本發(fā)明涉及食品分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種奶粉中多種摻雜物同時檢出的方法。

背景技術(shù)：

奶粉行業(yè)普遍采用的檢測蛋白質(zhì)含量的方法是凱氏定氮法。凱氏定氮法并非直接檢測蛋白質(zhì)含量，而是通過測氮含量從而推算蛋自質(zhì)含量。三聚氰胺是一種重要的氮雜環(huán)有機化上原料，是重要的尿素后加工產(chǎn)品。三聚氰胺含氮量高達66％，若將其摻入奶制品就可以在檢測中造成蛋自質(zhì)含量達標的假象。2007年初，美國發(fā)生多起貓狗寵物中毒死亡事件正是非法添加三聚氰胺造成的。美國食品藥品管理局(fda)調(diào)查發(fā)現(xiàn)食用三聚氰胺可導(dǎo)致腎衰竭甚至死亡；2008年我國報道了食用被三聚氰胺污染的乳制品導(dǎo)致嬰幼兒結(jié)石及死亡病例。隨著食品安全法規(guī)的不斷完善及三聚氰胺檢測技術(shù)的不斷創(chuàng)新，添加三聚氰胺的乳制品漸漸淡出了公眾的視線，然而，非法添加現(xiàn)象并未終止。2013年，新型奶粉添加物二聚氰胺于新西蘭奶制品中被檢出。含有，吸入、攝入或經(jīng)皮膚吸收二聚氰胺后會對身體產(chǎn)生危害，如何檢測奶制品中二聚氰胺殘留量成為人們關(guān)心的問題。無獨有偶，為達到有效的抑菌、保鮮的作用，不法商販在原料乳及奶粉中摻入硫氰酸鈉的報道層出不窮，食入少量的硫氰酸鈉會對人體造成極大傷害。衛(wèi)生部發(fā)布的《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)》中明確規(guī)定乳及乳制品中硫氰酸鈉為違法添加物質(zhì)。傳統(tǒng)的檢測檢測方法只針對三聚氰胺顯然已經(jīng)不適宜，對市場頻繁出現(xiàn)的非法添加二聚氰胺及硫氰酸鈉的其他添加物，甚至多種添加物混合使用的現(xiàn)象，急需建立新的檢測方法并開發(fā)一種多種摻偽物同時快速、準確檢出的有效方法。

目前，高效液相色譜法(hplc)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gc-ms)、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(lc-ms)三種方法已成為原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測的國家標準，檢測定量限分別為2mg/kg、0.05mg/kg和0.01mg/kg，這些方法檢測準確度高，但分析時間長、樣品前處理復(fù)雜，儀器成本高，不適宜現(xiàn)場的快速檢測；新型檢測方法如比色法，文件201310087869.x中報道選用熒光光度計，采用比色法觀察520nm處波長變化檢測三聚氰胺；文件cn201410183172.7采用紫外吸收-化學(xué)計量學(xué)技術(shù)，分別檢測奶制品中的三聚氰胺或雙氰胺。這些方法中最引人注意的是表面增強拉曼光譜技術(shù)(sers)。

sers技術(shù)使拉曼光譜的檢測限提高4至10個數(shù)量級，甚至可達十萬億分之一，不僅在物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析方面，而且在痕量化學(xué)物質(zhì)快速檢測方面也越來越顯示出巨大的潛力。中國專利文獻cn103878382a公開了一種采用自制的特殊金納米晶體成功檢測奶制品中三聚氰胺，但此種基底制備難度大，成本高，且液態(tài)sers基底不穩(wěn)定，僅適合實驗室內(nèi)制備及應(yīng)用。另外，針對雙氰胺、硫氰酸鈉等新型添加劑的檢測報道并不多，針對多種添加物同時檢出的方法亦寥寥無幾。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種奶粉中多種摻雜物同時檢出的方法。

本發(fā)明的第一方面，提供一種奶粉中多種摻雜物同時檢出的方法，在拉曼光譜儀中施行，所述的摻雜物為三聚氰胺、雙氰胺和硫氰酸鈉。

所述的拉曼光譜儀為bws415-785h型便攜式拉曼光譜儀，激發(fā)波長785nm。

具體包括以下步驟：

步驟一：殼聚糖-sers紙色譜的制備

準確稱取適量殼聚糖，溶于質(zhì)量濃度1％(100ml)鹽酸溶液中，制備質(zhì)量濃度0.5％-1％的殼聚糖溶液(優(yōu)選0.5％)。

取定量濾紙浸泡于上述溶液中0.5-1h(優(yōu)選0.5h)，取出自然晾干得到殼聚糖-濾紙；將殼聚糖-濾紙浸泡于0.05m硝酸銀溶液中1-10min后取出(優(yōu)選3min)，再置于0.1m硼氫化鈉溶液中還原，反應(yīng)結(jié)束后，取出自然晾干并裁剪成1cm×5cm，得到殼聚糖-sers紙色譜。

