本申請(qǐng)要求2014年2月19日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/941,919的益處，其通過引用以其整體并入本文。

政府許可權(quán)的聲明

本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院的國家人類基因組研究所(NHGRI)頒發(fā)的R01HG005115下于政府的支持下完成的。政府對(duì)本發(fā)明具有一定的權(quán)利。

背景

提供蛋白質(zhì)構(gòu)象和運(yùn)動(dòng)的精細(xì)尺度表征的能力可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)功能的豐富信息。幾種技術(shù)已被開發(fā)來提供這樣的功能性蛋白質(zhì)研究的分辨率的很大進(jìn)步。結(jié)合福斯特共振能量傳遞(FRET)的測(cè)定法在連接至預(yù)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的部分在空間范圍內(nèi)相互作用時(shí)提供可檢測(cè)的信號(hào)。然而，F(xiàn)RET信號(hào)在集合來自大量個(gè)體相互作用的信號(hào)的批量測(cè)定中產(chǎn)生，因此，其在分辨率上受到固有的限制。其它測(cè)定法通過進(jìn)行單分子相互作用來避免批量測(cè)定固有的數(shù)據(jù)分散。例如，通常用來對(duì)馬達(dá)酶進(jìn)行測(cè)量的工具包括光鑷、磁鑷、拴系顆粒測(cè)定。例如，光鑷采用高度聚焦的激光束，以保持(或排斥)物體，諸如珠子。珠子可以附著至用作拴繩的聚合物。聚合物然后可以通過與該聚合物相互作用(即，施加力)的靶標(biāo)酶來操縱。這些處理通過測(cè)量珠子(或其它物體)從由激光所施加的場(chǎng)的移位來進(jìn)行檢測(cè)。目前，在沒有總體平均的情況下，光鑷可以實(shí)現(xiàn)在約1ms的時(shí)間尺度上～0.3nm的空間分辨率的精度。此分辨率的限制部分地是由于避免所施加的激光破壞靶蛋白質(zhì)所需要的長(zhǎng)拴繩聚合物。

直接地而不是僅僅經(jīng)由批量測(cè)定的輸入和輸出來觀察復(fù)雜生物分子的機(jī)械運(yùn)作的能力可加速醫(yī)療保健和解決生物系統(tǒng)如何真正發(fā)揮作用的問題。然而，盡管有單分子技術(shù)的進(jìn)步，仍然需要可以以改善的空間和時(shí)間分辨率解析蛋白質(zhì)的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和構(gòu)象狀態(tài)的廉價(jià)和簡(jiǎn)易的技術(shù)。

概述

本概述用于簡(jiǎn)要地介紹在下文的詳述中進(jìn)一步描述的概念選擇。本概述不旨在鑒別所要求保護(hù)的主題的關(guān)鍵特征，也不旨在用作確定所要求保護(hù)的主題的范圍的輔助。

在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了在納米孔系統(tǒng)中表征蛋白質(zhì)的方法。納米孔系統(tǒng)包括置于分隔第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)的膜中的納米孔，其中所述納米孔包括提供第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間的液體連通的通道，并且其中蛋白質(zhì)與第一導(dǎo)電液體介質(zhì)中的聚合物物理地結(jié)合。所述方法包括：

(a)在第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間施加電勢(shì)以引起聚合物與納米孔通道相互作用，其中所述蛋白質(zhì)的至少一個(gè)維度超過納米孔通道的直徑；

(b)測(cè)量聚合物與納米孔通道相互作用期間通過納米孔的離子電流以提供電流模式；

(c)從電流模式測(cè)定納米孔通道中的至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)；和

(d)將所述至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)與蛋白質(zhì)的特征相關(guān)聯(lián)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物是核酸、PNA或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸是DNA、RNA或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸包含無堿基殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸不是均聚物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶是分子馬達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分子馬達(dá)是移位酶、聚合酶、解旋酶、外切核酸酶、病毒包裝馬達(dá)或拓?fù)洚悩?gòu)酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶是布朗馬達(dá)、布朗棘輪核糖體、肌球蛋白質(zhì)或驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是突變蛋白質(zhì)或融合蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含能夠相互作用的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)至所述聚合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)可被解析至約35pm。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)聚合物亞單元的位置與所述蛋白質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)聚合物亞單元的運(yùn)動(dòng)與納米孔通道內(nèi)由分子馬達(dá)賦予的聚合物的不連續(xù)易位步長(zhǎng)的長(zhǎng)度相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)聚合物亞單元的運(yùn)動(dòng)與納米孔通道內(nèi)由分子馬達(dá)賦予的聚合物的不連續(xù)易位步長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間相關(guān)聯(lián)。所述持續(xù)時(shí)間可被解析至約800ns。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)聚合物亞單元的運(yùn)動(dòng)與由分子馬達(dá)作出的聚合物易位失誤的發(fā)生率相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶的特征是由反應(yīng)條件或推定的激動(dòng)劑、拮抗劑或輔因子賦予的酶活性的調(diào)節(jié)的存在或程度。

在一個(gè)實(shí)施方案中，納米孔是固態(tài)納米孔、蛋白質(zhì)納米孔、混合固態(tài)-蛋白質(zhì)納米孔、生物適應(yīng)固態(tài)納米孔、或DNA折紙納米孔。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)納米孔是α-溶血素、殺白細(xì)胞素、恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)、外膜孔蛋白F(OmpF)、外膜孔蛋白G(OmpG)、外膜磷脂酶A、奈瑟氏球菌(Neisseria)自轉(zhuǎn)運(yùn)脂蛋白質(zhì)(NalP)、WZA、皮疽諾卡菌(Nocardiafarcinica)NfpA/NfpB陽離子選擇性通道、胞溶素或其同源物或變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)納米孔序列被修飾以含有至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加導(dǎo)致納米孔中的凈電荷改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)納米孔具有帶非負(fù)電荷的收縮區(qū)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所施加的電勢(shì)為10mV至1V或-10mV至-1V。

在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了在納米孔系統(tǒng)中表征蛋白質(zhì)的方法。納米孔系統(tǒng)包括置于分隔第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)的膜中的納米孔，其中所述納米孔包括提供第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間的液體連通的通道，并且其中所述蛋白質(zhì)與第一導(dǎo)電液體介質(zhì)中的聚合物物理地結(jié)合。所述方法包括：

(a)在第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間施加電勢(shì)以引起聚合物與納米孔通道相互作用，其中所述蛋白質(zhì)的至少一個(gè)維度超過納米孔通道的直徑；

(b)測(cè)量聚合物與納米孔通道相互作用期間通過納米孔的離子電流以提供第一電流模式；

(c)比較第一電流模式與參考電流模式；

(d)從由參考電流模式測(cè)定的納米孔通道中的至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)測(cè)定納米孔通道中的至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)的變化；和

(e)將納米孔通道中的至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)的所述變化與酶的特征相關(guān)聯(lián)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，納米孔系統(tǒng)包括與用于產(chǎn)生參考電流模式的納米孔系統(tǒng)的差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述差異是推定的蛋白質(zhì)激動(dòng)劑、拮抗劑或輔因子在第一導(dǎo)電介質(zhì)中的存在或不存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述差異是推定的蛋白質(zhì)激動(dòng)劑、拮抗劑或輔因子在第一導(dǎo)電介質(zhì)中的不同濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述特征是由推定的激動(dòng)劑、拮抗劑或輔因子賦予的蛋白質(zhì)活性或構(gòu)象的調(diào)節(jié)的存在或程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述差異是相較于用于產(chǎn)生參考電流模式的納米孔系統(tǒng)中的氨基酸蛋白質(zhì)序列，蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的至少一個(gè)氨基酸差異。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述特征是由氨基酸序列中的氨基酸差異賦予的蛋白質(zhì)活性或構(gòu)象的調(diào)節(jié)的存在或程度。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括產(chǎn)生參考電流模式。

附圖描述

當(dāng)結(jié)合附圖考慮時(shí)，本發(fā)明的前述方面和許多伴隨的優(yōu)勢(shì)將變得更容易理解，通過參考下面的詳細(xì)描述也變得更好地理解，其中：

圖1A是可用于本公開內(nèi)容的實(shí)踐的示例性納米孔系統(tǒng)的卡通圖示。如圖所示的，單個(gè)納米孔(例如，MspA)埋入分隔兩個(gè)體積的導(dǎo)電液體介質(zhì)(例如電解質(zhì)混合物)的磷脂雙層中?？珉p層的電壓引起離子電流流過納米孔的內(nèi)部。蛋白質(zhì)(例如分子馬達(dá)酶)與被拉至納米孔的內(nèi)部的聚合物(例如，DNA)物理地結(jié)合。單鏈端穿進(jìn)并穿過納米孔，直到蛋白質(zhì)(其超過納米孔的內(nèi)部通道的最大直徑)靠在孔上。納米孔通道中的離子電流受到納米孔通道的最窄部分(“收縮區(qū)”)內(nèi)的核苷酸結(jié)構(gòu)(從而核苷酸身份)的影響。

圖1B是通過使用MspA納米孔和與phi29DNA聚合酶結(jié)合的DNA由納米孔系統(tǒng)產(chǎn)生的代表性電流模式的圖形說明。電流模式表示DNA通過phi29DNA聚合酶(DNAP)以不連續(xù)的易位步長(zhǎng)移動(dòng)通過納米孔。所觀察到的電流電平可與DNA序列相關(guān)聯(lián)。phi29DNAP的偶爾后退活動(dòng)導(dǎo)致由*標(biāo)示的反復(fù)電平。

