肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)和破傷風梭菌(Clostridiumtetani)分別產(chǎn)生強效的神經(jīng)毒素，即肉毒毒素(BoNT)和破傷風毒素(TeNT)。這些梭菌神經(jīng)毒素(CNT)特異性地結合至神經(jīng)元細胞并干擾神經(jīng)遞質(zhì)釋放。每種毒素都作為無活性未加工的約150kDa的單鏈蛋白質(zhì)合成。翻譯后加工涉及二硫橋的形成，和通過細菌蛋白酶的限制性蛋白水解(產(chǎn)生切口)?；钚陨窠?jīng)毒素由兩條鏈組成，即通過二硫鍵連接的約50kDa的N端輕鏈和約100kDa的重鏈。CNT在結構和功能上由三個結構域組成，即催化輕鏈、包含易位結構域(N端半部)的重鏈和受體結合結構域(C端半部)；參見，例如Krieglstein1990，Eur.J.Biochem.188，39；Krieglstein1991，Eur.J.Biochem.202，41；Krieglstein1994，J.ProteinChem.13，49。肉毒神經(jīng)毒素作為包含150kDa神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)和相關無毒蛋白質(zhì)的分子絡合物合成。絡合物的大小根據(jù)梭菌菌株和不同神經(jīng)毒素血清型而為300kDa、大于500kDa、和900kDa不等。這些絡合物中的無毒蛋白質(zhì)使神經(jīng)毒素穩(wěn)定并保護其免于降解；參見Silberstein2004，PainPractice4，S19-S26。肉毒梭菌分泌七種抗原性不同的血清型，命名為肉毒神經(jīng)毒素(BoNT)A至G。所有血清型以及由破傷風梭菌分泌的相關破傷風毒素(TeNT)都是Zn2+-內(nèi)切蛋白酶，其通過切割SNARE蛋白質(zhì)來阻斷突觸的胞外分泌；參見Couesnon，2006，Microbiology，152，759。CNT導致見于肉毒中毒和破傷風的弛緩性肌肉麻痹；參見Fischer2007，PNAS104，10447。盡管有毒性作用，肉毒毒素絡合物已經(jīng)被用作許多疾病的治療劑。肉毒毒素血清型A在美國于1989年被批準供人類使用，用于治療斜視、眼瞼痙攣和其他病癥。它作為肉毒毒素A(BoNT/A)蛋白質(zhì)制劑可以例如以商品名BOTOX(Allergan，Inc)或以商品名DYSPORT/RELOXIN(Ipsen，Ltd)商購獲得。改進的無絡合物的肉毒毒素A制劑可以以商品名XEOMIN(MerzPharmaceuticals，LLC)商購獲得。對于治療應用，將制劑直接注射到要治療的肌肉中。在生理pH下，毒素從蛋白質(zhì)絡合物釋放并產(chǎn)生期望的藥理學作用。肉毒毒素的作用只是暫時的，這是可能需要肉毒毒素的重復施用以保持治療作用的原因。梭菌神經(jīng)毒素使隨意肌力量減弱，且對于斜視、包括頸肌張力障礙的局部肌張力障礙、和良性原發(fā)性眼瞼痙攣是有效的療法。已進一步顯示它們減輕偏側(cè)面肌痙攣和局部痙攣，此外，其對于廣范圍的其他適應癥是有效的，例如胃腸紊亂、多汗癥和美容除皺；參見Jost2007，Drugs67，669。在梭菌神經(jīng)毒素的生產(chǎn)過程中，所述神經(jīng)毒素的定性和定量測定以及有生物活性的神經(jīng)毒素多肽的質(zhì)量控制是特別重要的。此外，政府機構只接受穩(wěn)健、準確、精確、可靠和經(jīng)過驗證的肉毒毒素效價檢測。目前小鼠LD50生物測定，一種致死率試驗，仍然是制藥商用來分析其制劑的效價的“金標準”；參見Arnon等人(2001)，JAMA285，1059-1070。然而，在近幾年中，已經(jīng)進行大量努力來尋找替代途徑以減少對動物試驗的需要以及與這種基于動物的試驗相關的全部缺點、成本和倫理問題。另外，監(jiān)管機構要求制藥公司對肉毒神經(jīng)毒素的效價試驗應用三“R”原則：“減少、優(yōu)化、替代(Reduce，Refine，Replace)”；參見Straughan，Altern.Lab.Anim.(2006)，34，305-313。因此，已經(jīng)開發(fā)了基于細胞的試驗系統(tǒng)以提供對使用活體動物的方法的合理替代方案。然而，迄今只有三種已表現(xiàn)出對神經(jīng)毒素多肽足夠敏感的細胞試驗系統(tǒng)可用于測定神經(jīng)毒素的生物活性。這些基于細胞的試驗系統(tǒng)包括使用從嚙齒動物胚胎分離的在體外分化的原代神經(jīng)元(Pellett等人(2011)，Biochem.Biophys.Res.Commun.404，388-392)、神經(jīng)元分化的誘導多能干細胞(Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35)和衍生自SiMa細胞系的克隆(WO2010/105234A1)。然而，原代神經(jīng)元的分離需要殺害動物并且是費力、費時的，且這些檢測的驗證似乎是個挑戰(zhàn)。此外，使用不同原代神經(jīng)元的試驗系統(tǒng)表現(xiàn)出大的變化。相似地，神經(jīng)元分化的誘導多能干細胞的生成是困難的且費時的。此外，這種細胞的儲存是很成問題的。使用腫瘤細胞系的檢測通常對BoNT不夠敏感。此外，所述腫瘤細胞系需要復雜的分化方案，這導致使用所述細胞系的檢測的大的變化和/或高失敗率。根據(jù)上文，非常期望用于測定神經(jīng)毒素多肽活性的其他試驗系統(tǒng)。因此，本發(fā)明的技術問題可被認為是提供滿足前述需求的手段和方法。通過在權利要求和下文中表征的實施方案解決了該技術問題。在第一個方面，本發(fā)明涉及用于生成對神經(jīng)毒素多肽具有標準化敏感性的誘導多能干細胞(IPS)衍生的神經(jīng)元的方法，其包括以下步驟：a)提供不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元；b)在包含GT1b的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟a)的不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元至少3小時；由此使誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性標準化。在該方面，在第一個步驟中提供不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元。這些批次可以在例如傳代數(shù)和/或冷凍/解凍循環(huán)的次數(shù)和/或在本文其他地方提到的其他特性上有所不同。然后，將不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元在包含GT1b的合適的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少3小時、至少4小時、至少5小時、至少6小時、至少12小時、至少24小時(1天)、至少36小時、至少48小時(2天)、至少72小時(3天)、至少4天、至少5天或甚至更長。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)持續(xù)幾小時，例如3小時、4小時、5小時、6小時或12小時。可以使用例如包含B27添加物的培養(yǎng)基、神經(jīng)元培養(yǎng)基(CellularDynamicsinternational；CDI)或由誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元的制造商或供應商提供的其他細胞培養(yǎng)基作為合適的細胞培養(yǎng)基。由此，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，如下文更詳細闡述的，與未經(jīng)GT1b處理的對照批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元相比，不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的變異性可以顯著減小。在另一個方面，本發(fā)明的上述方法還包括c)使步驟b)的不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元與神經(jīng)毒素多肽接觸；d)在允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物活性的條件下，在GT1b存在下培養(yǎng)步驟c)的不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元至少24小時。