檢測(cè)和分析艱難梭菌菌株的組合物和試劑盒及用該組合物和試劑盒檢測(cè)艱難梭菌菌株的方法
【專利摘要】一種用于檢測(cè)艱難梭菌(Clostridium?difficile)的組合物和試劑盒，該組合物包括用于檢測(cè)艱難梭菌菌株的引物套組，和一種通過使用該組合物和試劑盒來檢測(cè)艱難梭菌的方法。依照該方法，可以在短時(shí)間內(nèi)以高準(zhǔn)確度和靈敏度自樣品檢測(cè)出艱難梭菌菌株。
【專利說明】檢測(cè)和分析艱難梭菌菌株的組合物和試劑盒及用該組合物和試劑盒檢測(cè)艱難梭菌菌株的方法
[0001]對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2012年6月8日提交給韓國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)局的韓國(guó)專利申請(qǐng)N0.10-2012-0061671的權(quán)益，通過引用將其公開內(nèi)容完整收入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本公開內(nèi)容涉及包括,用于檢測(cè)艱難梭菌(Clostridium difficile)菌株或有毒艱難梭菌菌株的引物套組的組合物和試劑盒，及通過使用所述組合物或試劑盒來檢測(cè)樣品中的艱難梭菌菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]艱難梭菌是厭氧的、能形成孢子的梭菌屬革蘭氏陽性細(xì)菌的一個(gè)物種。
[0005]艱難梭菌是抗生素相關(guān)腹瀉的最嚴(yán)重原因，而且能引起假膜性結(jié)腸炎和一種嚴(yán)重的結(jié)腸感染，常常導(dǎo)致抗生素對(duì)正常腸菌群的根除。在身體中天然駐留的艱難梭菌變得過度生長(zhǎng)。該過度生長(zhǎng)是有害的，因?yàn)樵摷?xì)菌釋放能引起胃氣脹、便秘、和腹瀉(帶有腹痛)的毒素。潛在的癥狀常常模擬一些流感樣癥狀。停止病因性抗生素的治療常常能治愈。
[0006]艱難梭菌感染在嚴(yán)重性上可以是從無癥狀到嚴(yán)重和危及生命的范圍，尤其是在老年人中。人們最通常在醫(yī)院、療養(yǎng)院、或收容所(institutions)中被感染，不過社區(qū)中、門診環(huán)境中的艱難梭菌感染也越來越多。獲得艱難梭菌的比例在住院長(zhǎng)至2周的患者中估計(jì)為13%，而在住院長(zhǎng)過4周的患者中估計(jì)為50%。艱難梭菌結(jié)腸炎的頻率和嚴(yán)重性仍然較高，而且似乎與死亡率升高有關(guān)。早期干預(yù)和攻擊性管理是恢復(fù)的關(guān)鍵因素。
[0007]艱難梭菌的毒力因子是毒素A、毒素B、一種二元毒素、和一種高毒毒素。毒素A( —種腸毒素)由tcdA基因編碼。毒素B (—種腸毒素)由tcdB基因編碼。二元毒素由cdtA和cdtB基因編碼，而且尚未發(fā)現(xiàn)它的毒力機(jī)制。高毒毒素涉及有毒NAP1/BI/027菌株，而且是由A117tcdC SNP(單核苷酸多態(tài)性)引起的。2005年報(bào)告了一種新的、高度有毒的艱難梭菌菌株的出現(xiàn)，它對(duì)氟喹諾酮抗生素，諸如Cipro(環(huán)丙沙星(ciprofloxacin))和Levaquin(左氧氟沙星(Ievofloxacin))有抗性,據(jù)說在北美洲引起地理性分散突發(fā)。
[0008]在將這些毒力基因用于分子診斷時(shí)，存在基因變異所致錯(cuò)誤發(fā)生的可能性和變異所致假陽性測(cè)定的可能性。如此，需要通過利用編碼在各種艱難梭菌菌株中普遍表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因來檢測(cè)艱難梭菌。
[0009]另外，有毒艱難梭菌經(jīng)由它的孢子來誘導(dǎo)傳染性感染，帶有有毒菌株的患者需要隔離。因此，需要通過在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株來實(shí)施準(zhǔn)確且快速的診斷。
[0010]因此，仍然需要開發(fā)通過利用以較小變異在各種艱難梭菌菌株中普遍表達(dá)的基因來初步檢測(cè)艱難梭菌的方法、在短時(shí)間內(nèi)以高準(zhǔn)確度和靈敏度自檢測(cè)到的艱難梭菌菌株檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株的方法、及診斷它們的方法。
[0011]發(fā)明概述[0012]本發(fā)明提供了用于檢測(cè)艱難梭菌菌株的組合物，其包括檢測(cè)艱難梭菌菌株的引物套組。
[0013]本發(fā)明提供了用于檢測(cè)艱難梭菌菌株的試劑盒，其包括檢測(cè)艱難梭菌菌株的引物套組。
[0014]本發(fā)明提供了用于檢測(cè)艱難梭菌菌株的方法，其通過使用檢測(cè)艱難梭菌菌株的引物套組來進(jìn)行。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]根據(jù)下面實(shí)施方案的描述，結(jié)合附圖，這些和/或其它方面會(huì)變得明白和更加容易領(lǐng)會(huì)，在附圖中:
[0016]圖1圖示曲線圖和圖像，顯示依照例示性實(shí)施方案，通過使用具有序列SEQ ID NO:I至3、檢測(cè)gluD基因的引物(見(a)和(c))及通過使用具有序列SEQID NO:4至6、檢測(cè)gluD基因的引物(見(b)和(d))來檢測(cè)艱難梭菌菌株的結(jié)果；在圖1(c)中，最左欄為分子量標(biāo)志，對(duì)應(yīng)于IO3列的數(shù)值23.25表不該泳帶的強(qiáng)度與相應(yīng)標(biāo)志帶的強(qiáng)度相比的相對(duì)量化值；圖1(d)中的數(shù)值的含義同圖1(c)；
[0017]圖2和3是曲線圖和圖像,顯不依照例不性實(shí)施方案,通過使用具有序列SEQ IDNO:7至9、檢測(cè)靶tcdA基因的引物(見各自(a))和通過使用具有序列SEQ ID N0:10和
11、檢測(cè)參照tcdA基因的引物(見各自(b))和具有序列SEQID NO:12或13的探針來檢測(cè)艱難梭菌菌株的結(jié)果；圖3中的數(shù)值的含義同圖1(c)；
[0018]圖4和5是曲線圖和圖像，顯示依照例示性實(shí)施方案，通過使用具有序列SEQ IDNO:14至16、檢測(cè)靶tcdB基因的引物(見各自(a))和通過使用檢測(cè)參照tcdB基因、具有序列SEQ ID NO: 17或18的正向引物和具有序列SEQ ID NO: 19或20的反向引物(見各自(b))，和具有序列SEQ ID NO:21的探針來檢測(cè)艱難梭菌菌株的結(jié)果；圖5中的數(shù)值的含義同圖1(c)；
[0019]圖6和7是曲線圖和圖像,顯不依照例不性實(shí)施方案,通過使用具有序列SEQ IDNO:22至24、檢測(cè)靶cdtA基因的引物(見各自(a))和通過使用具有序列SEQ ID N0:25至
