本發(fā)明屬于尼莫克汀含量的檢測，具體的涉及一種基于液相色譜儀檢測尼莫克汀含量的方法。
背景技術：
尼莫克汀(Nemadectin)是一種十六元大環(huán)內酯類抗生素，由藍灰鏈霉菌Streptomyces cyaneogriseus sp.Noncyanogenus經發(fā)酵過程生產。作為米爾貝霉素族的一員，表現(xiàn)出很好的抗寄生蟲活性,作為抗寄生蟲抗生素,尼莫克汀具有殺蟲譜廣,易降解,低殘留,無抗藥性,對人畜安全,尼莫克汀主要用于合成活性更強的農藥獸藥莫西克汀(Moxidectin)。
目前尼莫克汀含量的檢測在中國及EP、USP藥典上均未體現(xiàn)。作為莫西克汀原料，尼莫克汀含量的檢測及其合適有效的檢測方法就尤為重要。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種準確度高，重復性好，線性關系數(shù)可達0.999，精密度RSD≤2.0％，靈敏度高的基于液相色譜儀檢測尼莫克汀含量的方法。
為解決上述技術問題，本發(fā)明所采取的技術方案是：一種基于液相色譜儀外標法檢測尼莫克汀含量的方法，其特征在于：包括如下步驟：
a、制備供試品溶液和對照品溶液
精密稱取相同質量的尼莫克汀供試品、尼莫克汀對照品置于兩個容量瓶中，分別加95％乙醇溶解并定容至同一刻度，均混合均勻制備為供試品溶液和對照品溶液；
b、高效液相色譜測定
同體積定量精密稱取步驟a中的供試品溶液與對照品溶液進行高效液相色譜測定，色譜條件為：
色譜柱選用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；
柱溫：25-35℃；
流動相：85％甲醇；
流速：1.0～1.5mL/min；
檢測波長：240nm；
進樣量：20μL。
進一步的技術方案在于，經過步驟b高效液相色譜測定后采用外標法對尼莫克汀供試品中尼莫克汀含量進行計算。
進一步的技術方案在于，所述外標法的計算公式如下：
式中：M對、M供：分別為尼莫克汀對照品和尼莫克汀供試品稱重，單位：mg；
A對、A供：分別為尼莫克汀的對照品溶液、供試品溶液主峰面積；
f：對照品溶液連續(xù)3次進樣校正因子f平均值；
P％：尼莫克汀對照品百分含量；
P1％：尼莫克汀供試品百分含量。
進一步的技術方案在于，所述色譜柱的規(guī)格為4.6*150mm 5μm。
進一步的技術方案在于，所述的步驟b中色譜柱的柱溫優(yōu)選為30℃。
進一步的技術方案在于，所述的步驟b中色譜柱流速優(yōu)選為1.0mL/min。
進一步的技術方案還在于，所述的步驟b中色譜柱的型號為Luna C18。
采用上述技術方案所產生的有益效果在于：本發(fā)明能準確地檢測出尼莫克汀含量，準確度高，重復性好，線性關系數(shù)可達0.999，精密度RSD≤2.0％，靈敏度高，結果令人滿意。
附圖說明
下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
圖1是尼莫克汀濃度與峰面積線性關系曲線圖。
具體實施方式
下面結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發(fā)明內涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施例的限制。
本發(fā)明包括如下步驟：
a、制備供試品溶液和對照品溶液
精密稱取相同質量的尼莫克汀供試品、尼莫克汀對照品置于兩個容量瓶中，分別加95％乙醇溶解并定容至同一刻度，均混合均勻制備為供試品溶液和對照品溶液；
b、高效液相色譜測定
同體積定量精密稱取步驟a中的供試品溶液與對照品溶液進行高效液相色譜測定，色譜條件為：
色譜柱選用十八烷基硅烷鍵合硅膠柱；
柱溫：25-35℃；
流動相：85％甲醇；
流速：1.0～1.5mL/min；
檢測波長：240nm；
進樣量：20μL。
優(yōu)選的，經過步驟b高效液相色譜測定后采用外標法對尼莫克汀供試品中尼莫克汀含量進行計算。
優(yōu)選的，所述外標法的計算公式如下：
式中：M對、M供：分別為尼莫克汀對照品和尼莫克汀供試品稱重，單位：mg；
A對、A供：分別為尼莫克汀的對照品溶液、供試品溶液主峰面積；
f：對照品溶液連續(xù)3次進樣校正因子f平均值；
P％：尼莫克汀對照品百分含量；
P1％：尼莫克汀供試品百分含量。
優(yōu)選的，所述色譜柱的規(guī)格為4.6*150mm 5μm。
優(yōu)選的，所述的步驟b中色譜柱的柱溫優(yōu)選為30℃。
優(yōu)選的，所述的步驟b中色譜柱流速優(yōu)選為1.0mL/min。
