本發(fā)明屬于海洋生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海綿提取物的生物活性srb測定方法。
背景技術(shù)：
海洋生物堿作為海洋生物的一種特征次級代謝產(chǎn)物，以其結(jié)構(gòu)的新穎性、多樣性和顯著的生物活性成為海洋天然產(chǎn)物的重要研究對象。到目前為止，海洋來源的天然產(chǎn)物已經(jīng)超過20000個，其中約三分之一的化合物含有氮原子，在46個海洋藥物中，33個屬于生物堿。海綿一直是海洋生物堿的主要來源，研究報道calcarea綱中富含咪唑生物堿，在過去的30年中，共分離得到60多個咪唑生物堿。這類生物堿具有顯著的抗菌、抗炎和細胞毒活性。
海綿是生物堿的主要來源，這些生物堿具有結(jié)構(gòu)類型新穎，生物活性好的特征。calcarea綱的海綿分布與全球各個海域，其中l(wèi)eucetta和clathrina屬海綿被報道其特征性化學成分為咪唑類生物堿，在過去30年中，從這兩個屬中分離到的咪唑類生物堿已超過60個。咪唑類生物堿的結(jié)構(gòu)以2-氨基咪唑環(huán)為基本母核，2位氨基通常連有取代基乙內(nèi)酰脲，n1，c-4，c-5位常連有苯環(huán)取代基，c-4，c-5位連有苯環(huán)的稱為naamines或naamidines，n1，c-4位連有苯環(huán)的結(jié)構(gòu)類型稱作isonaamines或isonaamidines。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在為海綿的提取物提供一種方便可靠的生物活性測定方法。
一種海綿提取物的生物活性srb測定方法，步驟如下：
(1)取對數(shù)期的腫瘤細胞，用新鮮的rpmi-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞懸液的濃度為2×105個/ml，每孔200μl加入96孔板中，每孔加入不同濃度的樣品溶液2μl；
(2)37oc培養(yǎng)17h；
(3)離心3min(4oc、3000prm)，吸去上清；
(4)每孔加入50μl預冷的80%tca溶液，移入4oc冰箱中固定1.5h，再用去離子水沖洗5次，室溫晾干；
(5)每孔加入0.5%srb染液(1%的tca溶液)50μl，室溫靜置30min后，用預冷的1%tca水溶液沖洗4次，去除未結(jié)合的染料，室溫晾干；
(6)每孔加入150μl非緩沖tris溶液溶解(10mm，ph=10.5)與蛋白結(jié)合的染料，用酶標儀在520nm下測定每孔吸光度od值。在96孔板中每個樣品濃度設(shè)3孔，另設(shè)空白對照3孔，取3孔平均值，按公式ir(%)=(od空白-od樣品)/od空白×100%計算細胞增殖抑制率(ir%)，再利用bliss方法由各種濃度的ir求出半數(shù)抑制濃度(ic50)的標準差和平均值。
本發(fā)明的測定原理：磺酰羅丹明b(sulforhodamineb，srb)比色法，主要用來檢測細胞增殖情況。srb是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合；在520nm波長下產(chǎn)生吸收峰，吸光值與細胞量成線性正相關(guān)，故可用作細胞數(shù)的定量檢測。
本發(fā)明的測定方法相對于現(xiàn)有技術(shù)簡單快速、而且檢測結(jié)果可靠，適于推廣應用。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
選擇hela和a549腫瘤細胞株用srb法對從海綿分離得到的咪唑生物堿類化合物(ph-1~ph-5)進行了體外抗腫瘤活性篩選，對初篩結(jié)果見表1-2，分析表中數(shù)據(jù)可以看出在濃度為50μm濃度水平，化合物ph-4對腫瘤細胞株hela、a549表現(xiàn)出強的抑制活性，抑制率在90%左右，化合物ph-5對兩種腫瘤細胞株均表現(xiàn)出強的抑制活性，抑制率都在90%以上，化合物(ph-1~ph-3)對兩種細胞株的抑制活性均較弱。
表1化合物ph-1~ph-5對hela腫瘤細胞株的抑制率(%)
表2化合物ph-1~ph-5對a-549腫瘤細胞株的抑制率(%)
對初篩活性較好的化合物(抑制率大于30%)進行了ic50測試。ic50結(jié)果顯示化合物ph-4對hela和a549細胞株顯示出中等強度的抑制活性,ic50值分別為21.4和22.1um。由此可以看出化合物ph-4，ph-5對腫瘤細胞株具有高度的選擇性，且對k562細胞株具有較強的細胞毒活性。