本發(fā)明涉及一種含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法，尤其是一種含釓羥基磷灰石納米顆粒的激光成像檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：羥基磷灰石和人體及動(dòng)物的骨骼和牙齒的無機(jī)成分相似，近年來吸引了生物材料各領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。三價(jià)釓離子（Gadoliniumions，Gd3+）具有和鈣離子（Ca2+）相似的生物無機(jī)化學(xué)性質(zhì)和協(xié)調(diào)性。Gd3+能夠影響骨骼的改造周期，并且具有潛在治療骨質(zhì)疏松癥等等疾病。將羥基磷灰石和一定量的Gd3+結(jié)合，合成分子式為Ca10-xGdx(PO4)6(OH)y的含釓羥基磷灰石，有望優(yōu)化其生物化學(xué)特性。含釓羥基磷灰石作用于生物體主要通過納米顆粒的形式，對(duì)一系列含釓羥基磷灰石納米顆粒分別進(jìn)行成像和檢測(cè)，正是對(duì)其生物化學(xué)特性研究的一個(gè)重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)有針對(duì)納米顆粒成像方法主要包括：掃描電鏡、透射電鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocallaserscanningmicroscope，CLSM）等。然而，掃描電鏡和透射電鏡難以用于活細(xì)胞中納米顆粒的檢測(cè)。采用CLSM法，在對(duì)活細(xì)胞觀察中，可以實(shí)時(shí)追蹤定位生物粒子或者化學(xué)藥物被活細(xì)胞或組織攝取的過程，多熒光通道定量分析生物粒子的數(shù)量及熒光強(qiáng)度，在一張圖像里不同通道可選用不同的偽彩色，以及多層面采集圖像合成三維立體圖等。在CLSM下檢測(cè)納米顆粒時(shí)，現(xiàn)有的方法是在納米顆粒的表面進(jìn)行熒光標(biāo)記。針對(duì)含釓羥基磷灰石納米顆粒（nano-HA-Gd）的檢測(cè)，人們經(jīng)常用一種熒光探針FITC（fluoresceinisothiocyanate）結(jié)合APTS（（3-aminopropyl）triethoxysilane）標(biāo)記在nano-HA-Gd上。這種方法存在以下兩方面主要缺陷：第一，被熒光物質(zhì)標(biāo)記后的nano-HA-Gd的物理化學(xué)性質(zhì)會(huì)改變，例如其表面的活性官能團(tuán)被熒光化合物占據(jù)、表面電荷改變、粒徑改變，與細(xì)胞的相互作用與未用熒光標(biāo)記的nano-HA-Gd本身的作用有所不同，因此不能體現(xiàn)nano-HA-Gd生物效應(yīng)最真實(shí)、原始的特性，從而影響對(duì)待測(cè)的nano-HA-Gd生物效應(yīng)的判斷；第二，存在光漂白的問題：由于絕大多數(shù)熒光物質(zhì)在經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間、連續(xù)的激光照射后熒光強(qiáng)度會(huì)明顯減弱，不能夠長(zhǎng)時(shí)間在CLSM下準(zhǔn)確檢測(cè)，因此成像、定量時(shí)不可避免地產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。為此，亟待建立一種準(zhǔn)確的檢測(cè)方法來實(shí)時(shí)追蹤含釓羥基磷灰石納米顆粒，同時(shí)不影響其生物化學(xué)特性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法，可對(duì)含釓羥基磷灰石納米顆粒進(jìn)行連續(xù)的、長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)時(shí)追蹤和定位成像。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法，可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的含釓羥基磷灰石納米顆粒。本發(fā)明提供了一種含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法，包括：準(zhǔn)備待測(cè)樣品，待測(cè)樣品中含有含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒；用激光照射待測(cè)樣品，并采集反射光；以及根據(jù)采集到的反射光形成圖像、光譜曲線和/或定量數(shù)據(jù)。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的另一種示意性實(shí)施方式中，用激光照射時(shí)，使用的激光的波長(zhǎng)為200nm至1050nm范圍內(nèi)的任一波長(zhǎng)。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的再一種示意性實(shí)施方式中，用激光照射時(shí)，使用的激光的波長(zhǎng)為361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任一波長(zhǎng)。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，采集圖像使用的掃描波長(zhǎng)范圍為200nm至1050nm，步距為0.2~50nm。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，準(zhǔn)備待測(cè)樣品的步驟包括：先將含有含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒的待測(cè)物懸浮于無水乙醇中，再滴加在容器表面，待乙醇揮發(fā)后，得到待測(cè)樣品。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，準(zhǔn)備待測(cè)樣品的步驟包括：將含有含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒的待測(cè)物懸浮于水、鹽溶液、緩沖液或液體培養(yǎng)基中，得到待測(cè)樣品。