在包含GT1b的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元至少3小時后，在下個步驟中可以先使不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元與神經(jīng)毒素多肽接觸再用神經(jīng)毒素多肽使其中毒至少24小時(1天)、至少36小時、至少48小時(2天)、至少60小時、至少72小時(3天)、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天(1周)、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周或甚至更長時間。優(yōu)選地，中毒持續(xù)至少72小時或更長時間。如在本文其它地方更詳細定義的，神經(jīng)毒素多肽可以是，例如，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或TeNT或其亞型。在允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物活性的條件下，在GT1b存在下將不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元培養(yǎng)上述時間。允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物活性的合適細胞培養(yǎng)條件和神經(jīng)毒素多肽的生物活性是如本文其它地方所定義的。通過該處理，與未經(jīng)GT1b處理的對照批次的中毒誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元相比，該不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元對所述神經(jīng)毒素多肽的敏感性的變異性可以進一步減小。在進一步的方面，本發(fā)明涉及用于使誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性標準化的方法，其包括以下步驟：a)在包含GT1b的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元至少3小時；b)使步驟a)的不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元與神經(jīng)毒素多肽接觸；c)在允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物活性的條件下，在GT1b存在下培養(yǎng)步驟b)的不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元至少24小時；從而使誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性標準化。在進一步的方面，本發(fā)明的前述方法可以包括一個或更多個另外的步驟。例如，所述另外的步驟可以包括用于測定如本文定義的神經(jīng)毒素多肽的生物活性的步驟。為此，使如本文描述的已在GT1b存在下培養(yǎng)的誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元與如本文定義的神經(jīng)毒素多肽接觸。根據(jù)本發(fā)明的方法使用的術語“接觸”是指使前述細胞和可能包含在例如樣品中的神經(jīng)毒素多肽物理接近以允許物理和/或化學和/或生物相互作用。允許特異性相互作用的合適條件是本領域技術人員所熟知的。所述條件將取決于在本發(fā)明方法中應用的細胞和神經(jīng)毒素，且可以由技術人員不用再費周折地調(diào)整。此外，允許相互作用的足夠時間也可以由技術人員不用再費周折地確定。例如，可以將具體量的如本文定義的分離的或重組的神經(jīng)毒素多肽或其變體或者包含神經(jīng)毒素多肽的樣品添加到經(jīng)GT1b處理的誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元。此后，在允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物活性的條件下，還在GT1b存在下將細胞與神經(jīng)毒素多肽孵育至少24小時。本文使用的“允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物學活性的條件”是本領域已知的。然后，例如通過向細胞添加裂解緩沖液停止生物活性的發(fā)揮，并通過例如特異性檢測切割的神經(jīng)毒素底物的Western印跡分析或特異性ELISA技術測定神經(jīng)毒素多肽的生物活性。例如，SNAP-25是BoNT/A、BoNT/C1和BoNT/E的已知底物且被其切割。VAMP/小突觸泡蛋白是BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G和TeNT的底物且被其切割，而突觸融合蛋白是BoNT/C1的底物且被其切割。梭菌神經(jīng)毒素的特征在于其特異性抑制神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前神經(jīng)末梢分泌。通過識別兩種不同受體SV2和GT1b來調(diào)節(jié)對周圍神經(jīng)元的選擇性。神經(jīng)毒素的生理作用是基于在受體結合和神經(jīng)毒素的輕鏈易位之后被稱為SNARE絡合物的蛋白質(zhì)的切割。測定BoNT生物活性是在所述神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)的表征中的重要方面，并且尤其地是監(jiān)管機構對含有BoNT的產(chǎn)品的商業(yè)發(fā)布的要求。因此，用于測量BoNT生物活性的可靠試驗是含有BoNT的產(chǎn)品的研究、開發(fā)和上市的基礎。此外，由于倫理原因，基于細胞的試驗系統(tǒng)會取代目前占主導地位的動物試驗。為了建立這種基于細胞的試驗系統(tǒng)，對肉毒神經(jīng)毒素有足夠高敏感性的神經(jīng)元細胞或細胞系是必要的。為了測定藥物產(chǎn)品中肉毒毒素的生物活性，神經(jīng)元細胞或神經(jīng)元細胞系應該具有以下特性：第一，細胞應該是人類、神經(jīng)元來源的以與目標即人類患者盡可能相似。第二，細胞系統(tǒng)對最終產(chǎn)品中的賦形劑應該是穩(wěn)健的，優(yōu)選地對生產(chǎn)過程的中間階段的雜質(zhì)也是穩(wěn)健的(過程控制)。第三，基于細胞的試驗系統(tǒng)應該表現(xiàn)出允許準確測定小瓶中BoNT(例如，50LD50UBoNT/A)的生物活性的動態(tài)測量范圍?？紤]到技術因素如賦形劑的溶解性、細胞培養(yǎng)基的體積等，小于1pM的BoNT濃度必須被準確地測定。對BoNT具有足夠高的敏感性的可用的基于細胞的試驗系統(tǒng)之一使用神經(jīng)元分化的誘導多能干細胞。本發(fā)明人已經(jīng)對使用市售的人類誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元(CellularDynamicsInternational，Inc.，麥迪遜)的試驗系統(tǒng)進行評估。所述人類誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元已經(jīng)以冷凍保存的細胞的形式獲得，并根據(jù)制造商手冊解凍和培養(yǎng)4天。所述細胞最終分化為神經(jīng)元細胞，該神經(jīng)元細胞的特征在于它們不再增殖且表現(xiàn)出不能再被改變的、終末分化的神經(jīng)元表型。在已形成所述表型后，將細胞與神經(jīng)毒素多肽孵育72小時。此后，通過如對神經(jīng)毒素多肽BoNT/A和其底物SNAP-25所例舉的細胞裂解物的Immuno-Western印跡分析或ELISA法對神經(jīng)毒素底物切割產(chǎn)物進行定量。作為評估所述試驗的結果，只要使用所述供應商的相同細胞批次來進行試驗，則可以確定所述試驗系統(tǒng)的高敏感性、高再現(xiàn)性和高中間精密度。然而，當使用所述供應商的不同細胞批次時，發(fā)現(xiàn)所述細胞對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的無法解釋的高變異性，然而供應商的所述細胞批次關于細胞數(shù)量、生命力、表型等的特征不能給出關于提及的變異性的任何線索。具體地，供應商的不同細胞批次的人類誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元的敏感性(EC50)在1.7U/ml至大于10U/ml變化。