27、檢測(cè)靶cdtB基因的引物(見各自(b))來檢測(cè)艱難梭菌菌株的結(jié)果；圖7中的數(shù)值的含義同圖1(c);而
[0020]圖8和9是曲線圖和圖像，顯示通過使用不含八1175冊(cè)的野生型化(1(:基因(見各自(a))和通過使用用于含有Λ 117SNP的突變型tcdC基因、具有序列SEQ ID NO:28至30的引物(見各自(b))來檢測(cè)艱難梭菌菌株的結(jié)果，由此確認(rèn)了能特異性檢測(cè)含有△ 117SNP的tcdC基因；圖9中的數(shù)值的含義同圖1(c)。
[0021]發(fā)明詳述
[0022]現(xiàn)在會(huì)詳細(xì)提及各實(shí)施方案，附圖中圖示了其實(shí)施例，其中全文中同樣的基準(zhǔn)值(reference numeral)指同樣的要件(element)。在這點(diǎn)上,本發(fā)明實(shí)施方案可以具有不同形式，而且不應(yīng)解釋為限于本文所列描述。因而，下文通過提及附圖來描述各實(shí)施方案僅僅是為了解釋本說明書的各方面。如本文中使用的，術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)列舉項(xiàng)的任何和所有組合。
[0023]依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，用于檢測(cè)艱難梭菌菌株的組合物包括至少一種引物套組，其選自:包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和選自核苷酸序列SEQ ID N0:4的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。該組合物可以進(jìn)一步包括一種探針，該探針包括核苷酸序列SEQ ID NO:3或6。例如,具有序列SEQ ID NO:1至6的靶核酸可以是gluD(谷氨酸脫氫酶；OTH)基因。由gluD基因編碼的gluD蛋白(它是一種在艱難梭菌中表達(dá)的代謝酶)在無毒艱難梭菌菌株和有毒艱難梭菌菌株二者中表達(dá)。如此，可以通過檢測(cè)gluD基因以高靈敏度檢測(cè)各種艱難梭菌菌株，不管艱難梭菌是有毒的還是無毒的。另外，通過檢測(cè)gluD基因，很有可能降低因致病基因的基因變異所致的錯(cuò)誤發(fā)生的可能性或假陽性測(cè)定的可能性。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至150bp的范圍，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)艱難梭菌。
[0024]該組合物可以進(jìn)一步包括一種引物套組，其包括選自核苷酸序列SEQ ID N0:14的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。另外，該組合物可以進(jìn)一步包括一種探針，其包括核苷酸序列SEQ ID N0:16。例如，具有序列SEQID NO: 14至16的靶核酸可以是艱難梭菌毒素B (tcdB)基因。由tcdB基因編碼的tcdB蛋白誘導(dǎo)艱難梭菌的毒力。雖然tcdB基因在各種艱難梭菌菌株間具有較少的保守區(qū)，但是可以通過使用設(shè)計(jì)成對(duì)tcdB基因具有改良靈敏度的引物套組以高靈敏度檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。此外,通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。
[0025]該組合物可以進(jìn)一步包括一種引物套組，其包括選自核苷酸序列SEQ ID N0:28的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。另外，該組合物可以進(jìn)一步包括一種探針，其包括核苷酸序列SEQ ID NO:30。例如，具有序列SEQ IDNO:28至30的靶核酸可以是具有Λ 117單核苷酸獨(dú)特型(SNP)的tcdC基因。tcdC基因第117位處的SNP是一種在高毒艱難梭菌菌株中確認(rèn)的有毒基因。為了檢測(cè)含有A117SNP的tcdC基因，可以使用能夠在不使用別的引物或探針的情況中進(jìn)行檢測(cè)的等位基因特異性引物套組，由此可以以高靈敏度檢`測(cè)`高`毒艱難梭菌菌株。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)高毒艱難梭菌菌株。
[0026]該組合物可以進(jìn)一步包括至少一種引物套組，其選自:包括選自核苷酸序列SEQID NO:7的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:25的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。另外，該組合物可以進(jìn)一步包括一種探針，其包括至少一種選自下組的核苷酸序列:序列SEQ ID N0:9，24，和27。例如，具有序列SEQ ID NO:7至9的靶核酸可以是艱難梭菌毒素A(tcdA)基因。由tcdA基因編碼的tcdA蛋白誘導(dǎo)艱難梭菌的毒力。可以使用設(shè)計(jì)成對(duì)tcdA基因具有改良靈敏度的引物套組以高靈敏度檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。例如，具有序列SEQ ID N0:22至24的靶核酸可以是編碼一種二元毒素的cdtA基因?？梢允褂锚?dú)特設(shè)計(jì)用于cdtA基因的引物套組以高靈敏度檢測(cè)具有二元毒力的艱難梭菌。例如，具有序列SEQ ID NO:25至27的靶核酸可以是cdtB基因?？梢允褂锚?dú)特設(shè)計(jì)用于cdtB基因的引物套組以高靈敏度檢測(cè)具有二元毒力的艱難梭菌。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。
[0027]另外，探針可以用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)對(duì)來標(biāo)記。還有，例如，探針可以用至少一種選自下組的熒光標(biāo)記物在其5 '端標(biāo)記:FAM?，VIC?, TET，JOE?, HEX(六氯熒光素)，CY(花菁)3，CY(花菁)5，ROX?, RED610?, TEXAS RED(磺基羅丹明101磺酰氯)，RED670?，和NED?，或者探針可以用至少一種選自下組的猝滅劑在其3'端標(biāo)記:6-TAMRA(6-羧基-四甲基羅丹明)，BHQ (Black Hole Quencher)-1，2，3，和結(jié)合分子溝的非突光粹滅劑(Minor Groove Binder nonf luorescent quencher, MGBNFQ)。
[0028]在檢測(cè)艱難梭菌菌株時(shí)，引物套組可以利用其獨(dú)特設(shè)計(jì)的序列來遏制自身二聚化，引物套組的交叉反應(yīng)性可以不發(fā)生，使得檢測(cè)效率和靈敏度得到改善，而且引物套組可以在多種基因的至少一種組合中檢測(cè)艱難梭菌菌株以改善特異性。另外，為每一種基因生成的擴(kuò)增子的尺寸等于或少于100bp，并因此，可以在短時(shí)間內(nèi)特異性擴(kuò)增靶基因?？梢栽谥辽僖粋€(gè)空間中同時(shí)實(shí)時(shí)檢測(cè)多種基因的至少一種組合，由此可以使檢測(cè)時(shí)間最小化。
