NAD⁺的還原引起的且提供在檢測(cè)區(qū)域中。

所測(cè)量的電流的量或水平與反應(yīng)溶液和身體樣本的混合物中的NAD+的水平或量成比例。在一些實(shí)施方案中，樣本是從患有或懷疑患有神經(jīng)損傷的受試者獲得的身體樣本，一旦確定了用傳感器測(cè)試的反應(yīng)溶液產(chǎn)生的電流水平，則可以將該水平與預(yù)定值或?qū)φ罩当容^以提供用于診斷或監(jiān)測(cè)受試者中的神經(jīng)損傷的信息。例如，可以將電流水平與預(yù)定值或?qū)φ罩颠M(jìn)行比較，以確定受試者是否具有TBI。與預(yù)定值或?qū)φ罩迪啾仍黾拥碾娏魉娇梢灾甘臼茉囌呔哂蠺BI；而與預(yù)定值或?qū)φ罩迪啾认嗨苹蚪档偷碾娏魉娇梢灾甘臼茉囌叩腡BI的不存在。

反應(yīng)溶液和從受試者獲得的身體樣本的混合物所產(chǎn)生的電流水平可以與反應(yīng)溶液和先前從受試者獲得(例如在施用治療劑之前)的身體樣本的混合物的電流水平比較。因此，本文所述的方法可用于通過(guò)比較治療方案之前和之后獲得的電流水平來(lái)測(cè)量治療與受試者的神經(jīng)損傷相關(guān)的病癥，病理學(xué)或病癥的治療方案的功效。另外，本文所述的方法可用于通過(guò)比較在給定時(shí)間段(例如天，周，月或年)內(nèi)獲得的身體樣本中的電流水平來(lái)測(cè)量受試者中的神經(jīng)損傷的進(jìn)展。

由反應(yīng)溶液和受試者的身體樣本的混合物產(chǎn)生的電流水平也可以與預(yù)定值或?qū)φ罩当容^，以提供用于確定受試者中神經(jīng)損傷的嚴(yán)重性的信息。預(yù)定值或?qū)φ罩悼梢曰趶慕】祷蛘Ｊ茉囌呋蛞话闳后w或從對(duì)照受試者的選擇群體獲得的可比較樣本中的電流水平。

預(yù)定值可以采取各種形式。預(yù)定值可以是單個(gè)截止值，例如中值或平均值。預(yù)定值可以基于比較組來(lái)建立，諸如其中一個(gè)定義的組中的電流水平是另一個(gè)定義的組中的電流水平的兩倍。預(yù)定值可以是這樣的范圍，例如，其中一般受試者群體被均等地(或不等地)劃分成組或劃分為象限，最低象限是具有最低電流水平的受試者，最高象限是具有最高電流水平的個(gè)體。在示例性的實(shí)施方案中，選擇兩個(gè)截止值以最小化錯(cuò)誤肯定和錯(cuò)誤否定結(jié)果的比率。

圖1和圖2中所示的生物傳感器可以在由聚酯或其他非導(dǎo)電材料制作在襯底100上，例如其它聚合物材料，氧化鋁(Al₂O₃)，陶瓷基材料，玻璃或半導(dǎo)電襯底(例如硅，氧化硅和其它覆蓋的襯底)。因此，多個(gè)傳感器器件102可以形成在公共襯底100(圖2)上。如將理解的，可以設(shè)想電極的幾何形狀和尺寸的變化。

生物傳感器可以使用薄膜，厚膜和/或噴墨印刷技術(shù)制造，特別是用于在襯底上沉積多個(gè)電極。薄膜工藝可以包括物理或化學(xué)氣相沉積。用于其制造的電化學(xué)傳感器和厚膜技術(shù)在C.C.Liu等人的美國(guó)專利No.4,571,292、C.C.Liu的美國(guó)專利No.4,655,880，以及共同未決的美國(guó)申請(qǐng)序號(hào)No.09/466,865中進(jìn)行了論述，這些參考文獻(xiàn)全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。例如，在碳電極的情況下，將活性炭與結(jié)合劑混合，如墨水一樣沉積在襯底上，并使其干燥。