本發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)神經(jīng)節(jié)苷脂如GT1b的外部應用導致不同細胞批次的人類誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元之間敏感性的變異性大幅減小。這個發(fā)現(xiàn)是非同尋常的，原因如下：首先，表現(xiàn)出神經(jīng)元表型的細胞自身內(nèi)源性地產(chǎn)生足夠的GT1b。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)原代神經(jīng)元是這樣。此外，在本發(fā)明人的經(jīng)驗中，甚至原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物的不同制劑也沒有表現(xiàn)出對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的這種變異性。此外，在其中例如已使用SiMa細胞的基于神經(jīng)母細胞瘤細胞系的試驗中未能觀察到這種作用，對于不同傳代數(shù)或測試不同冷凍保存批次時都未能觀察到。其次，CellularDynamicsInternational的供應商手冊不含關于不同細胞批次的人類誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的這種變異性的任何信息。當使用本發(fā)明的方法時，通過在已被添加到細胞培養(yǎng)基的30μM的GT1b存在下進行培養(yǎng)和神經(jīng)毒素孵育，本發(fā)明人可以有利地使所述變異性從約30％減小至約15％(標準偏差)。因此，本發(fā)明的方法提供敏感的、準確的、可再現(xiàn)的基于細胞的試驗系統(tǒng)，用以測定神經(jīng)毒素的生物活性。所述方法可以用作常規(guī)基于動物的試驗系統(tǒng)的替代方案。另外，本發(fā)明的用于使人類誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性標準化的相對簡單的方法導致所述細胞的提高的敏感性：然而對于未添加GT1b的細胞已發(fā)現(xiàn)相當于167fM的約5U/ml的EC50，對于已向細胞培養(yǎng)基添加GT1b的細胞已發(fā)現(xiàn)相當于25fM的約0.75U/ml的EC50，這相當于敏感性增加到約7倍。因此，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)與在GT1b不存在下培養(yǎng)的人類誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元相比，人類誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性可以通過GT1b的添加而增加。具體地，每個單批次的人類誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元的敏感性可以通過用所述神經(jīng)節(jié)苷脂孵育而得到提高。令人關注地，親代SiMa細胞對神經(jīng)毒素多肽的敏感性也可以通過GT1b的添加而得到增強。在這種情況下，與未經(jīng)GT1b處理的SiMa細胞相比，可以使所述神經(jīng)母細胞瘤細胞的敏感性增加到10倍。這些結果不是無關緊要的工作或不證自明的發(fā)現(xiàn)，因為如在以下實施例中證明的，其他神經(jīng)母細胞瘤細胞如Neuro2a在用GT1b孵育后沒有表現(xiàn)出對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的可比較的增加，或僅略有增加，例如SH-SY5Y(DSMZ和ECACC)、PC12、或NG108-15細胞。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及用于生成對神經(jīng)毒素多肽具有增加的敏感性的誘導多能干細胞(IPS)衍生的神經(jīng)元或SiMa細胞的方法，其包括以下步驟：a)提供誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元或SiMa細胞；b)在包含GT1b的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟a)的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元或SiMa細胞至少3小時，從而增加誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元或SiMa細胞對所述神經(jīng)毒素多肽的敏感性。在進一步的方面，通過該方法，可以產(chǎn)生對神經(jīng)毒素多肽具有增加的敏感性的SH-SY5Y細胞、PC12細胞或NG108-15細胞。在又一個方面，本發(fā)明的上述方法還包括c)使步驟b)的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元或SiMa細胞與神經(jīng)毒素多肽接觸；d)在允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物活性的條件下，在GT1b存在下培養(yǎng)誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元或SiMa細胞至少24小時?；蛘?，如上文所述，SH-SY5Y細胞、PC12細胞或NG108-15細胞可以用于本發(fā)明的方法的這個方面。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于測定神經(jīng)毒素多肽的生物活性的方法，其包括以下步驟：a)在包含GT1b的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元或SiMa細胞至少3小時；b)使步驟a)的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元或SiMa細胞與神經(jīng)毒素多肽接觸；c)在允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物活性的條件下，在GT1b存在下培養(yǎng)步驟b)的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元或SiMa細胞至少24小時；d)測定所述細胞中神經(jīng)毒素多肽的生物活性。或者，在本發(fā)明該方法的其他方面，SH-SY5Y細胞、PC12細胞或NG108-15細胞可以用于測定神經(jīng)毒素多肽的生物活性。優(yōu)選地，單批次的所述誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元、SiMa細胞、SH-SY5Y細胞、PC12細胞或NG108-15細胞在本發(fā)明的方法中用于生成對神經(jīng)毒素多肽具有增加的敏感性的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元、SiMa細胞、SH-SY5Y細胞、PC12細胞或NG108-15細胞，或在本發(fā)明的方法中用于增加本發(fā)明中所述細胞的敏感性。優(yōu)選地，SiMa細胞是親代SiMa細胞(DSMZ號ACC164)。優(yōu)選地，GT1b的濃度是10至50μM，更優(yōu)選30μM。在包含GT1b的細胞培養(yǎng)基中將誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元、SiMa細胞、SH-SY5Y細胞、PC12細胞或NG108-15細胞培養(yǎng)優(yōu)選地至少12小時、至少24小時、至少36小時、至少48小時、至少60小時、至少72小時或至少96小時、或甚至更長時間。用神經(jīng)毒素多肽中毒優(yōu)選地進行至少36小時、48小時、60小時、72小時、96小時或甚至更長時間。優(yōu)選地，神經(jīng)毒素多肽是BoNT/A。與未經(jīng)GT1b處理的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元相比，經(jīng)GT1b處理的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的增加優(yōu)選為至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、或至少6.7倍。