本發(fā)明屬于藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究領(lǐng)域，涉及一種測定方法及其應(yīng)用，具體涉及一種高通量測定化合物體外代謝穩(wěn)定性的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：高通量的測定化合物體外代謝穩(wěn)定性的方法，現(xiàn)有技術(shù)分兩種，一種是使用離心管操作，不能實(shí)現(xiàn)高通量，并且不能測定回收率；一種是96孔板操作，此法實(shí)現(xiàn)了高通量，但是不能測定回收率?，F(xiàn)有方法中都是將微粒體、化合物、NADPH混合后，按照時(shí)間點(diǎn)依次終止反應(yīng)：使用離心管時(shí)，每到一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從反應(yīng)體系中取出混合物加入乙腈終止，缺點(diǎn)是繁瑣，不能同時(shí)做很多化合物，并且如果混合不充分，取出的混合物可能不一致，影響測定結(jié)果，并且沒有設(shè)計(jì)不加NADPH的對照，不能計(jì)算回收率；已有的96孔板法，也是在每到一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用乙腈終止反應(yīng)后還要繼續(xù)孵育，因?yàn)槠渌走€在反應(yīng)，乙腈是易揮發(fā)的溶劑，等到后面的時(shí)間點(diǎn)終止好，前面孔中的乙腈已經(jīng)揮發(fā)很多，直接影響測定的準(zhǔn)確性，并且也沒有設(shè)計(jì)不加NADPH的對照，不能計(jì)算回收率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明是在96孔板操作的基礎(chǔ)上，將試驗(yàn)操作方案進(jìn)行改進(jìn)，并設(shè)計(jì)了回收率的測定，不但實(shí)現(xiàn)高通量篩選，還能檢測出化合物的代謝過程是否是NADPH依賴。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種高通量測定化合物體外代謝穩(wěn)定性的方法，其包括以下步驟：(1)設(shè)計(jì)96孔板：準(zhǔn)備兩個(gè)96孔板，一個(gè)為體系配置板；一個(gè)為體系孵育板；體系配置板上設(shè)定有微粒體孔、回收率孔，體系孵育板上設(shè)定有空白對照孔、回收率孔、反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔；(2)稀釋微粒體：向體系配置板的微粒體孔中加入肝微粒體28.8μl/孔，使用PBS稀釋肝微粒體至蛋白濃度為0.58mg/ml，將體系配置板移至振蕩器上，低速振蕩30s，得到稀釋的微粒體；(3)轉(zhuǎn)移空白對照孔：從步驟(2)的稀釋的微粒體中取出130μl，轉(zhuǎn)移至體系孵化板的空白對照孔中作為空白對照組，并加入20μl的PBS；(4)微粒體與化合物混合：向體系配置板的微粒體孔中加入10μl化合物，并低速振蕩1min，得到混合微粒體；(5)轉(zhuǎn)移各反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)孔：從步驟(4)的混合微粒體中依次取出130μl，轉(zhuǎn)移至體系孵化板中的反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔；(6)轉(zhuǎn)移回收率孔：從步驟(4)的混合微粒體中取出130μl，轉(zhuǎn)移至體系配置板的回收率孔中；并加入20μlPBS和300μl含有內(nèi)標(biāo)的終止試劑終止反應(yīng)，完成之后將體系配置板熱封；(7)孵育體系孵化板：把體系孵化板放在37℃的恒溫孵育器上開始溫孵，在不同的時(shí)間點(diǎn)依次向相對應(yīng)的反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔中加入20μlNADPH，在第35min向0min孔中加入20μlNADPH，即反應(yīng)時(shí)間為0min，然后立刻向所有孔中各加入300μl的含有內(nèi)標(biāo)的終止試劑終止反應(yīng)；(8)再次轉(zhuǎn)移回收率孔：將體系配置板中所有回收率孔中的混合物對應(yīng)的轉(zhuǎn)移至體系孵化板的回收率孔中，將體系孵化板熱封；(9)振蕩離心：將體系孵化板振蕩10min后，4℃，6000g下，離心10min(離心條件優(yōu)選為4℃，6000g)，然后取上清70μl至一個(gè)96孔淺孔板中，進(jìn)LC-MS/MS分析，檢測各孔中化合物原形的質(zhì)譜響應(yīng)As和