優(yōu)選的，所述的步驟b中色譜柱的型號為Luna C18。
本發(fā)明為解決尼莫克汀含量的檢測，提供了一種基于液相色譜儀檢測尼莫克汀含量的方法。下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
1.儀器與試劑
1.1儀器
1.2試劑
2.溶液配制
對照品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀對照品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，混合均勻。
供試品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀供試品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，混合均勻。
3.色譜條件
色譜柱：Luna C184.6*150mm 5.0um
柱溫：30℃
波長：240nm
流速：1.0mL/min
進樣量：20μl
分析時間：20min
流動相：85％甲醇溶液
4.測定方法
精密量取對照品、供試品溶液20ul，自動進樣，注入液相色譜儀，按外標法計算尼莫克汀含量。
外標法的計算公式如下：
式中：M對、M供：分別為尼莫克汀對照品和尼莫克汀供試品稱重，單位：mg；
A對、A供：分別為尼莫克汀的對照品溶液、供試品溶液主峰面積；
f：對照品溶液連續(xù)3次進樣校正因子f平均值；
P％：尼莫克汀對照品百分含量；
P1％：尼莫克汀供試品百分含量。
5.驗證試驗
5.1系統(tǒng)適用性試驗
5.1.1試驗過程
精密量取尼莫克汀對照品溶液20μl，自動進樣，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣5次，記錄色譜圖。計算主峰面積和保留時間RSD。
連續(xù)5次進樣，主峰面積RSD≤1.0％，主峰保留時間RSD≤0.5％，理論塔板數(shù)N(以主峰計)≥3000。
5.1.2試驗結果
5.1.3試驗結論
連續(xù)5次進樣，主峰面積RSD為0.47％，＜1.0％；主峰保留時間RSD為0.0％，＜0.5％；理論塔板數(shù)N均＞3000；系統(tǒng)適用性試驗通過。
5.2專屬性實驗
5.2.1試驗過程
供試品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀供試品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，混合均勻。
酸破壞試液：稱取尼莫克汀供試品25.0mg，置于50ml容量瓶中，加95％乙醇10ml使完全溶解，再加2M鹽酸2ml，室溫下放置30min，加2M氫氧化鈉2ml中和后，用95％乙醇定容至刻度。同法制備酸破壞空白溶液。
堿破壞試液：稱取尼莫克汀供試品25.0mg，置于50ml容量瓶中，加95％乙醇10ml使完全溶解，再加0.5M氫氧化鈉2ml，室溫下放置30min，加0.5M鹽酸2ml中和后，用95％乙醇定容至刻度。同法制備堿破壞空白溶液。
氧化破壞試液：稱取尼莫克汀供試品25.0mg，置于50ml容量瓶中，加95％乙醇10ml使完全溶解，再加30％雙氧水2ml，置于室溫下放置30min后，用95％乙醇定容至刻度。同法制備氧化破壞空白溶液。
精密量取尼莫克汀供試品、酸、堿、氧化試液及相應的空白溶液各20μl，自動進樣，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。
尼莫克汀與相鄰峰的分離度R主峰、R主峰后雜質均≥1.5，理論塔板數(shù)N≥3000。并有效記錄雜質變化情況。
5.2.2試驗結果
5.2.3試驗結論
尼莫克汀供試品在酸、堿、氧化破壞試驗中主峰與相鄰峰的分離度R主峰分別為：1.75、1.68、1.59，R主峰后雜質分別為2.49、2.45、1.98，均＞1.5，主峰理論塔板數(shù)N分別為4598、4433、4072，均＞3000。
酸破壞條件，RRT為0.40、0.46、0.54、0.63、0.67、0.79、0.84、0.90、1.13、1.28、1.36的雜質被破壞掉；且RRT為1.50、1.81的為新生成的雜質，RRT為0.40、1.13、1.36雜質較大，分別為1.07％、14.7％、2.25％。
堿破壞條件，RRT為0.40、0.46、0.54、0.63、0.67、0.79、0.84、0.90、1.13、1.28、1.36的雜質被破壞掉，RRT為1.13、1.36雜質較大，分別為6.05％、2.39％。
氧化破壞條件，RRT為0.40、0.46、0.54、0.67、0.79、0.84、0.90、