進一步地，與未經(jīng)GT1b處理的SiMa相比，經(jīng)GT1b處理的SiMa細胞對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的增加優(yōu)選地為至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍。與未經(jīng)GT1b處理的SH-SY5Y細胞相比，經(jīng)GT1b處理的SH-SY5Y細胞對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的增加優(yōu)選地為至少1.2倍、至少1.4倍、至少1.6倍、至少1.8倍、或至少2倍。與未經(jīng)GT1b處理的PC12細胞相比，經(jīng)GT1b處理的PC12細胞對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的增加優(yōu)選地為至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、或至少1.4倍。此外，與未經(jīng)GT1b處理的NG108-15細胞相比，經(jīng)GT1b處理的NG108-15細胞對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的增加優(yōu)選地為至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、或至少1.6倍。本發(fā)明的方法允許待分析的含有神經(jīng)毒素的樣品的高度稀釋。進一步地，本發(fā)明的方法對待分析樣品中的賦形劑和雜質(zhì)是穩(wěn)健的，其允許所述樣品的高度稀釋。樣品的這種高度稀釋對于樣品中的賦形劑和雜質(zhì)是重要的，以便以盡可能低的濃度應用所述潛在干擾物質(zhì)。本文使用的“誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元”在廣義上意思是對神經(jīng)毒素多肽易感的細胞，所述神經(jīng)毒素多肽表現(xiàn)出顯示神經(jīng)毒素多肽特征的生物特性，即，(a)受體結合，(b)內(nèi)化，(c)跨核內(nèi)體膜進入胞質(zhì)溶膠的易位，和/或(d)對突觸泡膜融合中涉及的蛋白質(zhì)的內(nèi)切蛋白水解切割。因此，本文提到的“誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元”對神經(jīng)毒素中毒易感。更具體地，本文所指的“對神經(jīng)毒素中毒易感”意思是可以經(jīng)受神經(jīng)毒素多肽(例如BoNT/A)切割神經(jīng)毒素底物(例如BoNT/A底物SNAP-25)的全部細胞機制的細胞，全部細胞機制涵蓋神經(jīng)毒素與其相應受體的結合(例如BoNT/A與BoNT/A受體結合)、神經(jīng)毒素/受體絡合物的內(nèi)化、神經(jīng)毒素輕鏈從細胞內(nèi)囊泡進入細胞質(zhì)的易位和神經(jīng)毒素底物的蛋白水解切割。用于測定神經(jīng)毒素多肽的生物活性的試驗是本領域熟知的，并且也在本文其他地方進行描述(參見，例如Pellett等人，Withemarsh等人，同上文引用的)。如本領域技術人員理解的，神經(jīng)毒素敏感的細胞優(yōu)選地能夠首先攝取神經(jīng)毒素，然后經(jīng)受上文列出的全部細胞機制。本文使用的神經(jīng)毒素敏感的細胞可以攝取，例如約100納摩爾(nM)、約10nM、約1nM、約500皮摩爾(pM)、約400pM、約300pM、約200pM、約100pM、約90pM、約80pM、約70pM、約60pM、約50pM、約40pM、約30pM、約20pM、約10pM、約9pM、約8pM、約7pM、約6pM、約5pM、約4pM、約3pM、約2pM、約1pM、約0.5pM、約0.1pM、約50fM、約40fM、約30fM、約20fM、約10fM、約5fM、約4fM、約3fM、約2fM或約1fM的神經(jīng)毒素多肽，或甚至小于所示出的值之一。文獻中已報道100pM以上的EC50值。根據(jù)定義，對神經(jīng)毒素中毒易感的細胞必須表達、或被改造為表達至少一種神經(jīng)毒素受體和至少一種神經(jīng)毒素底物。本領域已描述了神經(jīng)毒素的受體和底物。因此，所述細胞優(yōu)選地對如本文定義的生物活性的或成熟的神經(jīng)毒素多肽易感。優(yōu)選地，本文使用的神經(jīng)毒素敏感的細胞通過例如約1nM或更少、500pM或更少、約400pM或更少、約300pM或更少、約200pM或更少、約100pM或更少、約90pM或更少、約80pM或更少、約70pM或更少、約60pM或更少、約50pM或更少、約40pM或更少、約30pM或更少、約20pM或更少、約10pM或更少、約9pM或更少、約8pM或更少、約7pM或更少、約6pM或更少、約5pM或更少、約4pM或更少、約3pM或更少、約2pM或更少、約1pM或更少、約0.9pM或更少、約0.8pM或更少、約0.7pM或更少、約0.6pM或更少、約0.5pM或更少、約0.4pM或更少、約0.3pM或更少、約0.2pM或更少、約0.1pM或更少、約50fM或更少、約40fM或更少、約30fM或更少、約20fM或更少、約10fM或更少、約5fM或更少、約4fM或更少、約3fM或更少、約2fM或更少、或甚至約1fM或更少的神經(jīng)毒素多肽而對神經(jīng)毒素中毒易感。例如，在本發(fā)明的方法中，對于已外部添加GT1b到細胞培養(yǎng)基的誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)約3fM的極低EC50值。如本領域已知的，“半最大效應濃度(EC50)”是指在一段確定的暴露時間后在誘導基線和最大值之間一半的應答的藥物、抗體或有毒物的濃度。其通常用作藥物效價的量度。因此劑量-量反應曲線的EC50表示觀察到化合物最大效應的50％的情況下的化合物濃度。劑量-質(zhì)反應曲線的EC50表示在暴露期間之后群體的50％表現(xiàn)出應答的情況下的化合物濃度。鑒定對神經(jīng)毒素中毒易感的和/或具有神經(jīng)毒素攝取能力的細胞或細胞系，即如本文定義的神經(jīng)毒素敏感的細胞的方法是本領域已知的；參見US2012/0122128A1。在一個方面，神經(jīng)毒素多肽的生物活性是因所有前述生物特性而產(chǎn)生。如本文其他地方指出的，現(xiàn)有技術至今已描述了僅幾種可用于測定神經(jīng)毒素的生物活性的、對神經(jīng)毒素具有足夠高的敏感性的基于細胞的試驗。用于評價神經(jīng)毒素的生物活性的體內(nèi)(invivo)試驗包括，例如，已經(jīng)提到的小鼠LD50試驗和半體內(nèi)(exvivo)小鼠偏側(cè)膈試驗，如Pearce等人描述的；參見Pearce1994，Toxicol.Appl.Pharmacol.128:69-77和Dressier2005，Mov.Disord.20:1617-1619。如本領域技術人員已知的，神經(jīng)毒素的生物活性通常用小鼠LD50單位(MU)表達。1MU是在腹腔內(nèi)注射后殺死確定小鼠群體的50％的神經(jīng)毒性組分的量。更具體地，文獻中描述了本文使用的“誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元”；參見，例如Whitemarsh等人，同上文引用的；WO2012/135621；US2010/0279403和US2010/0216181。特別地，人類誘導多能干細胞(hiPSC)對于為體外(invitro)產(chǎn)毒性試驗提供各種分化的細胞模型具有很好的前景。hiPSC衍生的神經(jīng)元被分化并例如由CellularDynamicsInternational(麥迪遜，威斯康星州)冷凍保存，其由主要為γ氨基異丁酸能神經(jīng)元和谷氨酸能神經(jīng)元的幾乎純的泛神經(jīng)元群體組成。所述hiPSC衍生的神經(jīng)元被稱為神經(jīng)元。根據(jù)供應商，Western印跡和定量PCR數(shù)據(jù)表明這些神經(jīng)元表達關于BoNT中毒的所有必要的受體和底物。BoNT/A中毒研究證明hiPSC衍生的神經(jīng)元以高的敏感性可再現(xiàn)地和定量地檢測有生物活性的BoNT/A。此外，證明了BoNT血清型B、C、E和BoNT/A絡合物的定量檢測，并通過抗體保護研究確認了BoNT/A特異性。使用原代大鼠脊髓細胞和hiPSC衍生的神經(jīng)元的BoNT檢測的直接比較顯示hiPSC衍生的神經(jīng)元的相同或增加的敏感性、更陡的劑量反應曲線和更完整的SNARE蛋白質(zhì)靶向切割；參見Whitemarsh等人，同上文引用的。