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，準(zhǔn)備待測(cè)樣品的步驟包括：將含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)，得到待測(cè)樣品。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，準(zhǔn)備待測(cè)樣品的步驟還包括：將細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器和/或細(xì)胞核分別用熒光探針標(biāo)記；當(dāng)用激光照射待測(cè)樣品時(shí)，同時(shí)采集反射光和熒光，并根據(jù)采集到的反射光和熒光形成圖像及光譜曲線。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，準(zhǔn)備待測(cè)樣品的步驟包括：先將細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器和/或細(xì)胞核用熒光探針標(biāo)記，再將細(xì)胞與含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒共培養(yǎng)；或是先將細(xì)胞與含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒共培養(yǎng)，再將細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器和/或細(xì)胞核用熒光探針標(biāo)記。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，準(zhǔn)備待測(cè)樣品的步驟包括：先將細(xì)胞與含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒共培養(yǎng)，再將細(xì)胞用甲醛溶液固定，最后將細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器和/或細(xì)胞核用熒光探針標(biāo)記。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，根據(jù)采集到反射光和熒光形成圖像包括：成像、定量、實(shí)時(shí)定量及成像、三維成像、xyz/xzy切面成像、1~5個(gè)通道同時(shí)采集圖像、光漂白實(shí)驗(yàn)、光譜掃描曲線。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，待測(cè)樣品中含有帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒；當(dāng)用激光照射待測(cè)樣品時(shí)，同時(shí)采集反射光和熒光，并根據(jù)采集到的反射光和熒光形成圖像及光譜曲線。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，熒光標(biāo)記為異硫氰酸熒光素。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，通過激光掃描共聚焦顯微鏡實(shí)施激光照射及采集。在含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法的還一種示意性實(shí)施方式中，其包括：先用激光照射含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒的濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品，并采集反射光，根據(jù)采集到的反射光形成圖像及光譜曲線，并提取光信號(hào)面積，結(jié)合濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；再用激光照射待測(cè)樣品，并采集反射光，根據(jù)采集到的反射光形成圖像及光譜曲線，并提取光信號(hào)面積；以及根據(jù)待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的光信號(hào)面積及標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒的濃度。本發(fā)明提供的含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法，通過激光照射待測(cè)樣品并采集反射光，再根據(jù)反射光形成圖像及光譜曲線，以此檢測(cè)待測(cè)樣品中的含釓羥基磷灰石納米顆?；驇в袩晒鈽?biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒。本發(fā)明的含釓羥基磷灰石納米顆粒的檢測(cè)方法有以下優(yōu)點(diǎn)：1)含釓羥基磷灰石納米顆粒和帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒在激光照射下的反射光的波長(zhǎng)和其激發(fā)波長(zhǎng)相同，光譜中顯示反射光的強(qiáng)度峰窄而銳，檢測(cè)準(zhǔn)確度高；2)光面積-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，證明反射光能夠準(zhǔn)確成像并定量含釓羥基磷灰石納米顆粒和/或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒；3)在水、鹽溶液、緩沖液、培養(yǎng)基中的含釓羥基磷灰石納米顆粒和帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒均能夠在激光的反射光下穩(wěn)定的成像、定量、實(shí)時(shí)定量及成像、三維成像、xyz/xzy切面成像、多通道共定位，且在光漂白實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的光穩(wěn)定性；4)含釓羥基磷灰石納米顆?；驇в袩晒鈽?biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)后，利用激光在含釓羥基磷灰石納米顆?