圖1C是從原始的隨機(jī)電平持續(xù)時(shí)間衍生的時(shí)序平均離子電流值的圖形表示。

圖2A-2F示出了通過以小規(guī)模表征用于蛋白質(zhì)分析的納米孔中的DNA運(yùn)動(dòng)的PINT系統(tǒng)的過程和靈敏度。圖2A圖示了對(duì)應(yīng)于所示的DNA序列的電流電平(黑色實(shí)線)，其提供了距離量度(nt)。樣條輪廓(曲線)用來顯示電平之間的距離。電流電平的標(biāo)準(zhǔn)偏差產(chǎn)生可以測(cè)量的距離的精度。所示的序列中的X中代表無堿基殘基。圖2B是在MspA的收縮區(qū)內(nèi)運(yùn)動(dòng)距離δ的DNA的卡通圖示。圖2C圖示了對(duì)應(yīng)于在180mV(圓圈)和140mV(三角形)從納米孔系統(tǒng)中觀察到的所示DNA序列的電流電平。圖2D圖示了180mV(圓圈)的電流值和擬合至這些電平的樣條(虛線)。三角形呈現(xiàn)在140mV獲取的在乘性比例化和加性抵消后的電平，如在圖2C中所示的。對(duì)于經(jīng)比例調(diào)整的140mV電平，電平位置以0.3nt位移以使電平與在180mV觀察到的電流電平的樣條輪廓一致。這表明施加的電壓使MspA內(nèi)的DNA移動(dòng)0.3nt。圖2E示出對(duì)應(yīng)的所觀察到的衍生自原始電流模式的時(shí)序平均離子電流電平，其中DNA通過phi29DNAP運(yùn)動(dòng)。該電平對(duì)應(yīng)于DNA序列，因此，對(duì)應(yīng)于DNA序列相對(duì)MspA的物理位移。虛線疊加電流電平來指示在連續(xù)運(yùn)動(dòng)通過納米孔時(shí)對(duì)應(yīng)于特定DNA序列的電流輪廓。圖2F圖示了所觀察到的衍生自原始電流模式的時(shí)序平均離子電流電平，其中相同的DNA通過hel308TGA運(yùn)動(dòng)。當(dāng)DNA運(yùn)動(dòng)通過hel308TGA的移位酶活性控制時(shí)，觀察到可與通過phi29DNAP控制的DNA易位產(chǎn)生的電平直接媲美的電平輪廓。然而，hel308TGA電流模式顯示相同DNA序列的兩倍電平。這表明相對(duì)于MspA，hel308TGA使DNA每核苷酸運(yùn)動(dòng)兩次。

圖3A-3G示出由hel308控制的DNA易位步長(zhǎng)的基于納米孔的分析。

圖3A圖示了在納米孔系統(tǒng)中針對(duì)與phi29DNA聚合酶結(jié)合的DNA聚合物生成的共有電流電平模式。

圖3B圖示了在相同的納米孔系統(tǒng)中針對(duì)與在圖3A中相同的DNA聚合物生成的共有電流電平模式，但是其中DNA與解旋酶hel308TGA結(jié)合。沿著DNA的每一個(gè)核苷酸翻譯被分成兩個(gè)不同的步長(zhǎng)，相較于圖3A。所有解旋酶數(shù)據(jù)在22℃、300mM KCl、5mM MgCl₂和180mV的實(shí)驗(yàn)條件下獲得。

圖3C圖示了圖3B中所示的電流電平的半衰期。電平持續(xù)時(shí)間在長(zhǎng)和短持續(xù)時(shí)間之間交替。每隔一個(gè)電平的持續(xù)時(shí)間取決于ATP濃度(“[ATP]”)，如通過使用不同濃度的ATP測(cè)定的：10μΜATP(虛線)和1000μΜATP(實(shí)線)。

圖3D圖示了具有高和低[ATP]的持續(xù)時(shí)間的差異消除了還影響步長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間的序列依賴性。

圖3E圖示了ATP非依賴性步長(zhǎng)(長(zhǎng)虛線)和ATP依賴性步長(zhǎng)(短虛線)的相對(duì)于[ATP]^-1的電平平均持續(xù)時(shí)間。對(duì)于ATP非依賴性步長(zhǎng)，我們測(cè)得4.5+/0.4s^-1的平均速率。對(duì)于ATP依賴性步長(zhǎng)，我們觀察到具有15.2+/-1.3/s的最大速度的Michaelis Menton動(dòng)力學(xué)和92.5+/-9.9μmol的米氏常數(shù)。

圖3F圖示電平的半衰期取決于已通過收縮區(qū)的核苷酸的身份性質(zhì)：A＝交替的長(zhǎng)短虛線，C＝實(shí)線，G＝輕色的短虛線，T＝重色的長(zhǎng)虛線；下方的一組線代表ATP依賴性步長(zhǎng)，上面的一組線代表具有500μM的[ATP]的ATP非依賴性步長(zhǎng)。在14、17和18處的峰指示位于酶內(nèi)的位置，其中G、T或C分別導(dǎo)致更長(zhǎng)的電平持續(xù)時(shí)間。

圖3G圖示了相對(duì)于phi29DNAP的步長(zhǎng)的相位。ATP非依賴性步長(zhǎng)表示為實(shí)心棒并且ATP依賴性步長(zhǎng)以空心棒表示。ATP非依賴性和ATP依賴性步長(zhǎng)之間的平均hel308步長(zhǎng)是0.53±0.04nt。平均不確定性是平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖3A中示出的電平平均值的離子電流不確定性平均比線寬度更小，<0.1pA。

詳細(xì)描述

本公開內(nèi)容涉及本發(fā)明人在使用基于納米孔的系統(tǒng)分析和表征靶蛋白質(zhì)上的進(jìn)步。

納米孔系統(tǒng)先前已被用于表征多種分析物，例如小分子和聚合物。這些方法一般包括使靶分析物通過納米級(jí)開口，同時(shí)監(jiān)測(cè)可檢測(cè)信號(hào)，例如電信號(hào)。隨著靶分析物通過納米孔，所述信號(hào)受到靶分析物的物理性質(zhì)的影響，并因此可與分析物的結(jié)構(gòu)特征相關(guān)聯(lián)，例如其身份性質(zhì)。當(dāng)處理聚合性分析物(例如單鏈DNA(“ssDNA”))時(shí)，不連續(xù)的可檢測(cè)信號(hào)可在聚合物線性通過納米孔時(shí)受到每個(gè)連續(xù)聚合物亞單元的結(jié)構(gòu)的影響，從而提供關(guān)于聚合物的序列的信息。

本發(fā)明人借鑒上述納米孔系統(tǒng)方法來研究無法穿過納米孔開口的較大分析物，而不是研究可進(jìn)入納米孔的內(nèi)部空間的小分析物。如下文更詳細(xì)描述的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，較大蛋白質(zhì)分析物的重要特征可以使用納米孔系統(tǒng)的來表征，盡管事實(shí)上它們不穿過納米孔。簡(jiǎn)言之，在這種新穎的方法中，使聚合物與靶蛋白質(zhì)結(jié)合。當(dāng)聚合物與納米孔通道的內(nèi)部相互作用時(shí)，結(jié)合的蛋白質(zhì)被拉向納米孔的開口邊緣，但由于其大小不能通過。通過使用此信息，聚合物現(xiàn)可以用作測(cè)量工具來將納米孔收縮區(qū)和靶蛋白質(zhì)之間的距離確定至小至30-40皮米的分辨率。此外，聚合物-蛋白質(zhì)結(jié)合不需要是靜態(tài)的，而是可以是動(dòng)態(tài)的。在這種情況下，通過納米孔的聚合物的運(yùn)動(dòng)能夠以短于毫秒的分辨率(例如約700微秒或800微秒)實(shí)時(shí)監(jiān)控。相應(yīng)地，各種各樣的蛋白質(zhì)特征可在迄今為止在現(xiàn)有技術(shù)(例如與分子鑷和FRET分析)中無法見到的空間和時(shí)間分辨率上進(jìn)行研究。如將要討論的，納米孔系統(tǒng)可以被配置來解決各種各樣的蛋白質(zhì)特征，例如折疊和構(gòu)象變化的性質(zhì)，蛋白質(zhì)序列的突變的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象作用，以及分子馬達(dá)-聚合物相互作用的性質(zhì)。此外，這些實(shí)驗(yàn)配置可應(yīng)用于潛在的藥物組及其對(duì)酶(例如分子馬達(dá))活性的作用的更廣泛的研究，等等。這些和其它優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用將在下文的描述中變得更清楚。

在一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了在納米孔系統(tǒng)中表征蛋白質(zhì)的方法。在此方法中，蛋白質(zhì)與聚合物物理地結(jié)合。所述方法包括如下步驟：(a)在納米孔系統(tǒng)的第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間施加電勢(shì)以引起聚合物與納米孔通道相互作用；(b)測(cè)量聚合物與納米孔通道相互作用期間通過納米孔的離子電流以提供電流模式；(c)從電流模式測(cè)定納米孔通道中的至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)；和(d)將所述至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)與蛋白質(zhì)的特征相關(guān)聯(lián)。

由本公開內(nèi)容涵蓋的納米孔系統(tǒng)的各個(gè)方面在下文中更詳細(xì)地描述。通常所描述的，納米孔系統(tǒng)包括置于分隔第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)的膜中的納米孔。納米孔一般形成提供第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間的液體連通的內(nèi)部通道。在本方面中，蛋白質(zhì)置于第一導(dǎo)電液體介質(zhì)中并且與聚合物物理地結(jié)合。

如本文所用，術(shù)語“物理地結(jié)合”可以指共價(jià)鍵以提供蛋白質(zhì)和聚合物之間的永久或靜態(tài)的結(jié)合。可替代地，該術(shù)語可以指該蛋白質(zhì)和聚合物之間的非共價(jià)鍵或結(jié)合。這包括這樣的實(shí)施方案，其中蛋白質(zhì)可具有與聚合物的動(dòng)態(tài)物理結(jié)合，例如在許多分子馬達(dá)酶的情況下，所述分子馬達(dá)酶可以接觸并施加力至聚合物分子(例如，核酸)，并且可以沿聚合物的長(zhǎng)度以動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。

在此方法中，蛋白質(zhì)的至少一個(gè)維度超過納米孔通道的直徑。因此，結(jié)合的聚合物到納米孔的內(nèi)部空間中的任何運(yùn)動(dòng)不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)本身通過納米孔。相反，蛋白質(zhì)僅被拉入與納米孔的外緣入口接觸并靠在納米孔的外緣而沒有朝膜的相對(duì)側(cè)的進(jìn)一步前進(jìn)。因此，蛋白質(zhì)向聚合物提供了一種錨，不論是動(dòng)態(tài)或是基本上靜態(tài)的，其提供聚合物進(jìn)一步運(yùn)動(dòng)到納米孔中(以及可能通過納米孔)的阻力。因而，借助于蛋白質(zhì)在納米孔的外緣入口處的蛋白質(zhì)位置，蛋白質(zhì)與聚合物的結(jié)合導(dǎo)致聚合物運(yùn)動(dòng)(或?qū)嵸|(zhì)阻止進(jìn)一步的運(yùn)動(dòng))至納米孔中或通過納米孔的受控制的速率。