1.13、1.36的雜質被破壞掉。
綜上得知，酸、堿條件對尼莫克汀主峰的影響較大，氧化破壞對尼莫克汀主峰影響稍小，且上述條件下尼莫克汀主峰的分離度R主峰，R主峰后雜質均＞1.5，主峰理論塔板數(shù)均＞3000，專屬性驗證通過。
5.3溶液穩(wěn)定性
5.3.1試驗過程
對照品溶液：對照品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀對照品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，混合均勻。
取制備好的對照品溶液，按下表室溫(約25℃)下，放置不同時間進樣。各放置時間點試液與0h相比，對照品溶液中主峰面積相對平均偏差RAD≤1.0％。
5.3.2試驗結果
5.3.3試驗結論
由以上結果可知，供試品溶液在室溫下(約25℃)放置6h，主峰面積與放置0h相比RAD為0.76％，＜1.0％，說明供試品溶液在室溫(約25℃)下放置6h內穩(wěn)定。
5.4定量限
5.4.1試驗過程
對照品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀對照品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，混合均勻。
精密量取95％乙醇20μl，自動進樣，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣兩次，記錄色譜圖。取尼莫克汀保留時間±1min范圍內，一段平直的基線計算噪音n。
逐步稀釋供試品溶液，至主峰響應信號s(扣去空白干擾后的峰高)約為噪音n的10倍，對應的濃度即為莫西菌素的定量限，定量限試液至少連續(xù)進樣3次，計算尼莫克汀峰面積的RSD。定量限s/n為8-12，連續(xù)進樣峰面積RSD≤20％。
5.4.2試驗結果
5.4.3試驗結論
由以上結果可知，當對照品溶液濃度為3.75×10-3μg/ml時，s/n為9.5，在8-12之間，主峰峰面積RSD為1.96％，<20％。定量限檢測通過。
5.5線性實驗
5.5.1試驗過程
150％線性試液：取尼莫克汀對照品約37.5mg，置于50ml容量瓶中，精密稱定，用95％乙醇稀釋定容。
120％線性試液：取尼莫克汀對照品約30.0mg，置于50ml容量瓶中，精密稱定，用95％乙醇稀釋定容。
100％線性試液：取尼莫克汀對照品約25.0mg，置于50ml容量瓶中，精密稱定，用95％乙醇稀釋定容。
80％線性試液：取尼莫克汀對照品約20.0mg，置于50ml容量瓶中，精密稱定，用95％乙醇稀釋定容。
50％線性試液：取尼莫克汀對照品約12.5mg，置于50ml容量瓶中，精密稱定，用95％乙醇稀釋定容。
精密量取50％至150％線性試液各20μl，自動進樣，注入液相色譜儀，每個濃度各連續(xù)進樣三次。計算150％至50％線性試液中主峰連續(xù)三次進樣的平均峰面積和峰面積RSD，試液濃度與平均峰面積的線性關系方程及相關系數(shù)R2。
150％至50％，試液濃度與主峰平均峰面積線性相關系數(shù)R2≥0.999，連續(xù)三次進樣峰面積RSD≤2.0％。
5.5.2試驗結果
尼莫克汀濃度與峰面積線性關系曲線圖如圖1所示。
5.5.3試驗結論
150％至50％，試液濃度與主峰平均峰面積線性方程為：y＝1.0110x+16.512；線性相關系數(shù)R2為0.9992，＞0.999；連續(xù)三次進樣峰面積RSD均＞2.0％。線性試驗通過。
5.6精密度
5.6.1試驗過程
對照品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀對照品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，混合均勻。
供試品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀供試品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，混合均勻。
重復性：采用系統(tǒng)適用性試驗數(shù)據(jù)評價。
中間精密度：不同人員、時間條件下，按8.1.4、8.1.5中所述色譜條件和測定方法檢測2S141209批尼莫克汀含量。每個條件每批各平行測定三次。
重復性：主峰峰面積的RSD≤2.0％。
中間精密度：每組和所有數(shù)據(jù)，2S141209批含量結果的相對標準偏差RSD≤1.0％。
5.6.2試驗結果