[0029]如本文中使用的，術(shù)語“核苷酸序列”指雙鏈DNA或cDNA，或者單鏈DNA或RNA。除非本文中另有說明，核苷酸序列可以意圖包括核苷酸類似物。核苷酸序列可以使用本領(lǐng)域已知的適宜方法(例如化學(xué)合成)來合成和生成。另外，可以使用商品化核苷酸序列。
[0030]在一些實(shí)施方案中，如本文中使用的，術(shù)語“核苷酸序列”可以意圖指示術(shù)語“核酸序列”、“引物”、“寡核苷酸”、或“多核苷酸”。
[0031]核苷酸可以使用本領(lǐng)域已知的適宜方法(例如化學(xué)合成)來合成和生成。還有，可以使用商品化核苷酸。
[0032]如本文中使用的，術(shù)語 “引物”指能夠在適宜條件下(例如在有聚合酶和四種不同核苷三磷酸時(shí))在合適的緩沖液中、且在合適的溫度中作為模板依賴性DNA合成的起點(diǎn)起作用的單鏈寡核苷酸。
[0033]引物的適宜長(zhǎng)度可以依溫度和引物的用途而改變，但是通常為15至35個(gè)核苷酸。相對(duì)較短的引物可能通常需要相對(duì)較低的溫度來與模板形成充分穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。如本文中使用的，術(shù)語“正向引物”和“反向引物”指分別連接至模板中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的某個(gè)區(qū)域的3’端和5’端的引物。
[0034]引物可以與模板中的一個(gè)區(qū)域雜交或與其退火以形成雙鏈結(jié)構(gòu)。適合于核酸雜交以形成此類雙鏈結(jié)構(gòu)的條件是本領(lǐng)域公知的。
[0035]如本文中使用的，術(shù)語“探針”指天然或修飾的單體或連接體(包括脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸)的線性寡聚體，其能夠與靶多核苷酸序列雜交。例如，探針可以是單鏈以改善雜交效率。探針可以是與作為模板的多核苷酸序列完全互補(bǔ)的序列。然而，在一個(gè)實(shí)施方案中，探針可以是基本上互補(bǔ)的序列，只要它不干擾特異性雜交。
[0036]另外，探針可以用FRET對(duì)來標(biāo)記。還有，例如，探針可以用至少一種選自下組的熒光標(biāo)記物在其 5’ 端標(biāo)記:FAM, VIC, TET，JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED,RED670，和NED，或者探針可以用至少一種選自下組的猝滅劑在其3’端標(biāo)記:6_TAMRA，BHQ-1，2，3，和 MGBNFQo[0037]如本文中使用的，術(shù)語“基本上互補(bǔ)的序列”指能夠在本領(lǐng)域已知的嚴(yán)格條件下與作為模板的多核苷酸雜交的序列。嚴(yán)格條件可以通過調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度(緩沖劑濃度)、諸如有機(jī)溶劑等化合物的存在、等等來確定，而且可以依要雜交的序列而有不同。例如，嚴(yán)格條件可以是下述條件:a)于50° C并用0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉清洗山)在雜交緩沖液(包括50%甲酰胺，2xSSC和10%硫酸葡聚糖)中于55° C雜交，然后用含EDTA的0.1xSSC于55° C清洗。
[0038]如本文中使用的，術(shù)語“靶DNA”、“靶RNA”、“靶核酸”、或“靶核酸序列”指作為DNA擴(kuò)增靶的核酸。靶核酸序列可以在PCR或逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR中充當(dāng)擴(kuò)增的模板。靶核酸序列可以包括天然分子和合成分子。例如，靶核酸可以是基因組DNA或基因組RNA。[0039]組合物可以是用于擴(kuò)增靶核酸的組合物。擴(kuò)增方法可以是本領(lǐng)域已知的用于核酸擴(kuò)增的方法。擴(kuò)增可以是例如DNA擴(kuò)增或RNA擴(kuò)增。擴(kuò)增方法可以是需要熱循環(huán)的擴(kuò)增方法或等溫?cái)U(kuò)增方法。擴(kuò)增方法可以包括PCR、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、等等。還有，擴(kuò)增方法可以包括RNA擴(kuò)增方法。擴(kuò)增方法的例子包括PCR和RT-PCR。如本文中使用的，術(shù)語“擴(kuò)增”可以意圖表示增加靶核酸序列或與其互補(bǔ)的序列的拷貝數(shù)目的過程。如本文中使用的，術(shù)語“PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))”指用聚合酶從特異性結(jié)合靶核酸的引物對(duì)擴(kuò)增靶核酸的方法。
[0040]另外，組合物可以進(jìn)一步包括擴(kuò)增靶核酸所需的已知材料。例如，組合物可以進(jìn)一步包括核酸聚合酶、酶活性所需的緩沖液、輔因子、和/或底物。核酸聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、或其組合。如本文中使用的，術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄”指從RNA模板合成DNA鏈，其中DNA鏈與RNA的序列互補(bǔ)。核酸聚合酶可以具有鏈置換活性。例如，核酸聚合酶可以是至少一種從逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如HIV、MMLVjP AMV)衍生的逆轉(zhuǎn)錄酶。核酸聚合酶可以沒有3' ->5,外切核酸酶活性。組合物可以包括RT-PCR或PCR擴(kuò)增所需的材料。
[0041]依照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，用于檢測(cè)艱難梭菌菌株的試劑盒包括至少一種引物套組，其選自:包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。該試劑盒可以進(jìn)一步包括一種探針，其具有核苷酸序列SEQ ID N0:3或6。例如，具有序列SEQ ID N0:1至6的靶核酸可以是gluD基因。由gluD基因編碼的gluD蛋白存在于艱難梭菌的細(xì)胞表面上，而且可以通過檢測(cè)gluD基因以高靈敏度檢測(cè)各種艱難梭菌菌株。另外，通過檢測(cè)gluD基因，很有可能降低因致病基因的基因變異所致的錯(cuò)誤發(fā)生的可能性或假陽性測(cè)定的可能性。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)艱難梭菌。