所述蛋白質(zhì)是本公開內(nèi)容的靶分析物。將理解的是，本公開內(nèi)容可廣泛適用于用于各種測(cè)定法的任何感興趣的靶蛋白質(zhì)。因此，本公開內(nèi)容不限于特定的靶蛋白質(zhì)類型。兩個(gè)限制是蛋白質(zhì)必須至少有一個(gè)超過納米孔的內(nèi)部直徑的維度以防止蛋白質(zhì)通過納米孔(如上所述)以及蛋白質(zhì)必須能夠或適合于與聚合物物理結(jié)合。應(yīng)該理解的是，蛋白質(zhì)可以是任何天然存在的蛋白質(zhì)，任何修飾的(例如，工程改造的)蛋白質(zhì)，包括突變的或融合蛋白質(zhì)。潛在的蛋白質(zhì)的幾個(gè)類別將進(jìn)行描述，但應(yīng)該注意的是，這些描述僅僅是用于舉例說明目的并且不旨在進(jìn)行限制。

在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是酶。廣泛定義地，酶是多肽大分子，當(dāng)正確折疊成三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，其可以執(zhí)行功能，例如催化反應(yīng)。

在一些實(shí)施方案中，酶是分子馬達(dá)。“分子馬達(dá)”被廣泛地定義為與特定聚合物(例如核酸)相互作用的蛋白質(zhì)，例如酶。在一些實(shí)施方案中，所述相互作用涉及施加至聚合物的一些力。在天然情況下，所述力可能導(dǎo)致分子馬達(dá)附著至聚合物，分子馬達(dá)沿著聚合物運(yùn)動(dòng)，或者聚合物的構(gòu)象或形狀發(fā)生變化。所述力可導(dǎo)致聚合物的操縱，例如導(dǎo)致納米孔系統(tǒng)中聚合物的運(yùn)動(dòng)。分子馬達(dá)可以是主動(dòng)的，即使用能量例如ATP以運(yùn)動(dòng)或與聚合物相互作用。這種分子馬達(dá)可包括可使聚合物相對(duì)于由跨納米孔的電壓施加的力方向運(yùn)動(dòng)的部分?？商娲?，分子馬達(dá)可以是被動(dòng)的，即不利用能量以運(yùn)動(dòng)或與聚合物相互作用。本公開內(nèi)容可用于表征分子馬達(dá)和特定聚合物之間的結(jié)合的性質(zhì)。例如，許多分子馬達(dá)以不連續(xù)和重復(fù)的步長(zhǎng)沿核酸鏈運(yùn)動(dòng)。這樣的分子馬達(dá)，在針對(duì)納米孔的外緣入口固定時(shí)，促進(jìn)核酸以不連續(xù)的步長(zhǎng)以逐步的方式運(yùn)動(dòng)通過納米孔，其中核酸以相對(duì)一致長(zhǎng)度的不連續(xù)運(yùn)動(dòng)方式前進(jìn)，類似于棘輪或排隊(duì)式運(yùn)動(dòng)。一些分子馬達(dá)(例如phi29DNA聚合酶(DNAP))以單個(gè)可測(cè)量的核苷酸步長(zhǎng)使核酸運(yùn)動(dòng)通過納米孔。然而，將理解的是，其它分子馬達(dá)可用于使核酸聚合物以少于單個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的步長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)。以及其它分子馬達(dá)可用于使核酸聚合物以多于單個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的步長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)。

本方法可用于通過監(jiān)測(cè)所產(chǎn)生的聚合物通過納米孔的運(yùn)動(dòng)來在亞埃分辨率上測(cè)量特征，例如每個(gè)運(yùn)動(dòng)的距離。本方法還可以用于通過調(diào)整化學(xué)能(例如ATP的濃度)的可用性來表征分子馬達(dá)動(dòng)作的能量需求。作為另一實(shí)例，推定的輔因子、激動(dòng)劑、拮抗劑或任何其它潛在的反應(yīng)條件可以被測(cè)試以確定對(duì)監(jiān)測(cè)的聚合物通過納米孔的運(yùn)動(dòng)所賦予的變化。作為又一實(shí)例，本方法可用于表征在任何特定的反應(yīng)條件或環(huán)境下由蛋白質(zhì)促進(jìn)的通過孔的聚合物運(yùn)動(dòng)的速率。此外，分子馬達(dá)常常犯錯(cuò)，其中分子馬達(dá)跳過步長(zhǎng)或倒退并重復(fù)運(yùn)動(dòng)步長(zhǎng)。這樣的跳過或反復(fù)可以在電流模式中檢測(cè)到。見PCT/US2014/059360，其全文通過引用并入本文。

下面提供了這樣的分子馬達(dá)的舉例說明性非限制性實(shí)例。

分子馬達(dá)可以是天然存在的酶、工程改造的或突變的酶、或以其它方式從酶衍生。在一些實(shí)施方案中，分子馬達(dá)被修飾以除去酶的特定功能，但保留分子馬達(dá)與聚合物分析物(例如，核酸)結(jié)合和促進(jìn)其在納米孔內(nèi)運(yùn)動(dòng)的能力。在一些實(shí)施方案中，酶是或者來源于酶分類(EC)組3.1.11,3.1.13,3.1.14,3.1.15,3.1.16,3.1.21,3.1.22,3.1.25,3.1.26,3.1.27,3.1.30和3.1.31之任一的成員。酶可以是在國際公開號(hào)WO 2010/1086603(其全文通過引用并入本文)中公開的那些酶之任一。

在一些實(shí)施方案中，酶是移位酶、聚合酶、解旋酶、外切核酸酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶等。

許多示例性外切核酸酶在WO 2010/1086603(其全文通過引用并入本文)中一般性描述。其它的例子是外切核酸酶，其可以包括外切核酸酶I，外切核酸酶III，λ外切核酸酶，或其變體或同源物。對(duì)于本文的任何方面，如本文所述的同源物、衍生物和其它變體蛋白質(zhì)可優(yōu)選基于氨基酸序列同一性與參照蛋白質(zhì)至少50％同源。更優(yōu)選地，變體多肽可基于氨基酸同一性與參照蛋白質(zhì)至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％和更優(yōu)選至少95％，97％或99％同源，或在其中可衍生的任何范圍內(nèi)。同源性可以通過本領(lǐng)域公認(rèn)的任何方法來確定。因此，同源物或變體可具有序列和結(jié)構(gòu)修飾。本公開內(nèi)容可用于確定或以其它方式表征功能類似和/或由所示差異導(dǎo)致的差異。雖然外切核酸酶通常含有用于切除核酸的部分的酶功能，但這樣的酶可以被修飾以消除這樣的核酸酶功能，同時(shí)保留結(jié)合并使核酸聚合物運(yùn)動(dòng)的能力。

可以是靶蛋白質(zhì)的示例性解旋酶在WO 2014/013260和WO2013/057495(其每一個(gè)的全文通過引用并入本文)中一般地描述，并且可以包括hel308解旋酶，RecD解旋酶，Tral解旋酶，Tral亞組解旋酶，XPD解旋酶，或其變體或同源物。

可以是靶蛋白質(zhì)的示例性聚合酶包括DNA聚合酶例如phi29DNA聚合酶(有時(shí)稱為phi29DNAP)，Klenow片段，或其變體或同源物。

示例性拓?fù)洚悩?gòu)酶可包括促旋酶，或其變體或同源物。

其它靶蛋白質(zhì)包括病毒包裝馬達(dá)，或促進(jìn)病原體的侵襲、復(fù)制或其它致病功能的任何其它病毒或病原體酶。

其它的示例性靶蛋白質(zhì)包括布朗馬達(dá)、布朗棘輪核糖體、肌球蛋白質(zhì)、驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)等，如本領(lǐng)域中已知的。

如上所述，本方法還可用于表征蛋白質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)。在這方面，野生型靶蛋白質(zhì)不需要具有針對(duì)與聚合物結(jié)合的任何親和力。相反，聚合物可以根據(jù)本領(lǐng)域的任何標(biāo)準(zhǔn)和公認(rèn)的技術(shù)來共價(jià)偶聯(lián)至蛋白質(zhì)。在這種情況下，構(gòu)象狀態(tài)可以通過納米孔中的特定聚合物亞單元的位置來表征。這指示蛋白質(zhì)與特定聚合物亞單元或事實(shí)上納米孔的收縮區(qū)之間的距離。在該構(gòu)象狀態(tài)中的任何變化可導(dǎo)致該距離的微小變化，這在該系統(tǒng)中是可檢測(cè)的。因此，多個(gè)蛋白質(zhì)可以進(jìn)行比較(使用以相同的方式附著的相同的聚合物類型，即附著至蛋白質(zhì)的相同氨基酸殘基)。這允許進(jìn)行突變研究來表征由一個(gè)或多個(gè)突變至蛋白質(zhì)序列中的引入產(chǎn)生的構(gòu)象變化。此外，蛋白質(zhì)可以是包含兩個(gè)或更多個(gè)相互作用從而引起構(gòu)象變化的結(jié)構(gòu)域的天然或融合蛋白質(zhì)。這種相互作用的各種參數(shù)可以通過測(cè)量納米孔中聚合物的運(yùn)動(dòng)(例如頻率、持續(xù)時(shí)間和質(zhì)量(由聚合物運(yùn)動(dòng)的距離推斷))來推斷。

在本方法中，跨膜(即在第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間)的電勢(shì)的施加導(dǎo)致聚合物與納米孔通道相互作用。通常地，聚合物分析物(例如核酸)以線性方式與納米孔通道相互作用，其中聚合物沿著納米孔通道的軸線性延伸。在一些實(shí)施方案中，該軸橫切于該膜。當(dāng)關(guān)于納米孔通道使用時(shí)的術(shù)語“相互作用”表示聚合物以聚合物的存在影響經(jīng)過納米孔通道的可測(cè)量離子電流的程度運(yùn)動(dòng)到納米孔中的至少內(nèi)部部分。如下文更詳細(xì)描述的，許多納米孔具有“收縮”或“收縮區(qū)”，其是內(nèi)部通道的具有最小直徑的區(qū)域，并因此，其中電流最有可能被不同的聚合物結(jié)構(gòu)的存在差異地影響。