這些數(shù)據(jù)表明，衍生自hiPSCs的神經(jīng)元為BoNT效價測定、中和抗體檢測和為機制研究提供理想的且高度敏感的平臺。在本發(fā)明方法的一方面，誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元是哺乳動物(如嚙齒動物、食蟹猴、獼猴或者黑猩猩)誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元，優(yōu)選人類誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元。優(yōu)選地，所述誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元是神經(jīng)元(CellularDynamicsInternational,Inc.(CDI))。根據(jù)供應商，神經(jīng)元衍生自人類誘導多能干細胞(iPS)，且為臨床前藥物發(fā)現(xiàn)、神經(jīng)毒性試驗和疾病研究提供獨特的體外系統(tǒng)。此外，神經(jīng)元提供高質(zhì)量和高純度的人類神經(jīng)元細胞，其具有成熟神經(jīng)元的典型表型特征和功能。歷史上，體外模型在藥物發(fā)現(xiàn)過程已起到重要作用，包括在早期疾病建模期間使用和在鑒定以及藥代動力學和安全性試驗中作為候選。由于人類大腦的復雜性，科學家目前使用簡化的模型，例如從嚙齒動物組織分離的原代細胞和轉(zhuǎn)化的細胞系。在神經(jīng)毒素領域，生物相關性、再現(xiàn)性和可擴展性的問題會出現(xiàn)，對劣質(zhì)模型的依賴可能導致直到后期臨床試驗或在市場引入之后才觀察到藥物誘導的神經(jīng)毒性。神經(jīng)元克服這些限制，為臨床前神經(jīng)毒素安全性試驗提供穩(wěn)健、良好表征的高度可再現(xiàn)的體外模型。神經(jīng)元是由人類iPS終末分化的，并表現(xiàn)出神經(jīng)元特征和功能。神經(jīng)元是高純的，其提供生物相關且可再現(xiàn)的結果。神經(jīng)元在培養(yǎng)基中保持活力和純度數(shù)周，這使得能夠評估急性和亞慢性應答兩者。進一步地，神經(jīng)元用特別為最佳細胞性能配制的細胞培養(yǎng)基冷凍保藏運輸。根據(jù)供應商手冊，它們的解凍和使用是簡單的。然而，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)不同批次的神經(jīng)元在所述批次對神經(jīng)毒素多肽的敏感性方面有極大不同。因此，對于不同批次，已得到神經(jīng)毒素生物活性測量值的極大差異。為了減小不同批次的iPS衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的變異性，根據(jù)本發(fā)明的方法可以有利地使用向細胞培養(yǎng)基外部添加GT1b。除非本文另外明確指出，否則本文使用的指示物前沒有數(shù)量詞的情況包括單個和更多個指示物。例如，“細胞”指一個或多于一個細胞。本文使用的術語“約”在對陳述的項目、數(shù)、百分比或術語的值進行定量時，是指陳述的項目、數(shù)、百分比或術語的值的正負10％、正負9％、正負8％、正負7％、正負6％、正負5％、正負4％、正負3％、正負2％或正負1％的范圍。優(yōu)選正負10％的范圍。本文使用的術語“包括”是“包含”或“含有”的同義詞，是包括性的或開放式的且不排除另外的、未列舉的成員、元素或方法步驟。顯然，術語“包括”涵蓋術語“由……組成”。更具體地，本文使用的術語“包括”意思是權利要求涵蓋全部列出的元素或方法步驟，但可以還包含另外的、未提及的元素或方法步驟。例如，包括步驟a)、b)和c)的方法在其最狹義的意義上涵蓋由步驟a)、b)和c)組成的方法。短語“由……組成”意思是組合物(或裝置，或方法)具有所列舉的元素(或步驟)且沒有其他。相比之下，術語“包括”還可以涵蓋除了步驟a)、b)和c)還包括其他步驟例如步驟d)和e)的方法。在本文使用的數(shù)值范圍情況下如“濃度為10至50μM的GT1b”，范圍不僅包括10μM和50μM，還包括10至50μM間的任何數(shù)值，例如，15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM和45μM的GT1b。本文使用的術語“體外”表示在動物或人體外面或外部。本文使用的術語“體外”應理解為包括“半體內(nèi)”。術語“半體內(nèi)”通常是指從動物或人體移出并在體外例如培養(yǎng)容器中保持或增殖的組織或細胞。本文使用的術語“體內(nèi)”表示在動物或人體里面或內(nèi)部。本文使用的術語“分化”或“分化的”表示未特化的或相對較低特化的細胞變得相對更加特化的過程。在細胞個體發(fā)生的情況下，形容詞“分化的”是相對的概念。因此，“分化的細胞”是較之與其相比較的細胞為已沿著某個發(fā)育途徑進一步發(fā)展的細胞。例如，分化的細胞可以是例如終末分化的細胞，即在有機體的各種組織和器官中發(fā)揮特化功能的完全特化的細胞，但其并不必是有絲分裂后的。例如，神經(jīng)元是從人類iPS細胞終末分化的并表現(xiàn)出神經(jīng)元的特征和功能。在另一個實例中，分化的細胞也可以是分化譜系內(nèi)的祖細胞，其可以進一步增殖和/或分化。相似地，如果細胞較之與其相比較的細胞已沿著某個發(fā)育途徑進一步發(fā)展，則該細胞是“相對更加特化的”，其中，與其相比較的細胞因此被認為是“未特化的”或“相對較低特化的”。相對更加特化的細胞與未特化的或相對較低特化的細胞可以在一個或多個可論證的表型特征上有所不同，例如特殊的細胞組分或產(chǎn)物例如RNA、蛋白質(zhì)、特異性細胞標記物或其他物質(zhì)的存在、不存在或表達水平，某些生化途徑的活性、形態(tài)學外觀、增殖能力和/或動力學、分化潛力和/或?qū)Ψ只盘柕膽鸬?，其中這些特征意味著相對更加特化的細胞進一步沿著所述發(fā)育途徑的發(fā)展。本文使用的術語“神經(jīng)毒素多肽”表示肉毒梭菌和破傷風梭菌神經(jīng)毒素(或梭菌神經(jīng)毒素)，即肉毒毒素(BoNT)和破傷風毒素(TeNT)。最近，已鑒定了新的肉毒毒素類型，即BoNT/H；參見Barash和Arnon,J.Infect.Dis.(2014)，209(2)：183-191。更具體地，所述術語涵蓋BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H和破傷風毒素(TeNT)或其亞型。例如，BoNT/A的亞型包括BoNT/Al、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5。BoNT/B亞型涵蓋例如BoNT/Bl、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6和BoNT/B7。BoNT/C亞型包括例如BoNT/Cl-1和BoNT/Cl-2。還涵蓋BoNT/D-C亞型。BoNT/E亞型包括例如BoNT/El、BoNT/E2、BoNT/E3、BoNT/E4、BoNT/E5、BoNT/E6、BoNT/E7和BoNT/E8。進一步地，BoNT/F亞型包括例如，BoNT/Fl、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6和BoNT/F7。神經(jīng)毒素多肽和，特別地，其輕鏈和重鏈是衍生自上述肉毒神經(jīng)毒素的抗原性不同的血清型中的一種。在一個方面，神經(jīng)毒素多肽的所述輕鏈和重鏈是選自以下神經(jīng)毒素的輕鏈和重鏈：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或TeNT。在另一個方面，編碼所述神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸包括如SEQIDNO:1(BoNT/A)、SEQIDNO:3(BoNT/B)、SEQIDNO:5(BoNT/C1)、SEQIDNO:7(BoNT/D)、SEQIDNO:9(BoNT/E)、SEQIDNO:11(BoNT/F)、SEQIDNO:13(BoNT/G)或SEQIDNO:15(TeNT)中所示的核酸序列。此外，在一個方面涵蓋包含編碼如SEQIDNO:2(BoNT/A)、SEQIDNO:4(BoNT/B)、SEQIDNO:6(BoNT/C1)、SEQIDNO:8(BoNT/D)、SEQIDNO:10(BoNT/E)、SEQIDNO:12(BoNT/F)、SEQIDNO:14(BoNT/G)或SEQIDNO:16(TeNT)中任一個所示的氨基酸序列的核酸序列的多核苷酸。