一種肝微粒體中6α-羥基紫杉醇濃度的UPLC/MS/MS檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物的檢測(cè)方法，具體涉及肝微粒體中6 α -羥基紫杉醇濃度的UPLC/ MS/MS檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CYP450酶是參與藥物代謝的主要酶系，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、 CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等與藥物代謝密切相關(guān)的同工酶。研究表明，大部分藥物-藥 物相互作用的發(fā)生與CYP450酶活性的誘導(dǎo)和抑制相關(guān)，其中主要由酶抑制引起。利用體外 方法進(jìn)行藥物代謝研究，可有效縮短新藥研發(fā)周期，直接觀察酶對(duì)底物的選擇性代謝和底 物對(duì)酶的誘導(dǎo)和抑制，確定藥物代謝途徑，預(yù)測(cè)體內(nèi)潛在的藥物相互作用。目前，常用的體 外方法為探針?biāo)幬锓?，該方法通過(guò)建立肝微粒體溫孵體系，從而建立了藥物代謝研究模型。
[0003] 6α -羥基紫杉醇是CYP2C8探針底物紫杉醇的代謝產(chǎn)物。因此，目前亟需一種肝微 粒體中6 α -羥基紫杉醇濃度的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種肝微粒體中6 α -羥基紫杉醇濃度的UPLC/ MS/MS檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0005] (1)建立肝微粒體溫孵體系，加入內(nèi)標(biāo)物和系列濃度的6 α -羥基紫杉醇對(duì)照品， 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品；
[0006] (2)將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)；
[0007] 色譜條件如下：
[0008] 色譜柱：C18色譜柱；
[0009] 流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0. 1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0. 1 %甲酸乙腈溶液；
[0010] 梯度洗脫條件為：
[0011]
[0012] 運(yùn)行時(shí)間為3分鐘；
[0013] 質(zhì)譜條件如下：
[0014] 離子源：電噴霧離子源；
[0015] 檢測(cè)方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；
[0016] 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得到6 α -羥基紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0017] ⑶按照步驟⑴相同的方法，將底物紫杉醇與肝微粒體溫孵體系共溫孵，制備得 到含有內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)樣品，將待測(cè)樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，按照步驟（2)相同的 條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)樣品中的6 α -羥基紫杉醇濃度。
[0018] 其中，溫孵的時(shí)間為20min。
[0019] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)物為鄰甲苯海拉明。
[0020] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，流動(dòng)相的流速為0. 3mL/min。
[0021] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，柱溫為40°C。
[0022] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，色譜柱為ACQUITY UPLC-BHl C18色譜柱，規(guī)格為 1. 7 μ m, 2. I X 50mm〇
[0023] 優(yōu)選地，所述色譜條件中，進(jìn)樣量為I yL。
[0024] 優(yōu)選地，所述正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)中，6 α -羥基紫杉醇的母離子-子離子對(duì)為m/z 870. 41 -m/z 286. 05,錐孔電壓為9V，碰撞電壓為16V ;鄰甲苯海拉明的母離子-子離子對(duì) 為111/2270.10 - 111/2 181.08，錐孔電壓為15￥，碰撞電壓為12￥。
[0025] 優(yōu)選地，所述質(zhì)譜條件中，毛細(xì)管電壓為3000V，離子源溫度為150°C，去溶劑化溫 度為350°C，去溶劑化氣體流速為650L/h。
[0026] 優(yōu)選地，所述質(zhì)譜條件中，錐孔氣體流速為150L/h，霧化氣壓力為6. Obar。
[0027] 優(yōu)選地，所述步驟（1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備方法為：將6 α -羥基紫杉醇加入肝微 粒體溫孵體系，所述肝微粒體溫孵體系包含肝微粒體、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶、MgCl 2、PBS和NADP，再加入含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液，混勾，離心，取上清液，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣 品。
[0028] 其中，標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的制備可以按照下述方法進(jìn)行：分別將系列濃度的對(duì)照標(biāo)準(zhǔn) 品6 α -羥基紫杉醇加入肝微粒體溫孵體系（包含肝微粒體、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶、MgCl2、PBS和NADP)，再加入含內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液，充分混勻3min，于4°C，13000rpm 離心10min，取上清液即得。肝微粒可以采用人、大鼠、小鼠、犬、恒河猴、食蟹猴的肝微粒。