由本公開內(nèi)容涵蓋的聚合物可以是能夠1)與靶蛋白質(zhì)結(jié)合和2)與納米孔的內(nèi)部通道相互作用以使得通過納米孔的離子電流可受到聚合物結(jié)構(gòu)的可測(cè)量地影響的任何聚合物。在實(shí)踐中，聚合物用作準(zhǔn)繩來表征聚合物附著于的蛋白質(zhì)(位于納米孔的外緣開口)與通道內(nèi)的區(qū)域(其中聚合物的存在可以影響孔內(nèi)的可測(cè)量電流)(通常被稱為“收縮區(qū)”)之間的距離。這個(gè)距離的測(cè)量是可能的，因?yàn)榫酆衔飦唵卧奈恢每梢栽诩{米孔中因在測(cè)定過程中觀察到的電流模式的變化來監(jiān)測(cè)。核酸聚合物中的聚合物核苷酸亞單元的納米孔中的位置的確定更詳細(xì)地描述于PCT/US2014/059360中，其全文通過引用并入本文。

如本文所使用的，“聚合物”是指包含兩個(gè)或更多個(gè)線性單元(也稱為“聚體”或“亞單元”)的任何大分子，其中每個(gè)亞單元可以是相同的或不同的。由本發(fā)明涵蓋的聚合物的非限制性實(shí)例包括核酸、肽和蛋白質(zhì)，以及各種烴聚合物(例如，聚乙烯，聚苯乙烯)和官能化的烴聚合物，其中聚合物的主鏈包含碳鏈(例如，聚氯乙烯，聚甲基丙烯酸酯)。術(shù)語“聚合物”還可以包括共聚物、嵌段共聚物和支化聚合物例如星形聚合物和樹枝狀聚合物。

在任何實(shí)施方案中，不要求聚合物序列是先驗(yàn)已知的，或甚至是可從納米孔系統(tǒng)中產(chǎn)生的電流模式辨認(rèn)的。相反，在聚合物亞單元間可以產(chǎn)生離子電流的可測(cè)量變化并且聚合物中結(jié)構(gòu)變化的位置相對(duì)于納米孔通道和/或蛋白質(zhì)在外緣入口的位置可以是確定的。因此，在一些實(shí)施方案中，聚合物(例如，核酸)不是均聚物。

術(shù)語“核酸”是指包含多個(gè)核苷酸亞單元的任何聚合物分子(即，多核苷酸)。由本公開內(nèi)容涵蓋的核酸可包括脫氧核糖核苷酸聚合物(DNA)，核糖核苷酸聚合物(RNA)，cDNA或本領(lǐng)域中已知的合成核酸，例如肽核酸(PNA)，甘油核酸(GNA)，蘇糖核酸(TNA)，鎖核酸(LNA)，或具有核苷酸側(cè)鏈的其它合成聚合物，或它們的任意組合。核酸可以是單鏈或雙鏈形式，或包括單鏈和雙鏈部分兩者。通常地，cDNA、RNA、GNA、TNA或LNA是單鏈的。DNA可以是雙鏈的(dsDNA)或單鏈的(ssDNA)。

核酸聚合物的核苷酸亞單元可以是天然存在的或人造的或經(jīng)修飾的。核苷酸通常包含核堿基、糖和至少一個(gè)磷酸基團(tuán)。核堿基通常為雜環(huán)。合適的核堿基包括嘌呤和嘧啶，更具體地腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)(或通常地在RNA中，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶(T))，以及胞嘧啶(C)。糖通常為戊糖。合適的糖包括，但不限于，核糖和脫氧核糖。核苷酸通常為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。核苷酸通常含有單磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯。這些在本文中通常被稱作為核苷酸或核苷酸殘基以指示亞單元。在沒有具體指明的情況下，一般性術(shù)語核苷酸、核苷酸殘基等不旨在暗示任何特定結(jié)構(gòu)或身份。核苷酸還可以是合成的或經(jīng)修飾的。例如，核苷酸可以被標(biāo)記或修飾以用作具有不同信號(hào)的標(biāo)記物。此外，在施加電勢(shì)之前，可以將修飾施加至選擇性影響受限核苷酸類型的結(jié)構(gòu)的核酸以增強(qiáng)靶向的殘基(亞單元)所產(chǎn)生的信號(hào)的差異。例如，參見國際申請(qǐng)?zhí)朠CT/US2014/53754，其全文通過引用并入本文。用于本公開內(nèi)容的實(shí)踐的一個(gè)特別有利的策略是將具有缺失堿基結(jié)構(gòu)的核酸殘基(例如，無堿基單元或間隔子)摻入多核苷酸。這是特別有利的，因?yàn)闊o堿基殘基已被觀察到在位于收縮區(qū)中時(shí)導(dǎo)致顯著的電流峰(即，電流的急劇增加)。因此，無堿基殘基的特定位置可被容易地監(jiān)測(cè)且具有很小的信號(hào)混亂風(fēng)險(xiǎn)。這提供了用于監(jiān)測(cè)無堿基殘基通過納米孔的位置和運(yùn)動(dòng)的有用信號(hào)，如由所結(jié)合的蛋白質(zhì)所允許或影響的。

本公開內(nèi)容還包括使用多肽作為聚合物?！岸嚯摹笔怯呻?酰胺)鍵連接的多個(gè)氨基酸的大分子。如本文中所使用的，“氨基酸”是指在蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的任何天然存在的氨基酸，天然存在的氨基酸的D-立體異構(gòu)體(例如，D-蘇氨酸)，非天然氨基酸，以及化學(xué)修飾的氨基酸。這些類型的氨基酸的每一種不是相互排斥的。α-氨基酸包括與氨基、羧基、氫原子和被稱為“側(cè)鏈”的獨(dú)特基團(tuán)鍵合的碳原子。天然存在的氨基酸的側(cè)鏈?zhǔn)潜绢I(lǐng)域中已知的，包括，例如，氫(例如，如在甘氨酸中的)，烷基(例如，如在丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸中的)，取代的烷基(例如，如在蘇氨酸，絲氨酸，甲硫氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，精氨酸和賴氨酸中的)，芳烷基(例如，如在苯丙氨酸和色氨酸中)，取代的芳基烷基(例如，如在酪氨酸中的)，和雜芳基烷基(例如，如在組氨酸中的)。

以下縮寫用于20種天然存在的經(jīng)典氨基酸：丙氨酸(Ala；A)，天冬酰胺(Asn；N)，天冬氨酸(Asp；D)，精氨酸(Arg；R)，半胱氨酸(Cys；C)，谷氨酸(Glu，E)，谷氨酰胺(Gln；Q)，甘氨酸(Gly；G)，組氨酸(His；H)，異亮氨酸(Ile；I)，亮氨酸(Leu；L)，賴氨酸(Lys；K)，甲硫氨酸(Met；M)，苯丙氨酸(Phe；F)，脯氨酸(Pro；P)，絲氨酸(Ser；S)，蘇氨酸(Thr；T)，色氨酸(Trp；W)，酪氨酸(Tyr；Y)，和纈氨酸(Val；V)。

非天然氨基酸(即，沒有在蛋白質(zhì)中天然發(fā)現(xiàn)的那些)在本領(lǐng)域中也是已知的，如例如在Mol.Cell.Biol.,9:2574(1989)；J.Amer.Chem.Soc.,112:4011-4030(1990)；J.Amer.Chem.Soc.,56:1280-1283(1991)；J.Amer.Chem.Soc.,113:9276-9286(1991)和其中引用的所有的參考文獻(xiàn)中所示的。β-和γ-氨基酸在本領(lǐng)域中是已知的，并且也包括在本文中作為非天然氨基酸。

如本文所使用的，“化學(xué)修飾的氨基酸”是指其側(cè)鏈已被化學(xué)修飾的氨基酸。例如，側(cè)鏈可被修飾以包含發(fā)信號(hào)部分，例如熒光團(tuán)或放射性標(biāo)記。側(cè)鏈可被修飾以包含新的官能團(tuán)，例如巰基、羧酸或氨基。翻譯后修飾的氨基酸也包括在化學(xué)修飾的氨基酸的定義中。

如上所述，在包含與聚合物結(jié)合的靶蛋白質(zhì)的所述系統(tǒng)中產(chǎn)生的電流模式可用于確定蛋白質(zhì)的特征。這是通過這樣的發(fā)現(xiàn)來實(shí)現(xiàn)的：這樣的納米孔系統(tǒng)可允許納米孔中的單個(gè)聚合物亞單元的位置和在分鐘時(shí)間范圍上該位置的變化的高分辨率推斷。此分析基于納米孔中的單鏈DNA(ssDNA)的初步力光譜學(xué)研究。本發(fā)明人先前發(fā)現(xiàn)，錨定的DNA分析物在MspA收縮區(qū)中隨增加的力(隨著在納米孔系統(tǒng)中施加增加的電勢(shì))伸展。通過納米孔系統(tǒng)中不同的電勢(shì)和同時(shí)監(jiān)測(cè)所產(chǎn)生的電流，納米孔內(nèi)DNA的伸展在埃級(jí)精度上被表征。通過使用自由連接鏈模型來評(píng)估伸展，核苷酸的相對(duì)位置在伸展事件中被表征并建立布朗運(yùn)動(dòng)對(duì)納米孔系統(tǒng)對(duì)多個(gè)核苷酸的靈敏度的相對(duì)貢獻(xiàn)的確定。

由于來自彈簧建模分析的結(jié)果，核苷酸的位置可以在與納米孔通道的DNA相互作用過程中的任何時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行計(jì)算。因此，電流模式適合于鑒定如對(duì)應(yīng)于駐留在與電勢(shì)的施加相關(guān)聯(lián)的納米孔的收縮區(qū)中的核酸區(qū)段的任何電流模式的分析。因此，在一些實(shí)施方案中，電流-電位曲線至電流-核酸距離曲線的轉(zhuǎn)換通過應(yīng)用基于彈簧的模型來完成。在一些實(shí)施方案中，模型是線性恢復(fù)力的彈簧的模型。在一些實(shí)施方案中，模型是如在自由連接鏈(FJC)模型或修改的自由連接鏈(FJC)模型中的非線性恢復(fù)力，如在下文更詳細(xì)描述的。其它合適的模型可根據(jù)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來應(yīng)用。參見PCT/US2014/059360，其全文通過引用并入本文。