步驟二：奶粉樣品前處理

準確稱取1g的全脂待測奶粉，將其溶解于10ml0.1m的鹽酸溶液，奶粉溶液采用殼聚糖-濾紙進行過濾，濾液待用。

步驟三：紙色譜的分離及sers檢測

移取約0.3～0.8μl(優(yōu)選0.5μl)上述濾液點于新制備殼聚糖-sers紙色譜上(距離底部1cm)，干燥片刻后采用乙醇-冰乙酸-水(0.5：0.1：1)展開體系進行展開；展距為3.0～4.0cm(優(yōu)選3.5cm)時取出并立即進行sers檢測(每隔0.1～0.3cm，優(yōu)選0.2cm掃描一個點)。

步驟四：摻雜物判定

如果步驟三中掃描得到的拉曼光譜圖為空白譜圖，則判定該奶粉未摻雜；如果步驟三中得到的拉曼光譜圖為非空白譜圖，則將該拉曼光譜圖與3種摻雜物的標準拉曼光譜圖進行比對，當該拉曼光譜圖中的至少兩個特征峰的出峰位置與某一摻雜物的標準拉曼光譜圖的特征峰的出峰位置一致，則判定待檢奶粉含有該摻雜物。(3種標準拉曼光譜圖為0.1mg/ml標準溶液點于普通sers紙色譜上檢測所得光譜)

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、自制sers紙色譜制備方法簡單、成本較低、分離效果佳；拉曼光譜儀攜帶方便，因此本發(fā)明適合進行現(xiàn)場快檢；

2、奶粉樣品前處理過程簡便，僅需過濾；

3、逐點將所得的非空白譜圖與含有3種摻偽物拉曼光譜圖的標準圖進行比對，即可快速判定是否含有摻偽物，無需隨行對照實驗；

4、選用展開劑毒性較小，環(huán)保健康，采用其他展開劑無法實現(xiàn)摻偽物的分離；

5、樣品的分離檢測用時少于25分鐘，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速的檢測。

附圖說明

圖1:本發(fā)明中殼聚糖-sers紙色譜制備流程圖；

圖2：3種摻偽物結(jié)構(gòu)圖；

圖3：(a)3種摻偽物的標準圖譜；(b)3種摻偽物混合圖譜及奶粉溶液過濾前后中3種摻偽物的圖譜；

圖4：普通sers紙色譜(a)與殼聚糖-sers紙色譜(b、c)分離檢測3種摻偽物比較圖；

圖5：用殼聚糖-sers紙色譜分離檢測奶粉溶液中3種摻偽物；

圖6：采用殼聚糖-sers紙色譜分離檢測奶粉溶液中3種摻偽物的檢測限：(a)三聚氰胺；(b)雙氰胺；(c)硫氰酸鈉。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1

一、儀器和樣品

(1)儀器：bws415-785h型便攜式拉曼光譜儀(美國必達泰克公司)，激發(fā)波長785nm；

二、sers紙色譜的制備

(1)普通sers紙色譜的制備：將普通定量浸泡于0.05m硝酸銀溶液中數(shù)分鐘后取出，采用0.1m硼氫化鈉溶液還原，反應(yīng)結(jié)束后，取出自然晾干并裁剪成1cm×5cm普通sers紙色譜條。

(2)殼聚糖-sers紙色譜的制備：準確稱取5g～10g殼聚糖，溶于1％(100ml)鹽酸溶液中，制備0.5％～1％的殼聚糖溶液。取定量濾紙浸泡于上述溶液中0.5h～1h，取出自然晾干，得到殼聚糖-濾紙；將殼聚糖-濾紙浸泡于0.05m硝酸銀溶液中1～10min后取出，再至于0.1m硼氫化鈉溶液中還原，反應(yīng)結(jié)束后，取出自然晾干并裁剪成1cm×5cm殼聚糖-sers紙色譜條備用，如流程圖1所示。