[0042]該試劑盒可以進(jìn)一步包括一種引物套組，其包括選自核苷酸序列SEQ ID N0:14的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。還有，該試劑盒可以進(jìn)一步包括一種探針，其具有核苷酸序列SEQ ID NO: 16。例如，具有序列SEQ IDNO: 14至16的靶核酸可以是tcdB基因。由tcdB基因編碼的tcdB蛋白誘導(dǎo)艱難梭菌的毒力。雖然tcdB基因在各種艱難梭菌菌株間不太保守，但是可以通過使用設(shè)計(jì)成對(duì)tcdB基因具有改良靈敏度的引物套組以高靈敏度檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。
[0043]該試劑盒可以進(jìn)一步包括一種引物套組，其包括選自核苷酸序列SEQ ID N0:28的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。另外，該試劑盒可以進(jìn)一步包括一種探針，其具有核苷酸序列SEQ ID NO:30。例如，具有序列SEQ IDNO:28至30的靶核酸可以是具有Λ 117SNP的tcdC基因。tcdC基因第117位處的SNP是一種在高毒艱難梭菌菌株中確認(rèn)的有毒基因。為了檢測(cè)含有A117SNP的tcdC基因，可以使用能夠在不使用別的引物或探針的情況中進(jìn)行檢測(cè)的等位基因特異性引物套組，由此可以以高靈敏度檢測(cè)具有高毒力的艱難梭菌。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)高毒艱難梭菌菌株。
[0044]該試劑盒可以進(jìn)一步包括至少一種引物套組，其選自:包括選自核苷酸序列SEQID NO:7的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:25的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。另外，該試劑盒可以進(jìn)一步包括一種探針，其具有至少一種選自下組的核苷酸序列:序列SEQ ID NO:9，24，和27。例如，具有序列SEQ ID NO:7至9的靶核酸可以是tcdA基因。由tcdA基因編碼的tcdA蛋白誘導(dǎo)艱難梭菌的毒力?？梢允褂迷O(shè)計(jì)成對(duì)tcdA基因具有改良靈敏度的引物套組以高靈敏度檢測(cè)有毒艱難梭菌。例如，具有序列SEQ ID NO:22至24的靶核酸可以是編碼一種二元毒素的cdtA基因?？梢允褂锚?dú)特設(shè)計(jì)用于cdtA基因的引物套組以高靈敏度檢測(cè)具有二元毒力的艱難梭菌。例如，具有序列SEQ ID N0:25至27的靶核酸可以是編碼一種二元毒素的cdtB基因。可以使用獨(dú)特設(shè)計(jì)用于cdtB基因的引物套組以高靈敏度檢測(cè)具有二元毒力的艱難梭菌。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)有毒艱難梭菌。
[0045]試劑盒可以是用于`擴(kuò)增靶核酸的試劑盒。擴(kuò)增方法可以是本領(lǐng)域已知的用于核酸擴(kuò)增的方法。擴(kuò)增可以是例如DNA擴(kuò)增或RNA擴(kuò)增。擴(kuò)增方法可以是需要熱循環(huán)的擴(kuò)增方法或等溫?cái)U(kuò)增方法。擴(kuò)增方法可以包括PCR、NASBA、LCR、SDA、RCA、等等。還有，擴(kuò)增方法可以包括RNA擴(kuò)增方法。擴(kuò)增方法的例子包括PCR和RT-PCR。如本文中使用的，術(shù)語“擴(kuò)增”可以意圖表示增加靶核酸序列或與其互補(bǔ)的序列的拷貝數(shù)目的過程。如本文中使用的，術(shù)語“PCR”指用聚合酶從特異性結(jié)合靶核酸的引物對(duì)來擴(kuò)增靶核酸的方法。
[0046]另外，試劑盒可以進(jìn)一步包括擴(kuò)增靶核酸所需的已知材料。例如，試劑盒可以進(jìn)一步包括核酸聚合酶、酶活性所需的緩沖液、輔因子、和/或底物。核酸聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、或其組合。如本文中使用的，術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄(RT)”指從RNA模板合成DNA鏈，其中DNA鏈與RNA的序列互補(bǔ)。核酸聚合酶可以具有鏈置換活性。例如，核酸聚合酶可以是至少一種從逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如HIV、MMLVjPAMV)衍生的逆轉(zhuǎn)錄酶。核酸聚合酶可以沒有3' ->5,外切核酸酶活性。試劑盒可以包括RT-PCR或PCR擴(kuò)增所需的材料。另外，試劑盒可以進(jìn)一步包括用于擴(kuò)增靶核酸的用法手冊(cè)。
[0047]依照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，實(shí)時(shí)檢測(cè)樣品中的艱難梭菌菌株的方法包括:使自樣品獲得的核酸序列與至少一種引物套組雜交，該引物套組選自:包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；擴(kuò)增靶核酸序列；并檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸序列。
[0048]另外，該方法可以進(jìn)一步包括使擴(kuò)增的靶核酸序列與一種探針雜交，該探針包括核苷酸序列SEQ ID NO:3或6。例如，具有序列SEQ ID NO:1至6的靶核酸可以是gluD基因。gluD基因編碼存在于艱難梭菌的細(xì)胞表面上的gluD蛋白，并因此，可以通過檢測(cè)gluD基因以高靈敏度檢測(cè)各種艱難梭菌菌株。另外，通過檢測(cè)gluD基因，很有可能降低因致病基因的基因變異所致的錯(cuò)誤發(fā)生的可能性或假陽性測(cè)定的可能性。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)艱難梭菌菌株。
[0049]該方法可以進(jìn)一步包括使自樣品獲得的核酸序列與一種引物套組雜交，該引物套組包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:14的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ IDNO:15的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。另外，該方法可以進(jìn)一步包括使擴(kuò)增的靶核酸序列與一種探針雜交，該探針包括核苷酸序列SEQ ID NO:160例如，具有序列SEQ ID N0:14至16的靶核酸可以是tcdB基因。由tcdB基因編碼的tcdB蛋白誘導(dǎo)艱難梭菌的毒力。雖然tcdB基因在各種艱難梭菌菌株間不太保守，但是可以通過使用設(shè)計(jì)成對(duì)tcdB基因具有改良靈敏度的引物套組以高靈敏度檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。