在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了在納米孔系統(tǒng)中表征蛋白質(zhì)的方法。如上所述，此方面中的蛋白質(zhì)與聚合物物理地結(jié)合。此方面的方法具體地包括：(a)在第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間施加電勢(shì)以引起聚合物與納米孔通道相互作用；(b)測(cè)量聚合物與納米孔通道相互作用期間通過納米孔的離子電流以提供第一電流模式；(c)比較第一電流模式與參考電流模式；(d)從由參考電流模式測(cè)定的納米孔通道中的至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)測(cè)定納米孔通道中的至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)的變化；和(e)將納米孔通道中的至少一個(gè)聚合物亞單元的位置和/或運(yùn)動(dòng)的所述變化與酶的特征相關(guān)聯(lián)。

由本公開內(nèi)容涵蓋的納米孔系統(tǒng)的各個(gè)方面在下文中更詳細(xì)地描述。通常所描述的，納米孔系統(tǒng)包括置于分隔第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)的膜中的納米孔，其中納米孔包括提供第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間的液體連通的通道，并且蛋白質(zhì)與第一導(dǎo)電液體介質(zhì)中的聚合物物理地結(jié)合。

如上所述，蛋白質(zhì)的至少一個(gè)維度超過納米孔通道的直徑。

此方法的參數(shù)和特征是如在上述的方法的上下文中所描述的。在這方面，該方法涉及比較第一電流模式與參考電流模式。因此，該方法適用于實(shí)驗(yàn)設(shè)置來確定反應(yīng)條件的一個(gè)或多個(gè)變化的效應(yīng)。所述效應(yīng)可理想地歸因于靶蛋白質(zhì)上的特征或效應(yīng)。因此，當(dāng)在聚合物位置之間檢測(cè)到差異時(shí)，如在第一電流模式和參考電流模式中所反映的，所述差異可歸因于生成每個(gè)各自電流模式的測(cè)定條件的變化。因此，所述納米孔系統(tǒng)中的測(cè)定條件包括相較于用于產(chǎn)生參考電流模式的條件的擾動(dòng)或不同。

在一些實(shí)施方案中，所述差異可以是推定的蛋白質(zhì)激動(dòng)劑、拮抗劑或輔因子的增加或移除。在這樣的實(shí)施方案中，該方法可以用來測(cè)試懷疑影響蛋白質(zhì)的一組潛在因素中的一個(gè)或多個(gè)。例如，可以測(cè)試懷疑潛在特異性抑制病毒解旋酶的因素并通過測(cè)量納米孔中DNA聚合物的運(yùn)動(dòng)速率來表征解旋酶沿DNA運(yùn)動(dòng)的能力。

在其它實(shí)施方案中，懷疑改變與核酸聚合物的相互作用的蛋白質(zhì)的突變可以通過表征核酸運(yùn)動(dòng)的速度、頻率或特征來進(jìn)行測(cè)試。

在其它實(shí)施方案中，所述差異可以是反應(yīng)條件的差異，例如輔因子的存在的差異，或輔因子的改變。在其它實(shí)施方案中，差異可以是組分諸如ATP等的濃度(更高或更低)的變化。

第一和參考電流模式可以在具有相同或不同的蛋白質(zhì)和所結(jié)合的聚合物的相同或不同的納米孔系統(tǒng)設(shè)置中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)、蛋白質(zhì)和聚合物是實(shí)質(zhì)重復(fù)的但用于特定的所引入的擾動(dòng)。在一些實(shí)施方案中，該方法包括產(chǎn)生參考電流模式。在一些實(shí)施方案中，參考電流模式在產(chǎn)生第一電流模式之前或之后產(chǎn)生，其中所述模式各自分別地在引入擾動(dòng)之前或之后產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，所述擾動(dòng)被引入到系統(tǒng)中，并通過確定納米孔中聚合物(或聚合物亞單元)位置或運(yùn)動(dòng)的變化來確定對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象的效應(yīng)。

如在本公開內(nèi)容中使用的納米孔系統(tǒng)的各個(gè)方面描述如下。

基于納米孔的分析方法先前已被研究用于表征通過納米孔的分析物。所述系統(tǒng)允許聚合物分子例如單鏈DNA(“ssDNA”)通過納米級(jí)開口，同時(shí)提供信號(hào)例如電信號(hào)，其受到在任何給定時(shí)間駐留在納米孔通道的緊密物理空間中的聚合物亞單元的物理性質(zhì)的影響。納米孔最佳地具有允許聚合物僅以連續(xù)的單行順序通過的尺寸或三維結(jié)構(gòu)。在理論上最佳的條件下，聚合物分子以這樣的速率通過納米孔：使得聚合物的每個(gè)不連續(xù)的單體亞單元可與所監(jiān)測(cè)的信號(hào)相關(guān)聯(lián)。構(gòu)成聚合物的每個(gè)單體亞單元(例如組成ssDNA的核苷酸)的化學(xué)和物理性質(zhì)的差異導(dǎo)致當(dāng)它通過納米孔時(shí)可以鑒定每個(gè)單體亞單元的特征性電信號(hào)。納米孔(例如保持在脂雙層膜內(nèi)的蛋白質(zhì)納米孔和固態(tài)納米孔)迄今已被用于分析DNA、RNA和多肽，并因此提供用于穩(wěn)健分析作為在所結(jié)合的蛋白質(zhì)上反映的聚合物的位置和運(yùn)動(dòng)的有利平臺(tái)。

“納米孔”具體是指通常具有納米級(jí)尺寸的孔，其允許分析聚合物(例如核酸)通過其中。通常情況下，由本公開內(nèi)容涵蓋的納米孔具有直徑在其最狹窄處為約0.3nm至約2nm的開口?？捎糜诒竟_內(nèi)容的納米孔包括能夠允許分析聚合物以適合于監(jiān)測(cè)技術(shù)(例如檢測(cè)電流波動(dòng)的技術(shù))的速度從一側(cè)線性易位到另一側(cè)的任何孔。

納米孔可以是生物學(xué)納米孔(例如，蛋白質(zhì)納米孔)，固態(tài)納米孔，混合固態(tài)蛋白質(zhì)納米孔，生物適應(yīng)固態(tài)納米孔，DNA折紙納米孔，等。

在一些實(shí)施方案中，納米孔包括蛋白質(zhì)，例如α-溶血素、炭疽毒素和殺白細(xì)胞素，以及細(xì)菌的外膜蛋白質(zhì)/孔蛋白如例如恥垢分枝桿菌孔蛋白(Msp)，包括MspA，外膜孔蛋白例如OmpF、OmpG、OmpATb等，外膜磷脂酶A和奈瑟氏球菌自轉(zhuǎn)運(yùn)脂蛋白質(zhì)(NaIP)，和胞溶素，如在美國公開號(hào)US2012/0055792，國際PCT公開號(hào)WO2011/106459、WO2011/106456、WO2013/153359和Manrao等人,"Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29DNA polymerase,"Nat.Biotechnol.30:349-353(2012)(其中的每一個(gè)通過引用以其整體并入本文)中所描述的。納米孔還可以包括包含由α-螺旋形成的桶狀體或通道的α-螺旋束孔。合適的α-螺旋束孔包括但不限于，內(nèi)膜蛋白質(zhì)和外膜蛋白質(zhì)，例如WZA和ClyA毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)納米孔是來自皮疽諾卡菌的由NfpA和NfpB亞單元形成的異寡聚陽離子選擇性通道。納米孔還可以是上文示出的任何納米孔的同源物或衍生物。如本文所使用的，“同源物”是來自另一個(gè)物種的具有相似結(jié)構(gòu)和進(jìn)化起源的基因或蛋白質(zhì)。通過示例的方式，野生型MspA的同源物例如MppA、PorM1、PorM2和Mmcs4296可以用作本發(fā)明中的納米孔。蛋白質(zhì)納米孔具有的優(yōu)點(diǎn)是，作為生物分子，它們自組裝并且基本上彼此相同。此外，可以基因工程改造蛋白質(zhì)納米孔，從而產(chǎn)生具有不同屬性的納米孔的“衍生物”，例如上文示出的那些。這樣的衍生物可由將氨基酸殘基取代為具有不同電荷的氨基酸、由生成融合蛋白質(zhì)(例如，酶+α-溶血素)來產(chǎn)生。因此，蛋白質(zhì)納米孔可以是野生型或可被修飾以含有至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加導(dǎo)致納米孔的不同凈電荷。在一些實(shí)施方案中，凈電荷的不同增加相較于聚合物分析物的第一帶電荷部分的凈電荷差異。例如，如果第一帶電荷部分具有凈負(fù)電荷，所述至少一個(gè)氨基酸取代、缺失或添加導(dǎo)致帶較少負(fù)電荷的納米孔。在某些情況下，所產(chǎn)生的凈電荷是負(fù)的(但帶較少負(fù)電荷)，是中性的(其以前是負(fù)的)，是正的(其以前是負(fù)的或中性的)，或者是更多正電荷的(其以前是正的但帶較少正電荷)。在一些實(shí)施方案中，納米孔入口邊緣中的或在通道和/或收縮區(qū)的內(nèi)部中的電荷的改變促進(jìn)聚合物的進(jìn)入和聚合物與納米孔通道的相互作用。

在一些實(shí)施方案中，納米孔可以包括或包含基于DNA的結(jié)構(gòu)，例如通過DNA折紙技術(shù)產(chǎn)生的。對(duì)于用于分析物檢測(cè)的基于DNA折紙的納米孔的描述，參見PCT公開號(hào)WO2013/083983，其通過引用并入本文。