在本發(fā)明的手段和方法的一個方面，進一步涵蓋包含選自以下的氨基酸序列或由選自以下的氨基酸序列組成的神經(jīng)毒素多肽：SEQIDNO:2(BoNT/A)、SEQIDNO:4(BoNT/B)、SEQIDNO:6(BoNT/C1)、SEQIDNO:8(BoNT/D)、SEQIDNO:10(BoNT/E)、SEQIDNO:12(BoNT/F)、SEQIDNO:14(BoNT/G)和SEQIDNO:16(TeNT)。在Dover等人的出版物，J.Infect.Dis.(2014),209(2):192-202中示出了BoNT/H的相應序列。在本發(fā)明的方法和手段的具體方面還涵蓋所述BoNT/H序列。在另一個方面，所述多核苷酸是包含一個或更多個核苷酸替換、缺失和/或添加的前述多核苷酸的變體，其在又一個方面可能導致具有一個或更多個氨基酸替換、缺失和添加的多肽。此外，在另一個方面，變體多核苷酸應包括與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13或15中任一個所示的(優(yōu)選完整的)核酸序列或BoNT/H的核酸至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核酸序列變體，或編碼與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14或16中任一個所示的(優(yōu)選完整的)氨基酸序列或BoNT/H的氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的氨基酸序列的核酸序列變體。本文使用的術語“一致的”是指通過測定兩個核酸序列或兩個氨基酸序列之間一致的氨基酸的數(shù)量來表征的序列一致性，其中對所述序列進行比對，從而獲得最高的順序匹配。其可以使用編入計算機程序的公開的技術或方法來計算，例如，BLASTP、BLASTN或FASTA(Altschul1990，JMolBiol215，403)。在一個方面，一致性百分比值是以整個氨基酸序列計算的。本領域技術人員可獲得基于各種算法的一系列程序以用于比較不同的序列。在本文的情況下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法給出特別可靠的結果。為了進行序列比對，可以使用程序PileUp(Higgins1989，CABIOS5，151)或程序Gap和BestFit(Needleman1970，JMolBiol48；443；Smith1981，AdvApplMath2，482)，其是GCG軟件包(Genetics，ComputerGroup1991，575ScienceDrive，麥迪遜，威斯康星州，美國，53711)的一部分。在本發(fā)明的另一個方面，使用GAP程序利用以下設置以整個序列區(qū)域測定以百分比(％)計的上文列舉的序列一致性值：空位權重：50，長度權重：3，平均匹配：10.000和平均錯配：0.000，除非另有說明，否則這應始終用作序列比對的標準設置。本文所指的梭菌神經(jīng)毒素的變體包括例如在人操縱幫助下產(chǎn)生的梭菌神經(jīng)毒素或通過化學合成產(chǎn)生的梭菌神經(jīng)毒素，在人操縱幫助下產(chǎn)生的梭菌神經(jīng)毒素包括但不限于通過基因工程或重組方法產(chǎn)生的梭菌神經(jīng)毒素，例如使用隨機誘變或理性設計，通過酶例如內(nèi)蛋白水解酶或外蛋白水解酶的活性進行修飾的梭菌神經(jīng)毒素的酶修飾變體?！盎虿倏v”指的是本領域中已知的借助于修飾梭菌神經(jīng)毒素的基因編碼或各自的核酸如DNA或mRNA來用于修飾任意血清型/亞型的天然梭菌神經(jīng)毒素的方法。用于編碼神經(jīng)毒素多肽的多核苷酸或神經(jīng)毒素多肽的基因工程的重組方法在本領域中有充分描述；參見例如Sambrook,J.&Russell,D.(2001).MolecularCloning:aLaboratoryManual,第三版.ColdSpringHarbor，NY:ColdSpringHarborLaboratory。本文使用的神經(jīng)毒素多肽變體還涵蓋化學修飾的神經(jīng)毒素多肽。本文使用的“化學修飾”通常指的是本領域已知的借助于化學反應或類似方法用于修飾任何血清型或亞型的天然或重組的梭菌神經(jīng)毒素的方法；其特別是指梭菌神經(jīng)毒素的氨基酸的替換、缺失、插入、添加或翻譯后修飾。化學修飾的神經(jīng)毒素多肽是一種通過丙酮酸化、磷酸化、硫酸化、脂化、聚乙二醇化、糖基化和/或化學添加氨基酸或包含例如約兩個至約500個氨基酸的多肽來修飾的神經(jīng)毒素多肽。例如，通過將透明質(zhì)酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇或其混合物引入到神經(jīng)毒素多肽，可以使梭菌神經(jīng)毒素或通過化學修飾或基因操縱從梭菌毒素衍生的毒素穩(wěn)定化。在一個方面，前述變體多核苷酸的每一個編碼保留各個神經(jīng)毒素多肽即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或破傷風神經(jīng)毒素(TeNT)的生物特性的一種或更多種以及在另一個方面保留其全部生物特性的多肽。本領域技術人員會理解完整的生物活性只在蛋白水解激活后保持，即使可以想到未經(jīng)加工的前體可以發(fā)揮一些生物功能或是部分活性的。本文使用的“生物特性”指(a)受體結合，(b)內(nèi)化，(c)跨核內(nèi)體膜進入胞質(zhì)溶膠的易位，和/或(d)對突觸泡膜融合中涉及的蛋白質(zhì)的內(nèi)切蛋白水解切割。更具體地，神經(jīng)毒素(如BoNT/A)切割神經(jīng)毒素底物(如SNAP-25)所憑借的全部細胞機制涵蓋神經(jīng)毒素與其相應受體的結合(例如BoNT/A與BoNT/A受體的結合)、神經(jīng)毒素/受體絡合物的內(nèi)化、神經(jīng)毒素輕鏈從細胞內(nèi)囊泡進入細胞質(zhì)的易位和神經(jīng)毒素底物的蛋白水解切割。用于測定神經(jīng)毒素多肽生物活性體外和體內(nèi)試驗是本領域熟知的。用于評估生物活性的體內(nèi)試驗包括小鼠LD50試驗和半體內(nèi)小鼠偏側(cè)膈試驗，如Pearce等人(Pearce1994，ToxicolApplPharmacol128:69-77)和Dressler等人(Dressler2005，MovDisord20:1617-1619，Keller2006，Neuroscience139：629-637)所描述的。生物活性通常用小鼠單位(MU)表達。如本文使用的，1MU是在腹膜內(nèi)注射后殺死確定小鼠群體的50％的神經(jīng)毒素組分的量，即小鼠i.p.LD50。在另一方面，變體多核苷酸可以編碼具有改善的或改變的生物特性的神經(jīng)毒素，例如，它們可能包含得到改善以用于酶識別的切割位點或可能為受體結合或上述任何其他特性而得到改善。在一些方面，神經(jīng)毒素多肽可以被包含在樣品中。樣品可以是例如臨床樣品、生物樣品、食物樣品、藥物或毒理樣品、抗體樣品或諸如此類。因此，本文使用的術語“測定神經(jīng)毒素多肽的生物活性”意思是測量神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)的生物活性，即，(a)受體結合，(b)內(nèi)化，(c)跨核內(nèi)體膜進入胞質(zhì)溶膠的易位，和/或(d)對突觸泡膜融合中涉及的蛋白質(zhì)的內(nèi)切蛋白水解切割。本文使用的術語“量”涵蓋例如神經(jīng)毒素多肽或神經(jīng)毒素底物多肽的絕對量，所述多肽的相對量或者濃度，以及與其相關的或從其衍生的任何值或參數(shù)。術語“測定……的量”，例如測定神經(jīng)毒素多肽或神經(jīng)毒素底物多肽的量，涉及以定量或半定量的方式測量例如神經(jīng)毒素多肽或神經(jīng)毒素底物多肽的絕對量、相對量或濃度。用于檢測的合適測量方法是本領域技術人員熟知的。應理解的是神經(jīng)毒素多肽或神經(jīng)毒素底物多肽的量的測定，在一個方面，還需要通過使用具有預先確定的量的神經(jīng)毒素多肽或神經(jīng)毒素底物多肽的標準溶液來校準方法。如何進行這種校準是本領域技術人員熟知的。在本發(fā)明的方法的一個方面，在包含GT1b的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元。神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b與神經(jīng)毒素多肽結合并潛在地調(diào)節(jié)神經(jīng)毒素對神經(jīng)元的選擇性。因此，GT1b可以用于使誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性標準化。