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)Ai；(10)計(jì)算清除率及回收率：利用化合物質(zhì)譜響應(yīng)As、內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)Ai，計(jì)算As/Ai值，計(jì)算剩余百分比，計(jì)算LN；剩余百分比(％)＝不同時(shí)間點(diǎn)的(As/Ai)/0min的(As/Ai)×100；LN＝ln(剩余百分比)；以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以LN為縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，添加趨勢線，得到線性回歸方程，確定趨勢線的斜率，計(jì)算清除率和回收率，清除率(CL，μl/min/mgprotein)＝斜率的絕對值/微粒體蛋白濃度(單位mg/ml)×1000，回收率(recovery，％)＝(反應(yīng)時(shí)間為0min的孔的As/Ai)/(回收率孔的As/Ai)×100。其中微粒體蛋白濃度是指加入含有內(nèi)標(biāo)的終止試劑終止反應(yīng)之前的微粒體的蛋白濃度，即0.58mg/ml×130μl/(130+20)μl＝0.5mg/ml。回收率的計(jì)算可以用于初步判斷化合物的代謝過程是否是NADPH依賴，即比較加NADPH和不加NADPH時(shí)化合物響應(yīng)的變化，當(dāng)回收率<80％時(shí)，化合物可能存在非NADPH依賴的代謝，具體的確認(rèn)還需進(jìn)步一研究。優(yōu)選的，步驟(5)中的反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔分別設(shè)定為0min孔、5min孔、10min孔和30min孔；即相對應(yīng)的，步驟(7)中，在第5min向30min孔中加入NADPH，即反應(yīng)時(shí)間為5min；在第25min向10min孔中加入NADPH，即反應(yīng)時(shí)間為10min；在第30min向5min孔中加入NADPH，即反應(yīng)時(shí)間為5min；在第35min向0min孔中加入NADPH，即反應(yīng)時(shí)間為0min， 完成之后立刻用多道移液器向所有的孔中加入含有內(nèi)標(biāo)的終止試劑終止反應(yīng)。本發(fā)明所述的高通量測定化合物體外代謝穩(wěn)定性的方法可以同時(shí)測定n個(gè)化合物，即對應(yīng)n個(gè)化合物，在體系配置板上設(shè)定有n個(gè)微粒體孔、n個(gè)回收率孔，在體系孵育板上設(shè)定有n個(gè)空白對照孔、n個(gè)回收率孔、以及n個(gè)化合物的反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔，1≤n≤16。所述終止試劑優(yōu)選為乙腈或甲醇。本發(fā)明還提供了使用上述測定方法來初步判斷代謝類型是NADPH依賴型代謝還是非NADPH依賴型代謝的應(yīng)用。即比較加NADPH和不加NADPH時(shí)化合物響應(yīng)的變化，如果化合物的回收率在80％-120％的范圍內(nèi)，則認(rèn)為該化合物主要經(jīng)NADPH依賴的肝微粒酶代謝，則其代謝穩(wěn)定性也主要與肝微粒酶相關(guān)；如果化合物的回收率低于80％，則化合物可能還存在非NADPH依賴的代謝，具體的確認(rèn)還需進(jìn)步一研究。有益效果：本發(fā)明中，使用96孔板解決了高通量問題；運(yùn)用倒序的加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，并在同一時(shí)間加入終止試劑終止反應(yīng)，解決了乙腈等終止試劑揮發(fā)的問題；還設(shè)計(jì)了不加NADPH的對照組recovery，能夠計(jì)算回收率，繼而發(fā)現(xiàn)篩選出那些不依賴于NADPH代謝的化合物。具體實(shí)施方式1、設(shè)計(jì)96孔板(以16個(gè)化合物為例)其中：板1為體系配置板；板2為體系孵育板；testNumber：化合物序號(96孔板最 多可同時(shí)測定16個(gè)化合物，即用test1-test16代表化合物1-16)；Blank：空白對照孔；Recovery：回收率孔；0min、5min、10min、30min：反應(yīng)不同時(shí)間點(diǎn)孔。具體的，testNumber-微粒體孔：該化合物的微粒體孔；testNumber-Blank：該化合物的空白對照孔；testNumber-Recovery：該化合物的回收率孔；testNumber-0min：該化合物的反應(yīng)0min孔；testNumber-10min：該化合物的反應(yīng)10min孔；testNumber-15min：該化合物的反應(yīng)15min孔；testNumber-30min：該化合物的反應(yīng)30min孔。