[0050]該方法可以進(jìn)一步包括使自樣品獲得的核酸序列與一種引物套組雜交，該引物套組包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:28的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ IDNO:29的至少10個(gè)連續(xù)核苷 酸。另外，該方法可以進(jìn)一步包括使擴(kuò)增的靶核酸序列與一種探針雜交，該探針包括核苷酸序列SEQ ID N0:30。例如，具有序列SEQ ID NO:28至30的靶核酸可以是具有Λ 117SNP的tcdC基因。tcdC基因第117位處的SNP是一種在高毒艱難梭菌菌株中確認(rèn)的有毒基因。為了檢測(cè)含有AlHSNP的tcdC基因，可以使用能夠在不使用別的引物或探針的情況中進(jìn)行檢測(cè)的等位基因特異性引物套組，由此可以以高靈敏度檢測(cè)高毒艱難梭菌。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)高毒艱難梭菌菌株。
[0051]該方法可以進(jìn)一步包括使自樣品獲得的核酸樣品與至少一種引物套組雜交，該引物套組選自:包括選自核苷酸序列SEQ ID N0:7的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包括選自核苷酸序列SEQ ID NO:25的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQID NO:26的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。另外，該方法可以進(jìn)一步包括使擴(kuò)增的核酸序列與一種探針雜交，該探針包括至少一種選自下組的核苷酸序列:序列SEQ ID N0:9,24，和27。例如，具有序列SEQ ID NO:7至9的靶核酸可以是tcdA基因。由tcdA基因編碼的tcdA蛋白誘導(dǎo)艱難梭菌的毒力?？梢允褂迷O(shè)計(jì)成對(duì)tcdA基因具有改良靈敏度的引物套組以高靈敏度檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。例如，具有序列SEQ ID NO:22至24的靶核酸可以是編碼一種二元毒素的cdtA基因。可以使用獨(dú)特設(shè)計(jì)用于cdtA基因的引物套組以高靈敏度檢測(cè)具有二元毒力的艱難梭菌。例如，具有序列SEQ ID NO:25至27的靶核酸可以是cdtB基因?？梢允褂锚?dú)特設(shè)計(jì)用于cdtB基因的引物套組以高靈敏度檢測(cè)具有二元毒力的艱難梭菌。此外，通過所述引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸在40bp至IOObp的范圍中，這可以使得能夠在短時(shí)間內(nèi)特異性檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。
[0052]探針可以用可檢測(cè)的標(biāo)記物來標(biāo)記，例如FRET對(duì)。另外，例如，探針可以用至少一種選自下組的熒光標(biāo)記物在其Y端標(biāo)記:FAM，VIC, TET, JOE, HEX, CY3，CY5，ROX, RED610，TEXAS RED，RED670，和NED，或者用至少一種選自下組的猝滅劑在其:V端標(biāo)記:6_TAMRA，BHQ-1，2，3，和 MGBNFQ。
[0053]自樣品獲得的核酸序列可以是從排泄物(excrement)樣品提取的基因組DNA或提取并經(jīng)純化的基因組DNA、用棉拭子收集的樣品、體液、或組織切片。
[0054]在雜交方法中，本文中使用的術(shù)語“雜交”也可以稱作術(shù)語“退火”。雜交指一條核酸和另一條核酸經(jīng)由它們之間的堿基配對(duì)相互作用形成雙鏈體、三鏈體、或多體結(jié)構(gòu)的過程。堿基配對(duì)相互作用可以是通過Watson/Crick發(fā)生的堿基特異性堿基配對(duì)和Hoogsteen型氫鍵形成。另外，堿基堆積和疏水相互作用可以有助于雙鏈體的穩(wěn)定性。
[0055]該方法包括擴(kuò)增靶核酸的序列。
[0056]靶核酸序列指作為DNA擴(kuò)增靶的核酸。靶核酸序列可以在PCR或RT-PCR中充當(dāng)擴(kuò)增的模板。靶核酸序列可以包括天然分子和合成的分子。靶核酸可以是例如基因組DNA或基因組RNA。
[0057]擴(kuò)增的靶核酸序列的尺寸可以在40bp至IOObp的范圍中，并因此，使擴(kuò)增和檢測(cè)花費(fèi)的時(shí)間最小化，由此可以快速檢測(cè)艱難梭菌菌株。
[0058]擴(kuò)增過程可以使用用于擴(kuò)增核酸的已知方法來實(shí)施。擴(kuò)增可以是例如DNA擴(kuò)增或RNA擴(kuò)增。擴(kuò)增方法可以是需要熱 循環(huán)的擴(kuò)增方法或等溫?cái)U(kuò)增方法。擴(kuò)增方法可以包括PCR、NASBA、LCR、SDA、RCA、等等。還有，擴(kuò)增方法可以包括RNA擴(kuò)增方法。擴(kuò)增方法的例子包括PCR和RT-PCR。如本文中使用的，術(shù)語“擴(kuò)增”可以意圖表示增加靶核酸序列或與其互補(bǔ)的序列的拷貝數(shù)目的過程。如本文中使用的，術(shù)語“PCR”指用聚合酶從特異性結(jié)合靶核酸的引物對(duì)來擴(kuò)增靶核酸的方法。PCR是本領(lǐng)域公知的。例如，PCR可以通過使用下述過程來實(shí)施:1)處理樣品以獲得提取物從而分離靶DNA分子；2)對(duì)其添加含有酶、緩沖劑、dNTP、和寡核苷酸引物的水溶液；3)使反應(yīng)混合物在兩至三種溫度之間熱循環(huán)，例如90° C至96。C、37。C至65。C、和72。C ;并4)檢測(cè)擴(kuò)增的DNA。PCR可以在聚丙烯管、96孔板、或基于硅的PCR微芯片中實(shí)施。另外，擴(kuò)增可以是多重PCR。本文中使用的術(shù)語“多重PCR”指在同一室中同時(shí)對(duì)多種引物套組進(jìn)行PCR的反應(yīng)。
[0059]該方法包括檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸序列。
[0060]檢測(cè)過程指通過使用檢測(cè)儀檢測(cè)由可檢測(cè)的標(biāo)記物生成的信號(hào)的過程。例如，由可檢測(cè)的標(biāo)記物生成的信號(hào)可以選自下組:磁信號(hào)，電信號(hào)，發(fā)光信號(hào)(諸如熒光信號(hào)和拉曼(Raman)信號(hào))，散射光信號(hào)，和放射性信號(hào)。在檢測(cè)過程中，可以檢測(cè)自標(biāo)記靶序列的可檢測(cè)的標(biāo)記物生成的信號(hào)。例如，在檢測(cè)過程中，可以通過檢測(cè)FRET生成的信號(hào)來檢測(cè)是否存在靶核酸。