其中，殼聚糖的最優(yōu)濃度為0.5％；濾紙的浸泡殼聚糖時間0.5h為宜；殼聚糖-濾紙浸泡硝酸銀溶液的最佳時間為3min。

三：待測溶液的制備及sers圖譜的獲得

分別準確稱取1mg三聚氰胺、雙氰胺、硫氰酸鈉(結(jié)構(gòu)如圖2所示)溶于10ml0.1m鹽酸溶液中，制備0.1mg/ml標準溶液備用；準確稱取1mg三聚氰胺、雙氰胺、硫氰酸鈉溶于10ml0.1m鹽酸溶液中，制備0.1mg/ml標準混合溶液備用；準確稱取1mg三聚氰胺、雙氰胺、硫氰酸鈉及1g全脂奶粉，將四者充分混合后采用0.1m10ml鹽酸溶液，奶粉溶液采用殼聚糖-濾紙進行過濾，濾液待用。

移取約0.3～0.8μl上述3種標準溶液點于新制備的普通sers紙色譜上，即可獲得3種摻偽物的標準sers圖譜(圖3a)；移取約0.3～0.8μl上述標準混合溶液、添加摻偽物的奶粉溶液及濾液分別點于新制備的普通sers紙色譜上，即可獲得相應(yīng)的sers圖譜(圖3b)。其中，移取溶液0.5μl最佳。

如圖3a所示，3種特征峰明顯且容易區(qū)分；

如圖3b所示，3種摻偽物的混合圖譜僅顯示了三聚氰胺的特征峰，二聚氰胺及硫氰酸鈉的峰被掩蓋，驗證本發(fā)明采用分離后檢測的必要性；添加摻偽物的奶粉溶液sers圖譜較弱，經(jīng)殼聚糖-濾紙過濾后sers強度明顯增強，說明殼聚糖-濾紙過濾大分子等作用良好。

四：標準混合物的色譜分離及sers檢測

移取約0.3～0.8μl上述標準混合溶液點于距底部1cm新制備的sers色譜上(包括普通sers紙色譜及殼聚糖-sers紙色譜)，干燥片刻后采用乙醇-冰乙酸-水(0.5:0.1:1及2.5:0.5:7)展開體系進行展開；展距為3～4cm時取出并立即進行sers檢測(每隔0.1～0.3cm掃描一個點)，結(jié)果如圖4所示。

其中，移取溶液0.5μl最佳；優(yōu)化展開劑為乙醇-冰乙酸-水(0.5:0.1:1)；展距3.5cm為宜；掃描可間隔0.2cm。

選取逐點掃描sers光譜進行對比，通過譜段選取(300cm^-1～2200cm^-1)、基線校正(airpls法)、平滑(sgolay法)進行預(yù)處理后，比較sers圖譜的差別。如圖4a及4b比較可知：選用乙醇-冰乙酸-水(0.5:0.1:1)的展開體系，普通sers紙色譜無法實現(xiàn)3種純品摻偽物的分離，出現(xiàn)混合峰，說明相比于普通sers紙色譜，本發(fā)明的殼聚糖-sers紙色譜分離檢測3種摻偽物的分離度更高；如圖4b及4c比較可知，當同時選用殼聚糖-sers紙色譜時，選用乙醇-冰乙酸-水(0.5:0.1:1)為展開劑才能實現(xiàn)3種摻偽物的分離，說明本發(fā)明選取的展開劑較佳。

五：奶粉濾液色譜分離、sers檢測及摻偽物檢測限的測定

移取約0.3～0.8μl上述奶粉濾液于距底部1cm的新制備殼聚糖-sers紙色譜，干燥片刻后采用乙醇-冰乙酸-水(0.5:0.1:1)展開體系進行展開；展距為3～4cm時取出并立即進行sers檢測(每隔0.1～0.3cm掃描一個點)，結(jié)果如5所示。分別降低3種摻偽物的濃度，以確定奶粉中的檢測限，如圖6。

其中，移取溶液0.5μl最佳；展距3.5cm為宜。

如圖5所示，待檢奶粉濾液中所測sers圖譜與標準譜圖完全相同，由此可判定該奶粉中同時添加有3種摻偽物；如圖6所示，待檢奶粉中最低可檢出1ppm的三聚氰胺(a)，完全符合fda及cfda的要求。二聚氰胺(b)及硫氰酸鈉(c)屬于不得檢出物質(zhì)，本發(fā)明檢測限可完全滿足需求。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。