2、稀釋微粒體實(shí)驗(yàn)之前從-70℃取出肝微粒體(HLM，微粒體蛋白濃度20mg/ml)，37℃溶解后，按28.8μl/孔加入板1的test1-test16微粒體孔中，再向每孔中加入958μl預(yù)冷的磷酸緩沖鹽(PBS，pH7.4)，將板1移至振蕩器上，低速振蕩30s，得到稀釋的微粒體，稀釋后的微粒體的蛋白濃度為0.58mg/ml。3、轉(zhuǎn)移空白對照孔使用8道移液器，從稀釋的微粒體中取出130μl，轉(zhuǎn)移至板2的test1-Blank---test16-Blank孔作為Blank，并分別加入20μlPBS。4、微粒體與化合物混合向板1的test1-test16微粒體孔中加入10μl的化合物test1-test16的工作液(化合物用乙腈調(diào)配至濃度為100μM的工作液)，并低速振蕩1min，得到混合微粒體。5、轉(zhuǎn)移各反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)孔使用8道移液器，從步驟4制備好的板1的混合微粒體中各取出130μl，對應(yīng)的轉(zhuǎn)移至板2的test1-0min---test16-0min作為0min；再次取出130μl轉(zhuǎn)移至板2的test1-5min---test16-5min孔作為5min孔；再次取出130μl轉(zhuǎn)移至板2的test1-10min---test16-10min孔作為10min孔；再次取出130μl轉(zhuǎn)移至板2的test1-30min---test16-30min孔作為30min孔。6、轉(zhuǎn)移回收率孔使用8道移液器，從步驟4制備好的板1的混合微粒體中各取出130μl，對應(yīng)的轉(zhuǎn)移至板1的test1-Recovery---test16-Recovery孔作為Recovery，并各加入20μlPBS和300μl含有內(nèi)標(biāo)的乙腈終止反應(yīng)，完成之后將板1熱封，熱封溫度170℃左右，時(shí)間10秒。7、孵育板2把板2放在37℃的恒溫孵育器上開始溫孵。在第5min，用8道移液器向30min孔中加入20μlNADPH。在第25min，用8道移液器向10min孔中加入20μlNADPH。在第30min，用8道移液器向5min孔中加入20μlNADPH。在第35min，用8道移液器向0min孔中加入20μlNADPH，完成之后立刻用多道移液器向所有的孔中加入300μl含有內(nèi)標(biāo)的乙腈終止反應(yīng)。8、再次轉(zhuǎn)移Recovery使用8道移液器，將板1中的所有Recovery孔中的混合物，轉(zhuǎn)移至板2的test1-Recovery---test16-Recovery孔中，完成之后將板2熱封，熱封溫度170℃左右，時(shí)間10秒。9、振蕩離心將板2震搖10min后，4℃，6000g下，離心10min，然后取上清70μl至96孔淺孔板中，進(jìn)LC-MS/MS分析，檢測每孔中化合物原形的質(zhì)譜響應(yīng)As和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)Ai。質(zhì)譜響應(yīng)是指在質(zhì)譜檢測時(shí)，化合物和內(nèi)標(biāo)本身的分子離子峰的峰面積。10、計(jì)算清除率及回收率利用化合物質(zhì)譜響應(yīng)As、內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)Ai，計(jì)算As/Ai值，計(jì)算剩余百分比，計(jì)算LN。剩余百分比(％)＝不同時(shí)間點(diǎn)的(As/Ai)/0min的(As/Ai)×100。LN＝ln(剩余百分比)。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以LN為縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，添加趨勢線，得到線性回歸方程，確定趨勢線的斜率，計(jì)算清除率和回收率，清除率(CL，μl/min/mgprotein)＝斜率的絕對值/微粒體蛋白濃度(單位mg/ml)×1000，回收率(recovery，％)＝(反應(yīng)時(shí)間為0min的孔的As/Ai)/(回收率孔的As/Ai)×100。其中微粒體蛋白濃度是指加入含有內(nèi)標(biāo)的乙腈終止反應(yīng)之前的微粒體的蛋白濃度，即0.58mg/ml×130μl/(130+20)μl＝0.5mg/ml。