[0061]在檢測(cè)過程中，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)實(shí)時(shí)擴(kuò)增的核酸序列。因此，可以在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)靶核酸序列。[0062]現(xiàn)在會(huì)提及下述實(shí)施例來更加完整地描述本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案。然而，提供這些實(shí)施例只是出于例示目的，并非意圖限制本發(fā)明的方面。
[0063]實(shí)施例1
[0064]選擇用于檢測(cè)艱難梭菌的引物和探針及PCR評(píng)估
[0065]在將致病基因用于分子診斷時(shí)，存在基因變異所致錯(cuò)誤發(fā)生的可能性和假陽性測(cè)定的可能性。如此，需要在分子診斷中利用具有較小變異且在各種艱難梭菌菌株中普遍表達(dá)的基因。
[0066]gluD(谷氨酸脫氫酶)是一種在各種艱難梭菌菌株中普遍表達(dá)且具有較小變異的蛋白質(zhì)，并因此，可以通過gluD檢測(cè)各種艱難梭菌菌株，不管艱難梭菌是無毒的還是有毒的。
[0067]因此，經(jīng)由NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)兩種通過特異性擴(kuò)增編碼gluD蛋白的gluD基因用于檢測(cè)艱難梭菌菌株的引物套組和一種用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的探針，并分析和驗(yàn)證其交互作用。
[0068]引物套組和探針如下:
[0069]正向引物:5，-GCTGCATTAGAAAACTCTATAAC-3，(SEQID NO:1),
[0070]反向引物:5’-CAGCCTCTGGAGTAGTTG-3’ (SEQ ID NO:2)，和
[0071]探針:5’-CCATTAGCAGCTCACAA-3’(標(biāo)有下劃線的核酸表示LNA) (SEQ ID NO:3)。
[0072]或者，引物套組和探針如下:`[0073]正向引物:5'-GCTGAATCTATAAAAGCTAAATTAG-3' (SEQ ID NO:4)，
[0074]反向引物:5'-CCTCTTTCAGCAAATACTTC-3' (SEQ ID NO:5)，和
[0075]探針:5'-TAGTTGGTCCATTAGCAGCCTCACA-3' (SEQ ID NO:6)。
[0076]艱難梭菌的實(shí)時(shí)PCR分析結(jié)果顯示于圖1。
[0077]通過具有序列SEQ ID NO:1和2的引物套組PCR擴(kuò)增的gluD基因的尺寸為97bp，而通過具有序列SEQ ID N0:4和5的引物套組PCR擴(kuò)增的gluD基因的尺寸為85bp。使用所述引物套組檢測(cè)到至少I個(gè)拷貝的gluD基因。因此，可以在短時(shí)間內(nèi)以高靈敏度檢測(cè)艱難梭菌菌株。
[0078]實(shí)施例2
[0079]用于檢測(cè)艱難梭菌菌株毒素A的引物和探針的選擇及PCR評(píng)估
[0080]可以通過能誘導(dǎo)艱難梭菌毒力的毒素A檢測(cè)有毒艱難梭菌菌株。
[0081]經(jīng)由NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)一種用于特異性擴(kuò)增tcdA(它是艱難梭菌毒素A的基因)的引物套組和一種用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的探針，并分析和驗(yàn)證其交互作用。為實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物套組和探針具有改良靈敏度。
[0082]引物套組和探針如下:
[0083]正向引物:5'-GCGGAGTATATTTAGATGTTG-3' (SEQ ID NO:7)，
[0084]反向引物:5'-ACGGTCTAGTCCAATAGA-3' (SEQ ID NO:8)，和
[0085]探針:5'-ATGCTTCCAGGTATTCACT-3' (SEQ ID NO:9)。
[0086]使用下述引物套組擴(kuò)增參照tcdA(見 J Microbiol Methods83:59-65(2010)):
[0087]正向引物:5'-TTGTATGGATAGGTGGAGAAGTCAGT-3' (SEQ ID NO: 10)，反向引物:5' -AATATTATATTCTGCATTAATATCAGCCCAT-3' (SEQ ID NO: 11)，
[0088]探針1:5' -FAM-ATATTGCTCTTGAATACATAAA-NFQ-MGB-3' (SEQ ID NO: 12)，和[0089]探針 2:5' -FAM-TATTGTTCTTGAATACATAAAAC-NFQ-MGB-3' (SEQ ID NO: 13)。
[0090]艱難梭菌的實(shí)時(shí)PCR分析結(jié)果顯示于圖2和3。
[0091]通過具有序列SEQ ID NO:7和8的引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸為92 bp。另外，與參照tcdA相比，使用具有序列SEQ ID NO:7和8的引物套組檢測(cè)到至少一個(gè)拷貝的tcdA基因。因此，通過tcdA可以在短時(shí)間內(nèi)以聞靈敏度檢測(cè)具有毒力的艱難梭囷囷株。
[0092]實(shí)施例3
[0093]用于檢測(cè)艱難梭菌毒素B的引物和探針的選擇及PCR評(píng)估
[0094]可以通過能誘導(dǎo)艱難梭菌毒力的毒素B檢測(cè)有毒艱難梭菌。
[0095]毒素B基因tcdB在各種艱難梭菌菌株不太保守。經(jīng)由NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)一種用于特異性擴(kuò)增該tcdB的引物套組和一種用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的探針，并分析和驗(yàn)證其交互作用。
[0096]為實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物套組和探針具有改良靈敏度。
[0097]引物套組和探針如下:
[0098]正向引物:5，-GGTGGTATGTATTTAGATGTTGA-3，(SEQID NO:14)，
[0099]反向引物:5，-TCCACTGTTACTGAACTAGG-3，(SEQID NO:15)，和
[0100]探針:5，-CCAGGAATACAACCAGACT-3，(SEQID NO:16)。
[0101]使用下述引物套組擴(kuò)增參照tcdB (見 J Microbiol Methods83:59-65(2010)):
[0102]正向引物:5，-GAAACAGGATGGACACCAGGTT-3，(SEQID NO:17)或5’-AAGAGGATGGACGCCAGGTT-3’ (SEQ ID NO: 18)，
[0103]反向引物:5’-ACGGTCTAACAGTTTTGTGCCA-3’ (SEQ ID NO:19)或 5’ -CTGCCCTTCATAATGATCTCTTATACG-3’ (SEQ ID NO:20)，和