在一些實(shí)施例中，工作電極，對(duì)電極和參考電極可以使用激光燒蝕形成，該工藝可以產(chǎn)生具有小于千分之一英寸的特征的元件。激光燒蝕使得能夠精確限定工作電極、對(duì)電極和參考電極以及電連接引線和其他特征，這是減小變異系數(shù)以及提供精確測(cè)量所需要的?？梢允褂眉す鉄g來(lái)照射金屬化膜，例如Au，Pd和Pt或具有類似電化學(xué)性質(zhì)的任何金屬，其可以濺射或涂覆在塑料襯底(例如PET或聚碳酸酯或其它介電材料)上，以提供這些特征。

在一個(gè)實(shí)施例中，可以通過(guò)濺射技術(shù)沉積厚度為約300A至約2000A的金膜，從而產(chǎn)生非常均勻的層，該非常均勻的層可以被激光燒蝕以形成工作電極和對(duì)電極。對(duì)電極可以使用其它材料。然而，為了制造的簡(jiǎn)單性，對(duì)于工作電極和對(duì)電極使用相同的材料將簡(jiǎn)化制造工藝，從而提供在單個(gè)處理步驟中生產(chǎn)兩個(gè)電極的可行性。然后，可以使用厚膜絲網(wǎng)印刷技術(shù)印刷Ag/AgCl參考電極、絕緣層和電連接部件。

圖3和圖4示出了檢測(cè)系統(tǒng)可以用于檢測(cè)溶液中的PDH。在初步測(cè)試中，使用3μM的丙酮酸溶液(濃度為375μM)和3μl的NADH(濃度為375μM)，其中PDH體積為2μl，濃度從0至7.5μM變化。結(jié)果如圖3和圖4所示，使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。類似于PBS中的初步測(cè)試，在人工唾液而不是PBS中進(jìn)行的、使用3μL丙酮酸溶液(濃度375μM)和3μL的NADH(濃度375μM)的基質(zhì)材料和濃度從0-7.5μM變化的2μL的PDH體積的初始研究可以用于表明唾液是可以容易地用于實(shí)時(shí)檢測(cè)TBI的生物流體。

在其他實(shí)施方案中，檢測(cè)系統(tǒng)可以包括其他生物傳感器，其可以檢測(cè)指示來(lái)自受試者的身體樣本中的神經(jīng)損傷，例如創(chuàng)傷性腦損傷的除了PDH之外的其他生物標(biāo)志物。這些其他生物標(biāo)志物可包括例如S100B，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和分泌肌動(dòng)蛋白(例如SCGN，SEGN，CALBL或setgin)。這些生物傳感器可以包括襯底，形成在襯底表面上的工作電極，形成在襯底表面上的對(duì)電極，覆蓋工作電極和反電極的一部分并且限定暴露工作電極和反電極的其它部分的孔口的介電層。工作電極可以被官能化或化學(xué)官能化以包括用于至少一種感興趣的生物標(biāo)志物的受體。受體可以選擇性結(jié)合來(lái)自受試者的身體樣本中的指示神經(jīng)損傷一種或多種感興趣的生物標(biāo)志物。

檢測(cè)系統(tǒng)還可以包括用于向工作電極，對(duì)電極和/或參考電極施加電壓電勢(shì)并測(cè)量工作電極和對(duì)電極之間的電流的測(cè)量裝置?？梢允褂秒娀瘜W(xué)分析技術(shù)(例如循環(huán)伏安法(CV)，差分脈沖伏安法(DPV))檢測(cè)生物標(biāo)志物和受體的相互作用，以確定身體樣本中生物標(biāo)志物的存在以及受試者是否具有神經(jīng)損傷或受試者的神經(jīng)損傷的程度。