本發(fā)明人已經(jīng)證明，與未經(jīng)GT1b處理的對照批次的iPS衍生的神經(jīng)元相比，外部添加GT1b至iPS衍生的神經(jīng)元使不同批次的所述iPS衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的變異性大幅減小。優(yōu)選地，所述GT1b以約10μM至約50μM的濃度，即以約10μM、約15μM、約20μM、約25μM、約30μM、約35μM、約40μM、約45μM、或約50μM的濃度，更優(yōu)選以約30μM的濃度存在。在另一個方面，本發(fā)明涉及用于測定神經(jīng)毒素多肽的生物活性的方法，其包括以下步驟：a)在包含GT1b的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元至少3小時；b)使步驟a)的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元與神經(jīng)毒素多肽接觸；c)在允許神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮其生物活性的條件下，在GT1b存在下培養(yǎng)步驟b)的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元至少24小時；d)測定所述細胞中神經(jīng)毒素多肽的生物活性。在本發(fā)明的該方法的具體方面，如本文其它地方定義的，使用不同批次的誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元。在本發(fā)明的方法的一個方面，(誘導多能干細胞衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的)“敏感性的標準化”是與在相同條件下但沒用GT1b處理的對照批次的誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元相比，不同批次的誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的變異性的減小。在另一個方面，與在相同條件下但沒用GT1b處理的對照批次的誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元相比，不同批次的誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的變異性的減小是減小到至少10/11、至少5/6、至少10/13、至少5/7、至少2/3、至少5/8、至少10/17、至少5/9、至少10/19、至少1/2、至少10/21、至少5/11、至少10/23、至少5/12、至少2/5、或甚至至少1/3。在本發(fā)明的方法的其他方面，誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元是人類誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元。優(yōu)選地，所述誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元是神經(jīng)元(CellularDynamicsInternational；同上文引用的)。在本發(fā)明的方法的一個方面，不同批次的誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元在傳代數(shù)、冷凍/解凍循環(huán)的次數(shù)、培養(yǎng)條件、儲存時間、生長時間、分化條件或其組合上有所不同。在本發(fā)明的方法的另一個方面，細胞培養(yǎng)基包含Neurobasal培養(yǎng)基、B27添加物(2％)、以及谷氨酰胺或Glutamax(1％)。任選地，細胞培養(yǎng)基可以包含抗生素(1％)、N2添加物(1％)和/或血清白蛋白(0.2％)。在本發(fā)明的方法的其他方面，以1μM至300μM，優(yōu)選30μM的濃度添加GT1b。在本發(fā)明的方法的另一個方面，神經(jīng)毒素多肽是BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/G、BoNT/F、BoNT/H或TeNT、或其亞型。在本發(fā)明的方法的又一方面，用Immuno-Western印跡分析、SDS-PAGE免疫印跡分析或ELISA(參見，例如，Pellet等人(2010)，J.Pharmacol.Toxicol.Methods61，304-310)通過神經(jīng)毒素切割底物的定量來測定神經(jīng)毒素多肽的生物活性。在另一個方面，本發(fā)明涉及GT1b的以下用途：a)用于使不同批次的誘導多能干細胞(iPS)衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性標準化；或b)用于減小不同批次的誘導多能干細胞(IPS)衍生的神經(jīng)元對神經(jīng)毒素多肽的敏感性的變異性。本發(fā)明的方法和用途的特殊方面在以下實施例中示出。附圖示出：圖1：如實施例2中所描述的，培養(yǎng)SiMa細胞并使其中毒，通過Western印跡分析測定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X軸上給出肉毒神經(jīng)毒素類型的濃度，而在Y軸上繪制切割的SNAP-25的相對量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圓形代表沒有GT1b的情況下培養(yǎng)的SiMa細胞，方形代表用30μM的GT1b培養(yǎng)的SiMa細胞。用GT1b的培養(yǎng)導致敏感性增加到約10倍。圖2：如實施例2中所描述的，培養(yǎng)SH-SY5Y細胞并使其中毒，通過Western印跡分析測定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X軸上給出肉毒神經(jīng)毒素類型的濃度，而在Y軸上繪制切割的SNAP-25的相對量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圓形代表沒有GT1b的情況下培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞，方形代表用30μM的GT1b培養(yǎng)的SH-SY5細胞。用GT1b的培養(yǎng)導致敏感性增加到約2倍。圖3：如實施例2中所描述的，培養(yǎng)PC12細胞并使其中毒，通過Western印跡分析測定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X軸上給出肉毒神經(jīng)毒素類型的濃度，而在Y軸上繪制切割的SNAP-25的相對量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圓形代表沒有GT1b的情況下培養(yǎng)的PC12細胞，方形代表用30μM的GT1b培養(yǎng)的PC12細胞。用GT1b的培養(yǎng)導致敏感性增加到約1.4倍。圖4：如實施例2中所描述的，培養(yǎng)Neuro2A細胞并使其中毒，通過Western印跡分析測定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X軸上給出肉毒神經(jīng)毒素類型的濃度，而在Y軸上繪制切割的SNAP-25的相對量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圓形代表沒有GT1b的情況下培養(yǎng)的Neuro2A細胞，方形代表用30μM的GT1b培養(yǎng)的Neuro2A細胞。在給定的神經(jīng)毒素濃度下，沒能觀察到完整的劑量反應曲線以及在GT1b存在下敏感性的增加。圖5：如實施例2中所描述的，培養(yǎng)NG108-15細胞并使其中毒，通過Western印跡分析測定切割的和未切割的SNAP-25的比例。在X軸上給出肉毒神經(jīng)毒素類型的濃度，而在Y軸上繪制切割的SNAP-25的相對量，即切割的和未切割的SNAP-25的比例。圓形代表沒有GT1b的情況下培養(yǎng)的NG108-15細胞，方形代表用30μM的GT1b培養(yǎng)的NG108-15細胞。用GT1b的培養(yǎng)導致敏感性增加到約1.6倍。實施例：實施例1：根據(jù)CellularDynamicsInternational(CDI)的用戶手冊，解凍來自4個不同細胞批次的神經(jīng)元并涂布在96孔板上。涂布后24小時，用用戶手冊中描述的保鮮培養(yǎng)基或用添加有30μMGT1b的相同培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。