在一些實(shí)施方案中，納米孔是MspA或其同源物或衍生物。MspA從多個(gè)單體形成。孔可以是同單體的或異單體的，其中單體的一個(gè)或多個(gè)包含修飾或與所組裝的納米孔中的其它單體的差異。對(duì)MspA納米孔的修飾的描述已被描述，參見美國公開號(hào)2012/0055792，通過引用整體并入本文。簡(jiǎn)要地說，MspA納米孔可用氨基酸取代修飾以導(dǎo)致MspA突變體，所述突變體相對(duì)于野生型氨基酸序列具有位置93上的突變，位置90、位置91或位置90和91兩者上的突變，以及任選地在任何下列氨基酸位置上的一個(gè)或多個(gè)突變：88,105,108,118,134或139。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，MspA相對(duì)于野生型序列位置包含突變D90N/D91N/D93N(在其中被稱作為“M1MspA”或“M1-NNN”)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MspA相對(duì)于野生型序列位置包含突變D90N/D91N/D93N/D118R/D134R/E139K(在其中被稱作為“M2MspA”)。參見美國公開號(hào)2012/0055792。這樣的突變可導(dǎo)致包括具有約2至約9nm的長(zhǎng)度和約2至約6nm的直徑的孔腔和具有約0.3至約3nm的長(zhǎng)度和約0.3至約3nm的直徑的收縮區(qū)的MspA納米孔，其中所述孔腔和收縮區(qū)一起定義通道。此外，在這些實(shí)例中描述的氨基酸取代在納米孔的孔腔中提供更大的凈正電荷，從而進(jìn)一步增強(qiáng)與帶負(fù)電荷的聚合物分析物末端相互作用的能量支持。

一些納米孔例如MspA蛋白質(zhì)納米孔可以包括聚合物分析物所運(yùn)動(dòng)通過的可變形的通道組分。例如，示例性實(shí)施方案是其中MspA置于脂雙層膜中。MspA納米孔包括接觸所示酶的外緣入口區(qū)域。通道的最寬的內(nèi)部部分通常被稱為孔腔。內(nèi)部通道的最窄部分被稱為收縮區(qū)?？浊缓褪湛s區(qū)一起形成了通道。MspA中的“孔腔”是其直徑通常從一端至另一端沿著中心軸減少的納米孔內(nèi)部的圓錐形部分，其中孔腔的最窄部分被連接到收縮區(qū)。換句話說，MspA的孔腔通?？杀灰暈椤氨瓲钚巍薄Ｒ?yàn)榭浊皇潜瓲钚蔚?，所以直徑沿著中心軸的路徑改變，其中直徑在一個(gè)末端比相對(duì)末端更大。直徑可以為約2nm至約6nm。任選地，直徑為約、至少約或至多約2,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9或6.0nm，或其中可衍生的任意范圍。中心軸的長(zhǎng)度可以為約2nm至約6nm。任選地，長(zhǎng)度為約、至少約或至多約2,2.1,2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.9,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9,4.0,4.1,4.2,4.3,4.4,4.5,4.6,4.7,4.8,4.9,5.0,5.1,5.2,5.3,5.4,5.5,5.6,5.7,5.8,5.9或6.0nm，或其中可衍生的任意范圍。在本文中當(dāng)提及“直徑”時(shí)，可以通過測(cè)量中心到中心的距離或原子的表面到表面的距離來測(cè)定直徑。

術(shù)語“收縮區(qū)”一般是指納米孔的通道在直徑方面最窄的部分，其連接至孔腔。收縮區(qū)的長(zhǎng)度可以為例如，約0.3nm至約20nm。任選地，長(zhǎng)度為約、至多約或至少約0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2或3nm，或其中可衍生的任意范圍。收縮區(qū)的直徑可以為約0.3nm至約2nm。任選地，直徑為約、至多約或至少約0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2或3nm，或其中可衍生的任意范圍。在其它實(shí)施方案例如涉及固態(tài)孔的那些中，維度(長(zhǎng)度或直徑)的范圍可以擴(kuò)展至約20nm。例如，固態(tài)納米孔的收縮區(qū)為約、至多約或至少約0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2,1.3,1.4,1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,1,2 13,14,15,16,17,18,19或20nm，或其中可衍生的任意范圍。取決于方法中所使用的聚合物，這樣的納米孔中較大的維度可以是優(yōu)選的。如下文更詳細(xì)描述的，收縮區(qū)一般是納米孔結(jié)構(gòu)的部分，其中聚合物例如核酸的存在可影響從孔的一側(cè)至納米孔的另一側(cè)的離子電流。圖2B提供了對(duì)聚合物的數(shù)個(gè)核苷酸的亞序列敏感的收縮區(qū)的示意圖。在這個(gè)實(shí)例中，收縮區(qū)內(nèi)的特定位置具有用于測(cè)定通過納米孔的電流的最高靈敏度，如由垂直線和0nm位移的指示所指示的。因此，在任何時(shí)間駐留在該位置的核苷酸將提供對(duì)電流信號(hào)的最大影響，并且收縮區(qū)中的相鄰核苷酸具有對(duì)信號(hào)的減小的影響。因此，納米孔的收縮區(qū)的維度可以影響電流信號(hào)的分辨率，因?yàn)樗婕榜v留在其中的分析物聚合物的結(jié)構(gòu)(和序列同一性)。在一些情況下，術(shù)語“收縮區(qū)”用于基于所獲得的納米孔分辨率的功能上下文中，因此，該術(shù)語并不一定由物理維度的任何特定參數(shù)限制。因此，納米孔的功能收縮區(qū)可以通過修飾納米孔系統(tǒng)的方面而不提供納米孔本身的任何物理修飾來進(jìn)行優(yōu)化。

在一些實(shí)施方案中，納米孔可以是固態(tài)納米孔。固態(tài)層不是生物起源的。換句話說，固態(tài)層不衍生自或分離自生物環(huán)境例如生物體或細(xì)胞，或生物可用結(jié)構(gòu)的合成生產(chǎn)形式。固態(tài)納米孔可以如在美國專利號(hào)7,258,838和7,504,058(通過引用整體并入本文中)中所描述的產(chǎn)生。簡(jiǎn)要地說，固態(tài)層可以由有機(jī)和無機(jī)材料形成，所述有機(jī)和無機(jī)材料包括但不限于，微電子材料，絕緣材料，例如Si3N4、A1203和SiO，有機(jī)和無機(jī)聚合物，例如聚酰胺，塑料例如或彈性體，例如雙組分加成固化硅橡膠，和玻璃。固態(tài)層可以由石墨烯形成。合適的石墨烯層公開于WO 20091035647和WO 20111046706中。固態(tài)納米孔具有的優(yōu)點(diǎn)是它們更強(qiáng)健和穩(wěn)定。此外，固態(tài)納米孔在某些情況下可以以有效和成本效益的方式進(jìn)行多路復(fù)用和批次制造。最后，它們可以與微電子制造技術(shù)相結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，納米孔包括其中納米孔蛋白被摻入到固態(tài)納米孔中的混合蛋白質(zhì)/固態(tài)納米孔。在一些實(shí)施方案中，納米孔為生物適應(yīng)固態(tài)孔。

在一些情況下，納米孔置于膜、薄膜、層或雙層內(nèi)。例如，生物(例如，蛋白質(zhì)性)納米孔可被插入兩親性層諸如生物膜例如脂雙層中。兩親性層是由具有親水性和親脂性性質(zhì)的兩親性分子例如磷脂形成的層。兩親性層可以是單層或雙層。兩親層可以是共嵌段聚合物?；蛘?，生物孔可被插入到固態(tài)層中。

膜、薄膜、層或雙層通常分隔第一導(dǎo)電液體介質(zhì)和第二導(dǎo)電液體介質(zhì)，以提供在第一導(dǎo)電液體介質(zhì)與第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間的非導(dǎo)電屏障。因此，納米孔提供了通過其內(nèi)部通道的第一和第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間的液體連通。在一些實(shí)施方案中，孔提供第一和第二導(dǎo)電液體介質(zhì)之間的唯一的液體連通。導(dǎo)電液體介質(zhì)通常包含可通過納米孔的內(nèi)部從第一導(dǎo)電液體介質(zhì)流至第二導(dǎo)電液體介質(zhì)的電解質(zhì)或離子?？捎糜诒疚拿枋龅姆椒ǖ囊后w在本領(lǐng)域中是公知的。這樣的介質(zhì)包括導(dǎo)電液體介質(zhì)的描述和實(shí)例提供于例如美國專利7,189,503(其通過引用整體并入本文)中。第一和第二液體介質(zhì)可以是相同的或不同的，并且任一或兩者可包含鹽、洗滌劑或緩沖液中的一種或多種。事實(shí)上，本文中描述的任何液體介質(zhì)可包含鹽、洗滌劑或緩沖液中的一種或多種。另外，本文中描述的任何液體介質(zhì)可包含粘度改變物質(zhì)或速度改變物質(zhì)。

在一些情況下，位于納米孔的兩側(cè)的第一和第二導(dǎo)電液體介質(zhì)被稱為在順式和反式區(qū)域上，其中蛋白質(zhì)分析物和所結(jié)合的聚合物提供在順式區(qū)域中。然而，應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，待分析的蛋白質(zhì)分析物和所結(jié)合的聚合物可以提供在反式區(qū)域中并且在施加電勢(shì)后，聚合物從系統(tǒng)的反式側(cè)進(jìn)入納米孔。在一些情況下，聚合物的整個(gè)長(zhǎng)度不穿過孔，而只是聚合物的某些部分或區(qū)段穿過納米孔用于分析。易位的方向性和速率可以使用各種機(jī)制例如施加的電壓或以相反方向摻入納米孔來調(diào)節(jié)。