[0029] 本發(fā)明專一地檢測(cè)對(duì)肝微粒體中的6 α -羥基紫杉醇濃度，色譜分析時(shí)間僅需3分 鐘，進(jìn)樣量?jī)H需I μL，分析時(shí)間短、靈敏度高、進(jìn)樣量小。同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)方法專屬性強(qiáng)、基 質(zhì)效應(yīng)小、線性和范圍廣、批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度與精密度高、進(jìn)樣盤穩(wěn)定性高、工作液穩(wěn)定性 高，符合方法學(xué)驗(yàn)證要求，適用于肝微粒體溫孵樣本中6 α -羥基紫杉醇濃度的測(cè)定，具有 廣泛的應(yīng)用前景。
[0030] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0031] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 所用肝微粒體為人肝微粒體。
[0033] 圖1為母離子和錐孔電壓的優(yōu)選結(jié)果。
[0034] 圖2的質(zhì)譜條件為：離子對(duì)：m/z 870. 41 - m/z 105. 07,錐孔電壓9V，碰撞電壓 46V〇
[0035] 圖3的質(zhì)譜條件為：離子對(duì)：m/z 870. 41 - m/z 122. 09,錐孔電壓9V，碰撞電壓 32V〇
[0036] 圖4的質(zhì)譜條件為：離子對(duì)：m/z 870. 41 - m/z 286. 05,錐孔電壓9V，碰撞電壓 16V，也即本發(fā)明的質(zhì)譜條件。
[0037] 圖5空白樣本的色譜圖。
[0038] 圖6 LLOQ (定量下限）樣本色譜圖。
[0039] 圖7為待測(cè)樣本色譜圖。
[0040] 圖8為6 α -羥基紫杉醇典型標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 實(shí)施例1
[0042] 所述試劑和儀器均來(lái)自市售的商品。
[0043] 1、對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)
[0044] 6 α -羥基紫杉醇（OH-TX):分子量 869. 91，純度 95 %，批號(hào) 3-WXT-24-2 (TCR);
[0045] 檸檬酸鄰甲苯海拉明（IS，正離子內(nèi)標(biāo)）：純度99 %，批號(hào) 048F0510V(sigma-aldrich)。
[0046] 2、主要儀器
[0047]
[0048] 3、試驗(yàn)所用主要軟件
[0049] UNIFI 1. 6. I :UPLC/MS/MS 數(shù)據(jù)采集及濃度計(jì)算。
[0050] 4、檢測(cè)方法
[0051] (1)制備對(duì)照樣品，加入內(nèi)標(biāo)物；
[0052] (2)將對(duì)照樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)；檢測(cè)條件如下：
[0053] 色譜柱：ACQUITY UPLC-BEH C18, 1. 7 μ m, 2. I X 50mm(Waters 公司）
[0054] 流動(dòng)相：A :0.1 %甲酸水溶液
[0055] B :0· 1 %甲酸乙腈溶液
[0056] 流速： 0· 3mL/min
[0057] 柱溫： 40 °C
[0058] 進(jìn)樣盤溫度：4°C
[0059] 離子源： 電噴霧離子化源（ESI);
[0060] 內(nèi)標(biāo)（IS) :10ng/mL鄰甲苯海拉明甲醇溶液
[0061] 梯度洗脫：
[0062]
[0063] 進(jìn)樣量： IyL
[0064] 運(yùn)行時(shí)間： 3min
[0065] 保留時(shí)間： tR(0H τχ產(chǎn) I. 70min ; t R(IS)~ I. 57min
[0066] 毛細(xì)管電壓（Capillary voltage) : 3. OOkV
[0067] 離子源溫度（Source Temperature) : 150°C
[0068] 去溶劑化溫度（Desolvation Temperature) : 350°C
[0069] 去溶劑化氣體流速（Desolvation gas flow) : 650L/h
[0070] 錐孔氣體流速（Cone gas flow) : 150L/h
[0071] 霧化氣壓力（Nebulizer gas pressure) : 6. Obar
[0072] 檢測(cè)方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM)
[0073] 離子對(duì)： m/z 870. 41 -m/z 286. 05(0H-TX)，m/z 270. 10 -m/z 181. 08(IS)
[0074] 錐孔電壓（Cone voltage) : 9V (OH-TX)和 15V (IS)
[0075] 碰撞電壓（Collision energy) : 16V(0Η-ΤΧ)和 12V(IS)
[0076] 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得到6 a -羥基紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0077] (3)按照步驟（1)相同的方法，將底物紫杉醇與肝微粒體溫孵體系共溫孵20min， 制備得到含有內(nèi)標(biāo)物的待測(cè)樣品，將待測(cè)樣品注入U(xiǎn)PLC/MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀，按照步驟（2) 相同的條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)樣品中的6 a -羥基紫杉醇濃度。
[0078] 在確定本發(fā)明的檢測(cè)方法各項(xiàng)工藝參數(shù)中，發(fā)明人對(duì)本發(fā)明方法的色譜條件和質(zhì) 譜條件進(jìn)行了篩選，結(jié)果如圖1-4所示。
[0079] 圖1為母離子和錐孔電壓的優(yōu)選結(jié)果。
[0080] 三種離子對(duì)的檢測(cè)結(jié)果如下：
[0081] (1)圖2的質(zhì)譜條件為：
[0082] 離子對(duì)：m/z 870.41 - m/z 105.07，錐孔電壓叭，碰撞電壓46￥。
[0083] 結(jié)果顯示強(qiáng)度為6456422。
[0084] (2)圖3的質(zhì)譜條件為：
[0085] 離子對(duì)：m/z 870.41 -m/z 122.09，錐孔電壓叭，碰撞電壓32￥。
[0086] 結(jié)果顯示強(qiáng)度為4879034。
[0087] (3)圖4的質(zhì)譜條件為：