在另外的72小時孵育時間后，去除培養(yǎng)基并用含有不同濃度的BoNT/A的新鮮培養(yǎng)基替換。如果細胞在含有GT1b的培養(yǎng)基上生長，新鮮培養(yǎng)基也含有30μM的GT1b。中毒開始后72小時，吸出培養(yǎng)基，通過添加25μlSDS樣品緩沖液裂解細胞。如Pellett等人，2010(同上文引用的)描述的，通過SDS-PAGE免疫印跡分析測定切割的SNAP-25的百分比。通過繪制切割的SNAP-25相對BoNT/A濃度的的百分比計算EC50(產(chǎn)生SNAP-25最大切割的一半的BoNT/A濃度)。得到的添加GT1b和不添加GT1b的不同細胞批次的EC50值在表1中示出。表1：不添加GT1b的EC50添加GT1b的EC50批次022.84U/ml0.65U/ml批次035.37U/ml0.89U/ml批次046.40U/ml0.77U/ml批次055.47U/ml0.68U/ml均值5.02U/ml0.75U/mlRSD30.3％14.6％盡管添加GT1b得到的更高的敏感性使EC50從約5.0U/mL降低至約0.75U/mL，但是這些批次的EC50值的相對標準偏差從約30％減小至約15％。實施例2SiMa細胞的培養(yǎng)和分化(參見圖1)：解凍含有SiMa細胞的小瓶，并再懸浮于培養(yǎng)基(90％RPMI1640+10％h.i.FBS+2mM的L-谷氨酰胺+/-30μM的GT1b)中至每毫升30000個細胞的終密度。將細胞以每孔3000個細胞接種在聚-D-賴氨酸包被的96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2、在飽和水蒸氣氣氛下孵育72小時。72小時后，將培養(yǎng)基更換為含有濃度為1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神經(jīng)毒素的無血清培養(yǎng)基(MEM+2％B27+1％N2+2％非必需氨基酸+2mM的L-谷氨酰胺+/-30μM的GT1b)。在如上述孵育72小時后，去除培養(yǎng)基，將細胞再懸浮于裂解緩沖液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.5％TritonX-100，5U/mL的benzonase，pH8.0)，與RotiLoad1SDS樣品緩沖液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中產(chǎn)生的抗體(SynapticSystemsSySy111111)，進行Western印跡分析以測定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。SH-SY5Y細胞的培養(yǎng)和分化(參見圖2)：解凍含有SH-SY5Y細胞的小瓶，并再懸浮于培養(yǎng)基(85％MEM:F12+15％h.i.FBS+/-30μM的GT1b)中至每毫升60000個細胞的終密度。將細胞以每孔6000個細胞接種在未包被的96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2、在飽和水蒸氣氣氛下孵育24小時。然后向培養(yǎng)基添加神經(jīng)生長因子(100ng/ml)和Aphidicoline(0.3mM)+/-30μM的GT1b。每2-3天更換該培養(yǎng)基。孵育17天后，將培養(yǎng)基更換為含有濃度為1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神經(jīng)毒素的新鮮培養(yǎng)基。在如上述孵育72小時后，去除培養(yǎng)基，將細胞再懸浮于裂解緩沖液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.5％TritonX-100，5U/mL的benzonase，pH8.0)，與RotiLoad1SDS樣品緩沖液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中產(chǎn)生的抗體(SynapticSystemsSySy111111)，進行Western印跡分析以測定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。PC12細胞的培養(yǎng)和分化(參見圖3)：解凍含有PC12細胞的小瓶，并再懸浮于培養(yǎng)基(85％RPMI1640+10％馬血清+5％h.i.FBS+/-30μM的GT1b)中至每毫升25000個細胞的終密度。將細胞以每孔2500個細胞接種在膠原包被的96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2、在飽和水蒸氣氣氛下孵育72小時。然后向培養(yǎng)基添加神經(jīng)生長因子(100ng/ml)+/-30μM的GT1b。每2-3天更換該培養(yǎng)基。孵育11天后，將培養(yǎng)基更換為含有濃度為1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神經(jīng)毒素的新鮮培養(yǎng)基。在如上述孵育72小時后，去除培養(yǎng)基，將細胞再懸浮于裂解緩沖液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.55％TritonX-100，5U/mL的benzonase，pH8.0)，與RotiLoad1SDS樣品緩沖液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中產(chǎn)生的抗體(SynapticSystemsSySy111111)，進行Western印跡分析以測定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。Neuro2A細胞的培養(yǎng)和分化(參見圖4)：解凍含有Neuro2A細胞的小瓶，并再懸浮于培養(yǎng)基(90％DMEM+10％h.i.FBS+/-30μM的GT1b)中至每毫升20000個細胞的終密度。將細胞以每孔2000個細胞接種在96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2、在飽和水蒸氣氣氛下孵育24小時。用無血清DMEM+/-30μM的GT1b更換培養(yǎng)基，然后在37℃孵育3天。然后將培養(yǎng)基更換為含有0.2％BSA+/-30μM的GT1b和濃度為1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神經(jīng)毒素的新鮮無血清培養(yǎng)基。在如上述孵育72小時后，去除培養(yǎng)基，將細胞再懸浮于裂解緩沖液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.5％TritonX-100，5U/mL的benzonase，pH8.0)，與RotiLoad1SDS樣品緩沖液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中產(chǎn)生的抗體(SYNAPTICSystemsSySy111111)，進行Western印跡分析以測定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。NG108-15細胞的培養(yǎng)和分化(參見圖5)：解凍含有SH-SY5Y細胞的小瓶，并再懸浮于培養(yǎng)基(90％DMEM+10％h.i.FBS+/-30μM的GT1b)中至每毫升60000個細胞的終密度。將細胞以每孔6000個細胞接種在96孔微量滴定板上，并在37℃、95％O2/5％CO2在飽和水蒸氣氣氛下孵育72小時。然后向培養(yǎng)基添加雙丁酰-cAMP(1mM)+/-30μM的GT1b。每2-3天更換該培養(yǎng)基。孵育5天后，將培養(yǎng)更換為含有濃度為1.0*10-9至5.65*10-15M的A型肉毒神經(jīng)毒素的新鮮培養(yǎng)基。在如上述孵育72小時后，去除培養(yǎng)基，將細胞再懸浮于裂解緩沖液(20mM的Tris/HCl，20mM的NaCl，2mM的MgCl2，0.5％TritonX-100，5U/mL的benzonase，pH8.0)，與RotiLoad1SDS樣品緩沖液混合，如在Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35中描述的，使用小鼠中產(chǎn)生的抗體(SynapticSystemsSySy111111)，進行Western印跡分析以測定切割的SNAP-25/未切割的SNAP-25的比例。當前第1頁1 2 3