在一些實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合其指示神經(jīng)損傷的生物標(biāo)志物的受體是優(yōu)先結(jié)合該生物標(biāo)志物的分子(即，其對(duì)該生物標(biāo)志物的結(jié)合親和力大于其對(duì)任何其它生物標(biāo)志物的結(jié)合親和力)。其對(duì)感興趣的生物標(biāo)志物的結(jié)合親和力可以比對(duì)于任何其它生物標(biāo)志物的結(jié)合親和力大2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，15倍，20倍，25倍，30倍，40倍，50倍，100倍或更多。除了其相對(duì)結(jié)合親和力之外，受體還必須具有足夠高以有效結(jié)合感興趣的生物標(biāo)志物的絕對(duì)結(jié)合親和力(即，其必須具有足夠的靈敏度)。具有皮摩爾至微摩爾范圍內(nèi)的結(jié)合親和力的受體是合適的。這種相互作用可以是可逆的。

受體可以是任何性質(zhì)(例如，化學(xué)，核酸，肽，脂質(zhì)，其組合等)。指示神經(jīng)損傷的生物標(biāo)記物也可以是任何性質(zhì)的，只要存在選擇性與其結(jié)合并且在一些情況下具體地與其結(jié)合的受體即可。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“官能化”或“化學(xué)官能化”是指通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將官能團(tuán)加成到材料的表面上。如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的，官能化可以用于材料的表面改性，以實(shí)現(xiàn)所需的表面性質(zhì)，例如生物相容性，潤(rùn)濕性等。類似地，本文所用的術(shù)語(yǔ)“生物官能化”，“生物官能化的”等意指對(duì)材料表面的改性，使得其具有所需的生物學(xué)功能，這將是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的，如生物工程。

受體可以共價(jià)或非共價(jià)地官能化為工作電極。受體與工作電極的共價(jià)附著可以是直接或間接的(例如通過(guò)連接子)。受體可以使用連接子固定在工作電極上。連接子可以是可用于連接多種實(shí)體的連接子。

在一些實(shí)施方案中，連接子可以是同雙功能連接子或異雙功能連接子，這取決于待綴合的分子的性質(zhì)。同雙功能連接子具有兩個(gè)相同的反應(yīng)基團(tuán)。異雙功能連接子具有兩個(gè)不同的反應(yīng)基團(tuán)。各種類型的市售連接子與一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)反應(yīng)：伯胺，仲胺，巰基，羧基，羰基和碳水化合物。胺特異性連接子的實(shí)例是雙(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯，雙[2-(琥珀酰亞氨基氧基羰基氧基)乙基]砜，辛二酸二琥珀酰亞胺酯，酒石酸二琥珀酰亞胺酯，己二酸二甲酯2HCl，二甲基庚二酰亞胺2HCl，二鹽酸二甲酯HCl，乙二醇雙-[琥珀酰亞胺基-[琥珀酸]]，二硫代雙(丙酸琥珀酰亞胺酯)和3,3'-二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯)。與巰基反應(yīng)的連接子包括雙馬來(lái)酰亞胺己烷，1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基]]丁烷，1-[對(duì)疊氮基水楊酰胺基]-4-[碘乙酰氨基]丁烷和N-[4-(對(duì)疊氮基水楊酰胺基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺。優(yōu)選與碳水化合物反應(yīng)的連接子包括疊氮苯甲酰肼。優(yōu)選與羧基反應(yīng)的連接子包括4-[對(duì)疊氮基水楊酰胺基丁胺]。