重現(xiàn)性試驗結果同線形80％、100％、120％數(shù)據(jù)。
中間精密度試驗結果如下：
5.6.3試驗結論
重現(xiàn)性：線形80％、100％、120％主峰峰面積RSD分別為0.82％、0.98％和0.32％，均＜2.0％。重復性驗證通過。
中間精密度：不同人員、時間條件下，檢測2S141209批含量結果所有數(shù)據(jù)的相對標準偏差RSD為0.36％，＜1.0％。中間精密度驗證通過。
5.7準確度
5.7.1試驗過程
對照品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀對照品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度。
加標溶液：分別稱取尼莫克汀對照品10.0mg、12.0mg、15.0mg于50mL容量瓶中，再依次加入尼莫克汀供試品10.0mg、12.0mg、15.0mg，分別標記為加標溶液1、2、3。
精密量取對照品溶液、加標溶液1、加標溶液2、加標溶液3各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)以下計算公式計算中間體加標回收率。
加標回收率％＝實測值/理論值*100％
理論值＝(W對*P對％+W供*P供％)/V加
其中：f：對照品溶液連續(xù)多次進樣校正因子f平均值；
Ax：加標溶液的峰面積；
W對、W供：分別為尼莫克汀對照品及尼莫克汀供試品稱重，單位：mg；
P對％、P供％：分別為尼莫克汀對照品及尼莫克汀供試品百分含量；
V加：加標溶液定容后體積，50mL。
各加標試液的回收率應在90％～110％之間；各加標試液數(shù)據(jù)的回收率的相對標準偏差RSD≤2.0％。
5.7.2試驗結果
5.7.3試液結論
各加標試液的回收率均在90％～110％之間，所有數(shù)據(jù)回收率RSD為0.20％，＜2.0％，回收率試驗通過。
5.8范圍
綜合分析線性、準確度、精密度試驗結果，確定分析方法的檢測范圍為50％-150％。
5.9耐用性實驗
5.9.1試驗過程
對照品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀對照品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，混合均勻。
供試品溶液：精密稱取25.0mg尼莫克汀供試品于50mL容量瓶中，加95％乙醇溶解并定容至刻度，混合均勻。
分別更改流速1.0±0.02ml/min、柱溫30±2℃，更換色譜柱為安捷倫(ZORBAX SB-C184.6*250mm 5μm)，制備對照品溶液、供試品溶液各1份，分別精密量取20μl，注入液相色譜儀。(采用正常條件下的系統(tǒng)適用性試驗計算的校正因子f計算條件改變后尼莫克汀供試品含量)通過系統(tǒng)適用性與尼莫克汀供試品檢測結果兩方面評價此方法的耐用性。
在流速、柱溫、色譜柱廠家改變后，對照品溶液主峰理論塔板數(shù)N≥3000；尼莫克汀主峰與相鄰峰的分離度R主峰均≥1.5；與原色譜條件相比供試品含量RAD≤2.0％。
5.9.2實驗結果
5.9.3試驗結論
原色譜條件：連續(xù)5次進樣，主峰面積RSD為0.47％，＜1.0％；理論塔板數(shù)N為3660，＞3000；
變更溫度：①28℃，對照品主峰理論塔板數(shù)N為3557，＞3000，主峰與相鄰峰的分離度R主峰為1.59，＞1.5，與原色譜條件相比供試品含量RAD為0.83％，＜2.0％；②32℃，對照品主峰理論塔板數(shù)N為3661，＞3000，主峰與相鄰峰的分離度R主峰為1.52＞1.5，與原色譜條件相比供試品含量RAD為0.53％，＜2.0％；
變更流速：①0.98ml/min，對照品主峰理論塔板數(shù)N為3828，＞3000，主峰與相鄰峰的分離度R主峰為1.57，＞1.5，與原色譜條件相比供試品含量RAD為1.52％，＜2.0％；②1.02ml/min，對照品主峰理論塔板數(shù)N為3664，＞3000，主峰與相鄰峰的分離度R主峰為1.54，＞1.5，與原色譜條件相比供試品含量RAD為0.48％，＜2.0％；
變更色譜柱：連續(xù)5次進樣，對照品主峰面積RSD為0.03％，＜1.0％；理論塔板數(shù)N為6196，＞3000，主峰與相鄰峰的分離度R主峰為1.57，＞1.5，與原色譜條件相比供試品含量RAD為0.29％，＜2.0％。耐用性通過試驗。
通過系統(tǒng)適用性試驗、專屬性、溶液穩(wěn)定性、定量限、線性、精密度、準確度、范圍及耐用性等試驗充分驗證了本方法的準確、科學性。