納米孔系統(tǒng)還摻入結(jié)構(gòu)元件來測(cè)量和/或施加跨納米孔承載膜或膜片的電勢(shì)。例如，系統(tǒng)可包括一對(duì)驅(qū)動(dòng)通過納米孔的電流的驅(qū)動(dòng)電極。通常情況下，負(fù)極被設(shè)置在順式區(qū)域中，正極被設(shè)置在反式區(qū)域中。此外，系統(tǒng)可包括一個(gè)或多個(gè)測(cè)量通過納米孔的電流的測(cè)量電極。這些可以包括，例如，膜片鉗放大器或數(shù)據(jù)采集設(shè)備。例如，納米孔系統(tǒng)可包括Axopatch-200B膜片鉗放大器(Axon Instruments,Union City,CA)，以施加跨雙層的電壓并測(cè)量流過納米孔的離子電流。例如，在一些實(shí)施方案中，施加的電場(chǎng)包括約10mV至約1V的直流電或恒定電流。在一些包括埋入脂膜的基于蛋白質(zhì)的納米孔的實(shí)施方案中，所施加的電流包括約10mV至300mV的直流電或恒定電流，例如約10mV,20mV,30mV,40mV,50mV,60mV,70mV,80mV,90mV,100mV,110mV,120mV,130mV,140mV,150mV,160mV,170mV,180mV,190mV,200mV,210mV,220mV,230mV,240mV,250mV,260mV,270mV,280mV,290mV,300mV，或其中的任何電壓。在一些實(shí)施方案中，所施加的電場(chǎng)為約40mV至約200mV。在一些實(shí)施方案中，所施加的電場(chǎng)包括約100mV至約200mV的直流電或恒定電流。在一些實(shí)施方案中，所施加的直流或恒定電流電場(chǎng)為約180mV。在其中使用固態(tài)納米孔的其它實(shí)施方案中，所施加的直流或恒定電流電場(chǎng)可以在如所描述的類似的范圍中，最多高達(dá)1V。如將理解的是，可使用的電壓范圍可取決于正在使用的納米孔系統(tǒng)的類型和所期望的效果。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，還可以施加如上所述的值和范圍的反向電勢(shì)。當(dāng)分子馬達(dá)在抵抗由聚合物上的分子馬達(dá)所施加的力的電場(chǎng)的背景下進(jìn)行表征時(shí)，這可能是適用的。

在一些實(shí)施方案中，電勢(shì)不是恒定的，而是在參考電勢(shì)附近可變的?？勺冸妱?shì)在核酸聚合物的情境中的這樣的使用可引起聚合物的伸展以為聚合物相對(duì)于納米孔的每個(gè)位置提供更多的數(shù)據(jù)采樣。這可以適用于牽涉與聚合物動(dòng)態(tài)結(jié)合的分子馬達(dá)的方法，或適用于牽涉不以不連續(xù)的步長(zhǎng)運(yùn)動(dòng)而是通過蛋白質(zhì)錨定的共價(jià)偶聯(lián)的聚合物的方法。參見PCT/US2014/059360，其全文通過引用并入本文。

通常應(yīng)注意的是，在權(quán)利要求書中使用術(shù)語“或”用于意指“和/或”，除非明確指明是指僅替代物或替代物是相互排斥的，盡管本公開內(nèi)容支持指僅替代物和“和/或”的定義。

根據(jù)長(zhǎng)期存在的專利法，詞語“一個(gè)”和“一種”在與詞語“包含”在權(quán)利要求中或說明書中一起使用時(shí)，是指一個(gè)或多個(gè)/一種或多種，除非特別指出。

除非上下文明確要求，否則在整個(gè)說明書和權(quán)利要求中，詞語“包括”、“包括”等應(yīng)以相對(duì)于排他性或窮盡性意義的包含性意義來解釋；也就是說，以“包括但不限于”的意義來解釋。使用單數(shù)或復(fù)數(shù)的詞語也分別包括復(fù)數(shù)和單數(shù)。另外，在本申請(qǐng)中使用時(shí)，詞語“在本文中”、“上文”和“下文”以及類似含義的詞語應(yīng)指作為整體的本申請(qǐng)，而不是指本申請(qǐng)的任何特定部分。詞語例如“約”和“近似”意味著在所述值附近的較小變化，通常在標(biāo)準(zhǔn)誤差界限的范圍內(nèi)，例如在所述值的10％或5％以內(nèi)。

所公開的是可用于所公開的方法和組合物的材料、組合物和組分，可與所公開的方法和組合物結(jié)合使用的材料、組合物和組分，可用于制備所公開的方法和組合物的材料、組合物和組分，或者是所公開的方法和組合物的產(chǎn)品的材料、組合物和組分。將理解的是，當(dāng)公開這些材料的組合、子集、相互作用、組群等時(shí)，特別考慮了各種個(gè)體和集體組合的每一個(gè)，即使具體參考每個(gè)單一組合并且這些化合物的排列可以是不被明確公開的。這一概念適用于本公開內(nèi)容的所有方面，包括但不限于，所描述的方法的步驟。因此，任何前述實(shí)施方案的特定元件可以進(jìn)行組合或代替其它實(shí)施方案中的元件。例如，如果存在多種可以執(zhí)行的附加步驟，將理解的是，每一個(gè)這些附加步驟可以與任何特定的方法步驟或所公開的方法的方法步驟的組合一起執(zhí)行，并且每個(gè)這樣的組合或組合的子集被具體考慮并應(yīng)被視為公開。此外，將理解的是，本文描述的實(shí)施方案可以使用任何合適的材料例如在本文其它地方描述的或如本領(lǐng)域已知的材料來實(shí)現(xiàn)。

本文引用的出版物和引用它們所針對(duì)的主題在此特別地將其全部?jī)?nèi)容通過引用并入。

下文描述了示例性地使用所公開的方法來以亞埃水平的分辨率表征分子馬達(dá)(解旋酶hel308)與DNA之間的結(jié)合。

摘要

描述了開發(fā)體外高分辨率納米孔傳感器來觀察酶活性。通過改造的蛋白質(zhì)孔蛋白MspA的電場(chǎng)導(dǎo)致離子電流流動(dòng)。隨著酶將單鏈DNA拉動(dòng)通過孔，DNA的核苷酸控制該離子電流。離子電流的分析提供了酶如何處理DNA的實(shí)時(shí)記錄。如本文所證明的，DNA通過酶的運(yùn)動(dòng)可以以高達(dá)35pm的縱向分辨率和亞毫秒的時(shí)間尺度來解析。

這種方法通過解析每個(gè)單個(gè)核苷酸前進(jìn)的ATP依賴性和ATP非依賴性步長(zhǎng)來在解旋酶hel30TGA上發(fā)揮效用。這種新的低成本的單分子技術(shù)的空間和時(shí)間分辨率允許實(shí)時(shí)探究迄今為止未觀察到的酶動(dòng)力學(xué)。

結(jié)果與討論

這里提出一種新的工具(被稱作皮米離子電流納米孔傳導(dǎo)器(PINT))以基于通過納米孔的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)來檢查分子馬達(dá)。PINT允許觀察核酸相對(duì)于酶(其以數(shù)十皮米的精度、短于毫秒的時(shí)間尺度和20-40pN的負(fù)載處理核酸)的運(yùn)動(dòng)。PINT的固有敏感性在此處通過觀察解旋酶來應(yīng)用。在其基本形式中，PINT采用單納米尺寸的孔?？缈资┘拥撵o電勢(shì)引起離子電流流動(dòng)。與酶結(jié)合的DNA通過靜電勢(shì)被拉入孔中。ssDNA適合通過孔，但酶太寬而無法穿過孔。當(dāng)酶靠在孔上后，它限制了在DNA運(yùn)動(dòng)通過酶時(shí)所具有的速度的DNA轉(zhuǎn)運(yùn)，而在孔的最窄部分的DNA的組成控制離子電流。離子電流的變化以令人驚訝的高精確度指示DNA通過酶的處理(圖2)。為了使單個(gè)核苷酸控制電流，納米孔必須具有與核苷酸之間的間距相當(dāng)?shù)奶卣鳌４笞匀惶峁┝司哂性由峡稍佻F(xiàn)特征的粗糙的蛋白質(zhì)孔。這些孔可通過突變定制。對(duì)于我們?cè)贒NA的納米孔測(cè)序中的研究，我們開發(fā)了恥垢分枝桿菌孔蛋白A(MspA)的特定的突變體(Butler,T.Z.,等人,"Single-molecule DNA detection with an engineered MspA protein nanopore,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,105:20647-20652(2008))。該孔有短且窄的收縮區(qū)(圖1A)，其最適合于沿DNA解析個(gè)體核苷酸(Derrington,I.M.,等人,"Nanopore DNA sequencing with MspA,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107:16060–16065(2010)；Manrao,E.A.,等人,PLoS ONE 6,e25723(2011))。然而，為了實(shí)現(xiàn)MspA的高分辨率感測(cè)能力，穿過孔的DNA必須保持靜止(Derrington,I.M.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,107:16060–16065(2010)；Manrao,E.A.,等人,Nature Biotechnology 30:349–353(2011))或運(yùn)動(dòng)地足夠緩慢以解析皮安電流變化。在Manrao等人(Manrao,E.A.,等人,"Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29DNA polymerase,"Nature Biotechnology 30:349–353(2012))中，我們使用phi29的DNA聚合酶(DNAP)來將DNA拉動(dòng)通過MspA。我們已觀察到一系列不連續(xù)的離子電流電平(圖1B)。這些電平的持續(xù)時(shí)間是隨機(jī)的，具有數(shù)十毫秒的時(shí)間常數(shù)。繪制離子電流振幅系列揭示了可再現(xiàn)至皮安內(nèi)的電流模式(圖1C)。每個(gè)電平與DNA前進(jìn)一個(gè)核苷酸相關(guān)聯(lián)，并且電流模式被匹配至DNA序列(Manrao,E.A.,等人,Nature Biotechnology30:349–353(2012))。在隨后的研究中，我們顯示了離子電流電平的幅度與核苷酸序列如何相關(guān)(Laszlo等人,"Decoding long nanopore sequencing reads of natural DNA,"Nature Biotechnology32:829–833(2014))，從而建立了納米孔鏈測(cè)序的基礎(chǔ)。

由于MspA的收縮區(qū)的有限長(zhǎng)度和布朗運(yùn)動(dòng)，每個(gè)電流電平是涉及約四個(gè)核苷酸的時(shí)間平均值，有效地施加高斯平滑至單核苷酸電流信號(hào)系列。在已使DNA連續(xù)運(yùn)動(dòng)后，而不是在一個(gè)核苷酸步長(zhǎng)中，會(huì)預(yù)期離子電流i(x)的平滑發(fā)展，其中x是DNA相對(duì)于孔的位置。phi29DNAP提供的不連續(xù)步長(zhǎng)以一個(gè)核苷酸間隔取樣該平滑曲線。在DNAP已停在通過部分核苷酸使DNA運(yùn)動(dòng)的額外步長(zhǎng)上后，我們會(huì)在落在該平滑曲線i(x)上的電流值上觀察到額外的電平。這些步長(zhǎng)的位置x可以通過倒置x＝i^-1(x)來找到。局部地，小的位置變化Δx可以從電流變化Δi在一階上通過Δx＝Δi/(di/dx)推斷。對(duì)于包含大的di/dx的DNA序列，這允許檢測(cè)遠(yuǎn)小于一個(gè)核苷酸的DNA位置的變化。