與胺和巰基反應(yīng)的異雙功能連接子包括N-琥珀酰亞胺基-3-[2-吡啶基二硫代]丙酸酯，琥珀酰亞胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯，琥珀酰亞胺基4-[N-馬來(lái)酰亞胺甲基]環(huán)己烷-1-羧酸酯，m-馬來(lái)酰亞胺基苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯，6-[3-[2-吡啶基二硫代]丙酰胺基]己酸磺基琥珀酰亞胺酯和4-[N-馬來(lái)酰亞胺基甲基]環(huán)己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯。與羧基和胺基反應(yīng)的異雙官能連接子包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳二亞胺鹽酸鹽。與碳水化合物和巰基反應(yīng)的異雙功能連接子包括4-[N-馬來(lái)酰亞胺甲基]-環(huán)己烷-1-羧基酰肼HCl，4-(4-N-馬來(lái)酰亞胺基苯基)-丁酸酰肼.2HCl和3-[2-吡啶基二硫基]丙酰肼。

可替代地，受體可以非共價(jià)地涂敷到工作電極上。受體至工作電極的非共價(jià)沉積可涉及使用聚合物基質(zhì)。聚合物可以是天然存在的或非天然存在的，并且可以是任何類型的，包括但不限于核酸(例如DNA，RNA，PNA，LNA等或其模擬物，衍生物或組合)，氨基酸(例如肽，蛋白質(zhì)(天然的或變性的)等)或其模擬物，衍生物或組合，脂質(zhì)，多糖和官能化嵌段共聚物。受體可以吸附到和/或包埋在聚合物基質(zhì)內(nèi)。

可替代地，受體可以與聚合物共價(jià)綴合或交聯(lián)(例如，其可以“接枝”到官能化聚合物上)。

合適的肽聚合物的實(shí)例是聚賴氨酸(例如聚-L-賴氨酸)。其它聚合物的實(shí)例包括包含聚乙二醇(PEG)，聚酰胺，聚碳酸酯，聚烷撐，聚亞烷基二醇，聚環(huán)氧烷，聚對(duì)苯二甲酸亞烷基酯，聚乙烯醇，聚乙烯醚，聚乙烯酯，聚乙烯鹵化物，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯，烷基纖維素，羥烷基纖維素，纖維素醚，纖維素酯，硝基纖維素，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纖維素，乙基纖維素，羥丙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羥丁基甲基纖維素，乙酸纖維素，丙酸纖維素，乙酸丁酸纖維素，乙酸鄰苯二甲酸纖維素，羧乙基纖維素，三乙酸纖維素，硫酸纖維素鈉鹽，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸乙酯，聚甲基丙烯酸丁酯，聚甲基丙烯酸異丁酯，聚甲基丙烯酸己酯，聚甲基丙烯酸異癸酯，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸異丙酯)，聚(丙烯酸異丁酯)，聚(丙烯酸十八酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(環(huán)氧乙烷)，聚(對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)，聚(乙烯醇)，聚乙酸乙烯酯，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚透明質(zhì)酸，酪蛋白，明膠，谷蛋白，聚酐，聚丙烯酸，藻酸鹽，殼聚糖，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(甲基丙烯酸乙酯)，聚(甲基丙烯酸丁酯)，聚(甲基丙烯酸異丁酯)，聚(甲基丙烯酸己酯)，聚(甲基丙烯酸異癸酯)，聚(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸異丙酯)，聚(丙烯酸異丁酯)和聚(丙烯酸十八烷基酯)，聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸酯，聚己內(nèi)酯，聚酯酰胺，聚原酸酯，聚羥基丁酸，聚酐，聚(苯乙烯-b-異丁烯-b-苯乙烯)(SIBS)嵌段共聚物，乙烯乙酸乙烯酯，聚(甲基)丙烯酸，乳酸和乙醇酸的聚合物、聚酸酐，聚(鄰)酯，聚氨酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)和聚(丙交酯-共聚己內(nèi)酯)，和天然聚合物如藻酸鹽和其它多糖，包括葡聚糖和纖維素，膠原，白蛋白和其它親水蛋白，玉米蛋白和其它谷醇溶蛋白和疏水蛋白，其共聚物和混合物，及其化學(xué)衍生物，包括化學(xué)基團(tuán)的取代和/或添加，例如烷基，亞烷基，羥基化，氧化以及本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)制備的其它改性。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，工作電極可以包括化學(xué)交聯(lián)或生物素化的工作電極，以允許連接抗體或含生物素的分子。金制工作電極可以例如與二硫醇雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)(DSP)交聯(lián)，其包含可與蛋白質(zhì)和抗體的胺基團(tuán)反應(yīng)的胺反應(yīng)性N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯。