[0104]探針:5，-FAM-AAGAAGCTTAGAAAATG-NFQ-MGB-3，(SEQID NO:21)。
[0105]艱難梭菌的實(shí)時(shí)PCR分析結(jié)果顯不于圖4和5。
[0106]通過具有序列SEQ ID NO:14和15的引物套組擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的尺寸為89bp。
[0107]與參照tcdB相比，使用具有序列SEQ ID NO:14和15的引物套組檢測(cè)到至少一個(gè)拷貝的tcdB基因。因此，通過tcdB可以在短時(shí)間內(nèi)以高靈敏度檢測(cè)具有毒力的艱難梭菌菌株。
[0108]實(shí)施例4
[0109]用于檢測(cè)艱難梭菌二元毒素的引物和探針的選擇及PCR評(píng)估
[0110]可以通過能誘導(dǎo)艱難梭菌毒力的二元毒素檢測(cè)有毒艱難梭菌。
[0111]經(jīng)由NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)一種用于特異性擴(kuò)增tcdA和tcdB (它們都是二元毒素基因)的引物套組，和一種用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的探針，并分析和驗(yàn)證其交互作用。為實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)設(shè)計(jì)的引物套組和探針具有對(duì)于每一種基因的獨(dú)特設(shè)計(jì)。
[0112]通過PCR擴(kuò)增的cdtA和cdtB擴(kuò)增子的尺寸分別為99bp和72bp。
[0113]用于cdtA基因的引物套組和探針如下:
[0114]正向引物:5'-GCATCTGTTGTAAGTAGTCTTG-3' (SEQ ID NO:22)，
[0115]反向引物:5'-AGGTGTTAATTTATTACTCCAATCATTA-3' (SEQ ID NO:23)，和
[0116]探針:5'-AATTTGCTTTACCCCAAGAGTCCCC-3' (SEQ ID NO:24)。
[0117]用于cdtB基因的引物套組和探針如下:
[0118]正向引物:5'-ACTCCCAAACAATGGATTA-3' (SEQ ID NO:25)，[0119]反向引物:5'-GGTGCCATTAATTTTAAATCTTTA-3' (SEQ ID NO:26)，和
[0120]探針:5'-AGTGCTCATCTGTGAAATAATATCCCA-3' (SEQ ID NO:27)。
[0121]艱難梭菌的實(shí)時(shí)PCR分析結(jié)果顯示于圖6和7。
[0122]通過PCR擴(kuò)增的cdtA和cdtB產(chǎn)物的尺寸分別為99bp和72bp。通過各自的引物套組檢測(cè)到至少一個(gè)拷貝的cdtA或cdtB基因。因此，通過所述二元毒素可以以高靈敏度檢測(cè)具有毒力的艱難梭菌菌株。
[0123]實(shí)施例5
[0124]用于檢測(cè)高毒艱難梭菌的引物和探針的選擇及PCR評(píng)估
[0125]艱難梭菌的具有Δ 117SNP (單核苷酸多態(tài)性)的tcdC基因存在于對(duì)氟喹諾酮抗生素,諸如環(huán)丙沙星和左氧氟沙星有抗性的高毒菌株中。如此,可以通過具有A117SNP的tcdC基因檢測(cè)高毒艱難梭菌。
[0126]為了檢測(cè)誘導(dǎo)高毒力的艱難梭菌，經(jīng)由NCBI網(wǎng)站設(shè)計(jì)一種用于特異性擴(kuò)增含有Δ 117SNP的tcdC基因的引物套組和一種用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的探針，并分析和驗(yàn)證其交互作用。
[0127]用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的引物套組和探針是等位基因特異性設(shè)計(jì)的，使得可以在不使用別的引物和探針的情況中使用具有等位基因特異性序列的引物套組檢測(cè)高毒艱難梭菌。
[0128]引物套組和探針如下:
[0129]正向引物:5'-GCACAAAGGATATTGCTCTA-3' (SEQ ID NO:28)，
[0130]反向引物:5'-CCTCATGGTCTTCAGAAC-3' (SEQ ID NO:29)，和
[0131]探針:5'-TGGCATTTATTTTGGTGTGTTTTTTG-3' (SEQ ID NO:30)。
[0132]高毒艱難梭菌的實(shí)時(shí)PCR分析結(jié)果顯示于圖8和9。
[0133]通過PCR擴(kuò)增的含有Λ 117SNP的tcdC擴(kuò)增子的尺寸為86bp。與不含Λ 117SNP的野生型tcdC相比，使用具有序列SEQ ID NO:28和29的引物套組可以特異性檢測(cè)到至少一個(gè)拷貝的含有八1175冊(cè)的化(1(:。因此，可以在短時(shí)間內(nèi)以高靈敏度檢測(cè)高毒艱難梭菌菌株。
[0134]實(shí)施例6
[0135]用于檢測(cè)艱難梭菌的多重PCR實(shí)施
[0136]通過用至少一種引物套組檢測(cè)至少一種靶核酸序列，按照下表1所示的組合來實(shí)施多重PCR。
[0137]〈表1>
[0138]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)艱難梭菌(Clostridium difficile)菌株的組合物,該組合物包含至少一種引物套組，其選自:包含選自核苷酸序列SEQ ID N0:1的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。
2.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包含一種引物套組，其包含選自核苷酸序列SEQIDNO:14的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
3.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包含一種引物套組，其包含選自核苷酸序列SEQIDNO:28的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
4.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包含至少一種引物套組，其選自:包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:7的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包括選自核苷酸序列SEQ IDNO:25的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。
5.權(quán)利要求1的組合物，進(jìn)一步包含一種探針，其包含核苷酸序列SEQID NO:3或6。