為了說明PINT的可實(shí)現(xiàn)的精度，我們使用phi29DNAP來使DNA的部分通過孔的收縮區(qū)，這產(chǎn)生離子電流中大的且接近線性的斜率。圖2示出產(chǎn)生特別大的電流的DNA中的無堿基位點(diǎn)附近的電平。來自多個(gè)DNA易位的電平的疊加表明電平的可再現(xiàn)性。通過假定電流斜率是線性的和磷酸間距離為690pm，這導(dǎo)致一個(gè)DNA分子的單次通過的僅～35pm的位置不確定性。

在另一個(gè)演示中，我們使用在180mV和140mV的驅(qū)動(dòng)力下的PINT，再次通過phi29DNAP拉動(dòng)DNA。由于DNAP和MspA的收縮區(qū)之間～11個(gè)核苷酸長(zhǎng)的DNA部分的彈性，我們預(yù)計(jì)140mV處的電平模式將相較于180mV處的電平模式遷移。在標(biāo)準(zhǔn)化電流幅度后，我們比較了兩個(gè)電平模式(圖2E和圖3D)，并發(fā)現(xiàn)位移～0.3核苷酸位置的模式。這種遷移與ssDNA的實(shí)驗(yàn)力拉伸曲線是一致的(Smith等人,Science,New Series,271(5250):795–799(1996)；Bosco等人,Nucleic Acids Research,42(3)(2014))，顯示小的DNA運(yùn)動(dòng)通過PINT被良好解析。

在已建立的PINT的精度的情況下，我們需要證明該工具用于研究分子馬達(dá)的有效性。移位酶(包括解旋酶和聚合酶)因許多原因(如它們與人類食物相關(guān))而是特別引人關(guān)注的。例如，解旋酶中的突變牽涉許多病況，例如腦-眼-臉-骨骼綜合征，Bloom、Werners和Rothmund–Thomson、Baller–Gerold以及Warsaw Breakage綜合癥，以及癌癥。人類聚合酶的突變還與許多異常包括線粒體疾病和癌癥相關(guān)聯(lián)。為了確保其復(fù)制，病毒例如HIV、丙型肝炎和埃博拉病毒編碼其基因組中的其自身的解旋酶、聚合酶和/或包裝馬達(dá)。因此，解旋酶和聚合酶已成為潛在的藥物靶點(diǎn)來干擾病毒感染并且這些馬達(dá)的機(jī)械理解是特別有價(jià)值的。

在這里，我們研究了超家族II(SF2)解旋酶hel308。Hel308是ATP-依賴性ski2樣解旋酶/移位酶，其在3'至5'方向上在單條鏈上運(yùn)動(dòng)來解開雙鏈DNA。Hel308被發(fā)現(xiàn)在許多古生菌以及真核生物中是保守的，并且也發(fā)現(xiàn)于人類中。在晶體結(jié)構(gòu)已知的情況下，hel308是用于理解進(jìn)行性SF2酶的很好的模型系統(tǒng)。我們選擇了Thermococcus gammatolerans EJ3(登錄號(hào)YP_002959236.1)的強(qiáng)健hel308。

我們使用與在先前報(bào)道的使用phi29DNAP的DNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)(Manrao,E.A.,等人,Nature Biotechnology 30:349–353(2012),Laszlo等人,Nature Biotechnology32:829–833(2014))中相似或相同的DNA構(gòu)建體(圖2E)，但為了使DNA的5'端朝向MspA的孔腔運(yùn)動(dòng)，如在DNAP實(shí)驗(yàn)的酶活性過程中，我們將互補(bǔ)鏈退火至我們的DNA樣品。當(dāng)單鏈的5'末端突出端行進(jìn)通過MspA的收縮區(qū)時(shí)，互補(bǔ)鏈被幾乎瞬間除去，從而使DNA通過孔，直到它被解旋酶保持住。在ATP的存在下，解旋酶開始將DNA卷回通過孔，最終使其回到順式側(cè)。我們記錄了與酶活性一致的～1000電流跡線。電流模式定性地類似于用phi29DNAP所觀察到的那些(圖3A)，但對(duì)于hel308，我們發(fā)現(xiàn)約兩倍于使用phi29DNAP的電平的電平(圖3B)，即使相同數(shù)目的核苷酸已通過收縮區(qū)。使用其它的DNA序列得到類似的結(jié)果(未示出)。我們的結(jié)論是，PINT的空間和時(shí)間分辨率允許我們直接觀察通過解旋酶的DNA的核苷酸間運(yùn)動(dòng)。在與已知的序列和電流模式(Laszlo等人,Nature Biotechnology32:829–833(2014))比對(duì)并建立共有電流電平模式(圖3A)后，我們觀察到在長(zhǎng)和短電平之間交替的電平的平均持續(xù)時(shí)間。每個(gè)電平的持續(xù)時(shí)間分布通過其自身的時(shí)間常數(shù)表征。圖3C示出了每個(gè)電平的平均持續(xù)時(shí)間，從而進(jìn)一步闡明，每個(gè)單核苷酸前進(jìn)涉及具有不同時(shí)間常數(shù)的兩個(gè)不同的步長(zhǎng)。

為了研究?jī)煞N步長(zhǎng)的起源，我們改變了ATP濃度。圖3D示出了針對(duì)ATP濃度作圖的兩個(gè)步長(zhǎng)的平均持續(xù)時(shí)間(圖3C，3D和3E)。ATP滴定揭示步長(zhǎng)之一是ATP依賴性的，而另一步長(zhǎng)是ATP非依賴性的。在實(shí)驗(yàn)條件(22℃,300mM KCl,5mM MgCl₂和180mV)下，ATP依賴性步長(zhǎng)遵循具有15.2+/-1.3/s的最大速度的Michaelis Menton動(dòng)力學(xué)和92.5+/-9.9μmol的米氏常數(shù)。對(duì)于ATP非依賴性步長(zhǎng)，我們測(cè)得4.5+/0.4s^-1的速率。圖3F表明步長(zhǎng)持續(xù)時(shí)間可取決于序列。我們將每個(gè)步長(zhǎng)的半衰期通過n_off核苷酸與序列偏移關(guān)聯(lián)起來。我們發(fā)現(xiàn)，來自收縮區(qū)的鳥嘌呤14核苷酸與ATP非依賴性步長(zhǎng)中增加的電平持續(xù)時(shí)間(圖3E)相關(guān)聯(lián)。此偏移對(duì)應(yīng)于良好位于hel308內(nèi)的核苷酸位置。

接下來，我們分析了沿著DNA的兩個(gè)子步長(zhǎng)的長(zhǎng)度。我們使用三階樣條來建模從393個(gè)轉(zhuǎn)位事件的一致性衍生的平滑連續(xù)電流輪廓。通過使用ATP依賴性電平，我們將距離內(nèi)插至朝向5'側(cè)的ATP非依賴性電平。步長(zhǎng)長(zhǎng)度在核苷酸間隔單元中的分布通過使用伸直長(zhǎng)度Lc＝690pm/堿基來轉(zhuǎn)換為沿DNA的距離(Bosco等人,Nucleic AcidsResearch,42(3)(2014))。步長(zhǎng)長(zhǎng)度至不確定性加權(quán)步長(zhǎng)尺度分布的擬合產(chǎn)生最可能的0.43±0.11L_c的值。

應(yīng)當(dāng)指出的是，步長(zhǎng)長(zhǎng)度可取決于與MspA邊緣的hel308接觸點(diǎn)的位置。

這種新的單分子技術(shù)的空間和時(shí)間分辨率允許實(shí)時(shí)探究迄今為止觀察不到的酶動(dòng)力學(xué)。PINT的前所未有的實(shí)時(shí)分辨率允許觀察僅幾十皮米的DNA運(yùn)動(dòng)。首先，可令人驚訝的是可實(shí)現(xiàn)這樣的精度，因?yàn)椴祭蔬\(yùn)動(dòng)不斷將酶重新定位在孔上從而影響收縮區(qū)中DNA的位置。然而，布朗運(yùn)動(dòng)以如此高的速率探索所有可能的構(gòu)型，使得毫秒的測(cè)量提供精確的平均值。似乎用PINT觀察到的許多剩余空間以及時(shí)間波動(dòng)可歸因于酶活性?？赡艿氖鞘褂肞INT研究這些波動(dòng)將有助于酶功能的詳細(xì)機(jī)理理解。

類似于許多其它的單分子技術(shù)，PINT施加數(shù)十皮牛頓的力至酶。為了外推至體內(nèi)條件(其通常在較低的力環(huán)境下)，我們通過比較至用光鑷獲取的DNA伸展曲線(Smith等人,Science,New Series,271(5250):795–799(1996)；Bosco等人,Nucleic Acids Research,42(3)(2014))來計(jì)算力。在180mV時(shí)(在此處獲取大量的PINT數(shù)據(jù))，DNA上的力估計(jì)為35±10pN。具有減小的不確定性的直接力測(cè)量正在進(jìn)行中。

PINT的極高的敏感性也可擴(kuò)展至不處理聚合物的其它分子馬達(dá)。通過將DNA附著至這樣的酶或馬達(dá)，將可能的是測(cè)量與酶活性相關(guān)的實(shí)時(shí)的構(gòu)象變化。

表1.PITN與用于研究移位酶活性的最常用的單分子技術(shù)的比較

表1：用于研究移位酶的單分子技術(shù)的比較。

PINT對(duì)于工業(yè)應(yīng)用例如藥物篩選中所需的高通量是高度可平行的。重要的是，PINT是可在許多實(shí)驗(yàn)室中實(shí)踐的簡(jiǎn)單且低成本的單分子技術(shù)。

雖然已示出和描述了舉例說明性實(shí)施方案，但是將理解，在其中可進(jìn)行各種改變而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。