應(yīng)當(dāng)理解，化學(xué)官能化的靈活性使得生物傳感器可用于基本上連接對(duì)生物標(biāo)記具有親和性的任何配體。因此，具有親和性的配體可連接到工作電極的生物標(biāo)志物的實(shí)例包括但不限于DNA，寡核苷酸，蛋白質(zhì)，生物素和鏈霉親和素。蛋白質(zhì)配體包括單克隆抗體(mAB)；然而酶基質(zhì)也可以用作對(duì)相應(yīng)酶的具有親和力的配體。

在一些實(shí)施方案中，工作電極通過(guò)mAB上的反應(yīng)性氨基用單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段官能化。因?yàn)榇蠖鄶?shù)抗體具有賴氨酸基團(tuán)，所以它們可以在賴氨酸氨基處連接到裝置。

化學(xué)官能化方法還使得能夠具有氨基的DNA適體的生物綴合。這些適體可以潛在地結(jié)合小分子和蛋白質(zhì)。一旦結(jié)合，工作電極表面上的電荷的變化將使得該裝置能夠檢測(cè)靶生物分子或小分子。

類似于圖1所示的用于檢測(cè)PDH的生物傳感器，用于檢測(cè)指示神經(jīng)損傷的除了PDH之外的其他生物標(biāo)志物的生物傳感器，可以使用特別是用于在襯底上沉積多個(gè)電極的薄膜，厚膜和/或噴墨印刷技術(shù)來(lái)制造。薄膜工藝可以包括物理或化學(xué)氣相沉積。

在一些實(shí)施例中，這些傳感器的工作電極，對(duì)電極和參考電極可以使用激光燒蝕形成，該工藝可以產(chǎn)生具有小于千分之一英寸的特征的元件。可以使用激光燒蝕來(lái)照射金屬膜，例如Au，Pd和Pt或具有類似電化學(xué)性質(zhì)的任何金屬，其可以濺射或涂布在塑料襯底(例如PET或聚碳酸酯或其它介電材料)上，以提供這些特征。

在其他實(shí)施例中，檢測(cè)系統(tǒng)可以包括可以以陣列形式設(shè)置在襯底的表面上的多個(gè)生物傳感器。生物傳感器陣列可以被配置為檢測(cè)受試者的身體樣本中的NAD+濃度變化以及指示性神經(jīng)損傷的其他分析物的濃度。生物傳感器陣列可以包括布置成多行和多列的多個(gè)生物傳感器。每個(gè)生物傳感器包括在工作電極和對(duì)電極上。工作電極可以被官能化或化學(xué)官能化以包括用于至少一種感興趣分析物的受體。對(duì)于陣列的每個(gè)生物傳感器，受體可以是相同的或不同的，并且可以選擇性地結(jié)合一種或多種感興趣分析物。陣列的生物傳感器可以被配置為提供表示身體樣本中分析物的存在和/或濃度的至少一個(gè)輸出信號(hào)。對(duì)于所述多個(gè)列中的每一列或所述多個(gè)行中的每一行，所述陣列進(jìn)一步包括經(jīng)配置以向所述列或行中的相應(yīng)生物傳感器提供電壓電位的列或行電路。行或列中的每個(gè)生物傳感器可以潛在地檢測(cè)不同的分析物和/或偏置以檢測(cè)不同的分析物。

從本發(fā)明的上述描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到改進(jìn)、變化和修改。本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的這些改進(jìn)、變化和修改旨在由所附權(quán)利要求覆蓋。本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)、出版物和專利通過(guò)引用整體并入本文。