1.一種高通量測(cè)定化合物體外代謝穩(wěn)定性的方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)設(shè)計(jì)96孔板:準(zhǔn)備兩個(gè)96孔板,一個(gè)為體系配置板;一個(gè)為體系孵育板;體系配置板上設(shè)定有微粒體孔、回收率孔,體系孵育板上設(shè)定有空白對(duì)照孔、回收率孔、反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔;
(2)稀釋微粒體:向體系配置板的微粒體孔中加入肝微粒體28.8μl/孔,使用PBS稀釋肝微粒體至蛋白濃度為0.58mg/ml,將體系配置板移至振蕩器上,低速振蕩30s,得到稀釋的微粒體;
(3)轉(zhuǎn)移空白對(duì)照孔:從步驟(2)的稀釋的微粒體中取出130μl,轉(zhuǎn)移至體系孵化板的空白對(duì)照孔中作為空白對(duì)照組,并加入20μl的PBS;
(4)微粒體與化合物混合:向體系配置板的的微粒體孔中加入10μl化合物,并低速振蕩1min,得到混合微粒體;
(5)轉(zhuǎn)移各反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)孔:從步驟(4)的混合微粒體中依次取出130μl,轉(zhuǎn)移至體系孵化板中的反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔;
(6)轉(zhuǎn)移回收率孔:從步驟(4)的混合微粒體中取出130μl,轉(zhuǎn)移至體系配置板的回收率孔中;并加入20μl PBS和300μl含有內(nèi)標(biāo)的終止試劑終止反應(yīng),完成之后將體系配置板熱封;
(7)孵育體系孵化板:把體系孵化板放在37℃的恒溫孵育器上開(kāi)始溫孵,在不同的時(shí)間點(diǎn)依次向相對(duì)應(yīng)的反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔中加入20μl NADPH,在第35min向0min孔中加入20μl NADPH,即反應(yīng)時(shí)間為0min,然后立刻向所有孔中各加入300μl的含有內(nèi)標(biāo)的終止試劑終止反應(yīng);
(8)再次轉(zhuǎn)移回收率孔:將體系配置板中所有回收率孔中的混合物對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)移至體系孵化板的回收率孔中,將體系孵化板熱封;
(9)振蕩離心:將體系孵化板振蕩10min后,離心10min,然后取上清70μl至一個(gè)96孔淺孔板中,進(jìn)LC-MS/MS分析,檢測(cè)各孔中化合物原形的質(zhì)譜響應(yīng)As和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)Ai;
(10)計(jì)算清除率及回收率:利用化合物質(zhì)譜響應(yīng)As、內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)Ai,計(jì)算As/Ai值,計(jì)算剩余百分比,計(jì)算LN;剩余百分比(%)=不同時(shí)間點(diǎn)的(As/Ai)/0min的(As/Ai)×100;LN=ln(剩余百分比);
以時(shí)間為橫坐標(biāo),以LN為縱坐標(biāo),做散點(diǎn)圖,添加趨勢(shì)線,得到線性回歸方程,確定趨勢(shì)線的斜率,計(jì)算清除率和回收率,清除率(CL,μl/min/mg protein)=斜率的絕對(duì)值/微粒體蛋白濃度(單位mg/ml)×1000,回收率(recovery,%)=(反應(yīng)時(shí)間為0min的孔的 As/Ai)/(回收率孔的As/Ai)×100;其中微粒體蛋白濃度是指加入含有內(nèi)標(biāo)的終止試劑終止反應(yīng)之前的微粒體的蛋白濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:步驟(5)中的反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔分別設(shè)定為0min孔、5min孔、10min孔和30min孔;即相對(duì)應(yīng)的,步驟(7)中,在第5min向30min孔中加入NADPH,即反應(yīng)時(shí)間為5min;在第25min向10min孔中加入NADPH,即反應(yīng)時(shí)間為10min;在第30min向5min孔中加入NADPH,即反應(yīng)時(shí)間為5min;在第35min向0min孔中加入NADPH,即反應(yīng)時(shí)間為0min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:同時(shí)測(cè)定n個(gè)化合物,即對(duì)應(yīng)n個(gè)化合物,在體系配置板上設(shè)定有n個(gè)微粒體孔、n個(gè)回收率孔,在體系孵育板上設(shè)定有n個(gè)空白對(duì)照孔、n個(gè)回收率孔、以及n個(gè)化合物的反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔,1≤n≤16。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于:所述終止試劑為乙腈或甲醇。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述方法的應(yīng)用,其特征在于:用于初步判斷代謝類型是NADPH依賴型代謝或非NADPH依賴型代謝。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于:如果化合物的回收率在80%-120%的范圍內(nèi),則該化合物主要經(jīng)NADPH依賴型代謝;如果化合物的回收率低于80%,則化合物可能存在非NADPH依賴型代謝。