根據(jù)計(jì)算結(jié)果，判斷化合物的體外代謝穩(wěn)定性情況，在新藥研發(fā)早期實(shí)現(xiàn)高通量篩選的目的，并發(fā)現(xiàn)那些非NADPH依賴代謝的化合物，為化合物結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供依據(jù)?；厥章实挠?jì)算可以用于初步判斷化合物的代謝過程是否是NADPH依賴，即比較加NADPH和不加NADPH時(shí)化合物響應(yīng)的變化，當(dāng)回收率<80％時(shí)，化合物可能存在非NADPH依賴的代謝，具體的確認(rèn)還需進(jìn)步一研究?；衔?-5的測定根據(jù)上述步驟，我們具體的選擇了5種化合物在肝微粒體中進(jìn)行試驗(yàn)，對化合物1-5進(jìn)行了檢測和計(jì)算，檢測和計(jì)算結(jié)果如下?；衔?-5分別為咪達(dá)唑侖、普萘洛爾、阿替洛爾、化合物4、化合物5，內(nèi)標(biāo)為替硝唑?；衔?的測試結(jié)果化合物1的As、Ai測定結(jié)果，剩余百分比及LN的計(jì)算結(jié)果見表1：表1化合物1測試結(jié)果化合物質(zhì)譜響應(yīng)As內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)AiAs/Ai剩余百分比，％LNtest1-HLM-Blank737376740.00test1-HLM-Recovery21166157714312.74test1-HLM-0min22559687286573.10100.04.6test1-HLM-5min11286747241241.5650.33.9test1-HLM-10min5904187122590.8326.83.3test1-HLM-30min571586925880.082.71.0test1-HLM-Blank代表化合物1的空白對照孔，test1-HLM-Recovery代表化合物1的回收率孔，test1-HLM-0min代表化合物1的反應(yīng)時(shí)間為0min的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)孔，test1-HLM-5min代表化合物1的反應(yīng)時(shí)間為5min的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)孔，test1-HLM-10min代表化合物1的反應(yīng)時(shí)間為10min的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)孔，test1-HLM-30min代表化合物1的反應(yīng)時(shí)間為30min的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)孔，其他化合物2～15的表格中的縮寫定義參照此表。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以LN為縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，添加趨勢線，得到線性回歸方程y＝-0.1318x+4.5960，確定趨勢線的斜率絕對值為0.1318，計(jì)算得到清除率為262μl/min/mgprotein，回收率為113％?；衔?的測試結(jié)果化合物2的As、Ai測定結(jié)果，剩余百分比及LN的計(jì)算結(jié)果見表2：表2化合物2測試結(jié)果化合物質(zhì)譜響應(yīng)As內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)AiAs/Ai剩余百分比，％LNtest2-HLM-Blank786680560.00test2-HLM-Recovery1596557278700.22test2-HLM-0min1480416824830.22100.04.6test2-HLM-5min1427297015800.2093.84.5test2-HLM-10min1426687097600.2092.74.5test2-HLM-30min1500436919820.22100.04.6以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以LN為縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，添加趨勢線，得到線性回歸方程為y＝0.0009x+4.5594，確定趨勢線的斜率為0，計(jì)算得到清除率為0μl/min/mgprotein，回收率為99％。