6.權(quán)利要求2的組合物，進(jìn)一步包含一種探針，其包含核苷酸序列SEQID NO:160
7.權(quán)利要求3的組合物，進(jìn)一步包含一種探針，其包含核苷酸序列SEQID NO:30o
8.權(quán)利要求4的組合物，進(jìn)一步包含一種探針，其包含至少一種選自下組的核苷酸序列:序歹Ij SEQ ID NO:9，24，和 27。`
9.一種用于檢測(cè)艱難梭菌菌株的試劑盒，該試劑盒包含至少一種引物套組，其選自:包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。
10.權(quán)利要求9的試劑盒，進(jìn)一步包含一種引物套組，其包含選自核苷酸序列SEQIDNO:14的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
11.權(quán)利要求9的試劑盒，進(jìn)一步包含一種引物套組，其包含選自核苷酸序列SEQIDNO:28的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
12.權(quán)利要求9的試劑盒，進(jìn)一步包含至少一種引物套組，其選自:包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:7的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:22的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包括選自核苷酸序列SEQID NO:25的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。
13.權(quán)利要求9的試劑盒，進(jìn)一步包含一種探針，其包含核苷酸序列SEQID N0:3或6。
14.權(quán)利要求10的試劑盒，進(jìn)一步包含一種探針，其包含核苷酸序列SEQID NO:160
15.權(quán)利要求11的試劑盒，進(jìn)一步包含一種探針，其包含核苷酸序列SEQID NO:30o
16.權(quán)利要求12的試劑盒，進(jìn)一步包含一種探針，其包含至少一種選自下組的核苷酸序列:序列 SEQ ID NO:9，24，和 27。
17.一種檢測(cè)樣品中的艱難梭菌菌株的方法，該方法包括: 使自樣品獲得的核酸序列與至少一種引物套組雜交，該引物套組選自:包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:1的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:2的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:4的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:5的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組； 擴(kuò)增靶核酸序列；并 檢測(cè)擴(kuò)增的靶核酸序列。
18.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括使自樣品獲得的核酸序列與一種引物套組雜交，該引物套組包含選自核苷酸序列SEQ ID NO: 14的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:15的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
19.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括使自樣品獲得的核酸序列與一種引物套組雜交，該引物套組包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:28的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:29的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸。
20.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括使自樣品獲得的核酸序列與至少一種引物套組雜交，該引物套組選自:包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:7的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:8的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；包含選自核苷酸序列SEQ IDNO:22的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:23的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組；和包含選自核苷酸序列SEQ ID NO:25的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸和選自核苷酸序列SEQ ID NO:26的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的引物套組。
21.權(quán)利要求17的方法，進(jìn)一步包括使擴(kuò)增的靶核酸序列與一種探針雜交，該探針包含核苷酸序列SEQ ID NO:3或6。
22.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一`步包括使擴(kuò)增的靶核酸序列與一種探針雜交，該探針包含核苷酸序列SEQ ID NO:16o
23.權(quán)利要求19的方法，進(jìn)一步包括使擴(kuò)增的靶核酸序列與一種探針雜交，該探針包含核苷酸序列SEQ ID NO:30ο
24.權(quán)利要求20的方法，進(jìn)一步包括使擴(kuò)增的靶核酸序列與一種探針雜交，該探針包含至少一種選自下組的核苷酸序列:序列SEQ ID NO:9，24，和27。
25.權(quán)利要求17的方法，其中所述樣品包括糞便樣品、用棉拭子收集的樣品、體液、或組織切片。
26.權(quán)利要求17的方法，其中通過多重PCR來實(shí)施擴(kuò)增。
27.權(quán)利要求17的方法，其中通過該引物套組擴(kuò)增的靶核酸序列的尺寸為40bp至IOObp的范圍。
28.權(quán)利要求17的方法，其中實(shí)時(shí)實(shí)施檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103484532SQ201310108285
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月8日
【發(fā)明者】鄭善玉, 金俊鎬, 李樹官, 黃奎淵, 嚴(yán)泰喜 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社