化合物3的測試結(jié)果化合物3的As、Ai測定結(jié)果，剩余百分比及LN的計(jì)算結(jié)果見表3：表3化合物3測試結(jié)果化合物質(zhì)譜響應(yīng)As內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)AiAs/Ai剩余百分比，％LNtest3-HLM-Blank1326850960.00test3-HLM-Recovery432367441980.06test3-HLM-0min412266765420.06100.04.6test3-HLM-5min388026623120.0696.14.6test3-HLM-10min357026427700.0691.24.5test3-HLM-30min307956651320.0576.04.3以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以LN為縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，添加趨勢線，得到線性回歸方程y＝-0.0092x+4.6074，確定趨勢線的斜率絕對值為0.009，計(jì)算得到清除率為18μl/min/mgprotein，回收率為105％?；衔?的測試結(jié)果化合物4的As、Ai測定結(jié)果，剩余百分比及LN的計(jì)算結(jié)果見表4：表4化合物4測試結(jié)果化合物質(zhì)譜響應(yīng)As內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)AiAs/Ai剩余百分比，％LNtest4-HLM-Blank10136757490.00test4-HLM-Recovery8047577504611.07test4-HLM-0min8714006817181.28100.04.6test4-HLM-5min8540586726641.2799.34.6test4-HLM-10min8157486814501.2093.74.5test4-HLM-30min7830446671721.1791.84.5以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以LN為縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，添加趨勢線，得到線性回歸方程y＝-0.0028x+4.5978，確定趨勢線的斜率的絕對值為0.0028，計(jì)算得到清除率為4μl/min/mgprotein，回收率為119％?；衔?的測試結(jié)果化合物5的As、Ai測定結(jié)果，剩余百分比及LN的計(jì)算結(jié)果見表1：表5化合物5測試結(jié)果化合物質(zhì)譜響應(yīng)As內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜響應(yīng)AiAs/Ai剩余百分比，％LNtest5-HLM-Blank19693980.00test5-HLM-Recovery21004630800.33test5-HLM-0min7607646490.12100.04.6test5-HLM-5min2168581270.0431.73.5test5-HLM-10min1158644370.0215.32.7test5-HLM-30min243593490.003.51.2以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以LN為縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，添加趨勢線，得到線性回歸方程為y＝-0.187x+4.535，確定趨勢線的斜率的絕對值為0.187，計(jì)算得到清除率為374μl/min/mgprotein，回收率為35％。因?yàn)楦闻K為藥物代謝的主要器官，而肝臟的主要代謝酶為肝微粒體酶。大部分藥物在肝臟代謝，最終清除到體外。所以考察化合物在肝臟的代謝穩(wěn)定性，能反映化合物在體內(nèi)的清除情況。本試驗(yàn)中，如果化合物的清除率比較低，則說明其代謝穩(wěn)定性比較好，即被肝微粒體酶代謝比較少；如果化合物的清除率比較高，則說明其代謝穩(wěn)定性比較差，即被肝微粒體酶代謝比較多?；厥章实挠?jì)算與化合物的代謝類型有關(guān)，肝微粒酶的代謝是NADPH依賴的，如果化合物的回收率在80％-120％的范圍內(nèi)，則認(rèn)為該化合物主要經(jīng)NADPH依賴的肝微粒酶代謝，則其代謝穩(wěn)定性也主要與肝微粒酶相關(guān)；如果化合物的回收率低于80％，則提示該化合物可能還被非NADPH依賴的其他酶代謝，則其代謝穩(wěn)定性就比較復(fù)雜，需要將此化合物與其他可能的代謝酶進(jìn)行孵育，來判斷其的代謝類型。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明所揭示的技術(shù)范圍內(nèi)，可不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3