；驇в袩晒鈽?biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒上的反射光，能夠?qū)崟r(shí)追蹤、定位、觀察含釓羥基磷灰石納米顆?；驇в袩晒鈽?biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒被細(xì)胞攝取的過程、顆粒的分布、聚集的狀態(tài)、聚集的量，細(xì)胞的狀態(tài)，還能進(jìn)行成像、定量、實(shí)時(shí)定量及成像、三維成像、xyz/xzy切面成像、多通道共定位、光漂白實(shí)驗(yàn)；5)含釓羥基磷灰石納米顆粒或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器和/或細(xì)胞核經(jīng)過熒光探針標(biāo)記，并不影響含釓羥基磷灰石納米顆?；驇в袩晒鈽?biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒的成像，激光在含釓羥基磷灰石納米顆?；驇в袩晒鈽?biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒上的反射光，能夠與其他標(biāo)記的熒光成像、定量、實(shí)時(shí)定量及成像、三維成像、xyz/xzy切面成像、多通道共定位、光漂白實(shí)驗(yàn)；6)含釓羥基磷灰石納米顆粒或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)后，將細(xì)胞固定后再將其細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞器和/或細(xì)胞核經(jīng)過熒光探針標(biāo)記，激光在含釓羥基磷灰石納米顆?；驇в袩晒鈽?biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒上的反射光仍能夠與熒光探針成像、定量、實(shí)時(shí)定量及成像、三維成像、xyz/xzy切面成像、多通道共定位、光漂白實(shí)驗(yàn)。含釓羥基磷灰石納米顆粒或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒經(jīng)強(qiáng)烈的激光連續(xù)照射后，其反射光通道的圖像仍然清晰可見，光強(qiáng)幾乎不變，而來自其他熒光標(biāo)記物的熒光強(qiáng)度則明顯減弱，證實(shí)了反射光圖像幾乎不受光漂白的影響，具有很好的光穩(wěn)定性；7)在含釓羥基磷灰石納米顆?；驇в袩晒鈽?biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒與細(xì)胞共培養(yǎng)后，培養(yǎng)物中的含釓羥基磷灰石納米顆粒或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒通過激光照射所得的反射光，結(jié)合細(xì)胞中的多種熒光標(biāo)記物質(zhì)（例如對(duì)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行熒光標(biāo)記的物質(zhì)）產(chǎn)生的熒光，可用于定位含釓羥基磷灰石納米顆粒或帶有熒光標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒，能夠反應(yīng)出最真實(shí)、準(zhǔn)確的含釓羥基磷灰石納米顆?；驇в袩晒鈽?biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒被活細(xì)胞或組織攝取的全部過程。附圖說明以下附圖僅對(duì)本發(fā)明做示意性說明和解釋，并不限定本發(fā)明的范圍。圖1為nano-HA-Gd(a)，nano-HA-Gd-FITC(b)和FITC溶液(c)在CLSM下400至650nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光譜圖。圖2為CLSM的反射光通道和FITC通道光路示意圖以及nano-HA-Gd(a)，nano-HA-Gd-FITC(b)和FITC溶液(c)在上述通道下的成像。圖3為nano-HA-Gd和nano-HA-Gd-FITC在CLSM的反射光通道和FITC通道下各呈現(xiàn)的成像面積和濃度之間的線性關(guān)系。(a)反射光通道測(cè)量的nano-HA-Gd標(biāo)準(zhǔn)曲線，(b)反射光通道測(cè)量的nano-HA-Gd-FITC標(biāo)準(zhǔn)曲線，(c)FITC通道測(cè)量的nano-HA-Gd-FITC標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為nano-HA-Gd與BMSCs共培養(yǎng)2、6、12、24小時(shí)CLSM的反射光通道的實(shí)時(shí)成像圖。圖5為nano-HA-Gd-FITC與BMSCs共培養(yǎng)2、6、12、24小時(shí)的實(shí)時(shí)成像圖。(A)反射光通道，(B)FITC通道。圖6為nano-HA-Gd與BMSCs共培養(yǎng)一段時(shí)間后，CLSM采集細(xì)胞微絲-細(xì)胞核-nano-HA-Gd成像圖。(b)是(a)的放大圖像，(c)是(b)的xzy縱切圖像。圖7為nano-HA-Gd被BMSCs攝取后，CLSM采集細(xì)胞微絲-細(xì)胞核-nano-HA-Gd延z軸連續(xù)掃描各層細(xì)胞樣品的圖像。(a)Rhodaminephalloidin通道，(b)Hoechst33258通道，(c)反射光通道，（d）a，b，c的疊加圖。圖8nano-HA-Gd-FITC與BMSCs共培養(yǎng)一段時(shí)間后，CLSM采集細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核-nano-HA-Gd-FITC成像圖。(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c)反射光通道，(d)FITC通道，（e）a，b，c，d的疊加圖。(II)是(I)的xzy縱切圖像。圖9為nano-HA-Gd-FITC被BMSCs攝取后，CLSM采集細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核-nano-HA-Gd-FITC延z軸連續(xù)掃描各層細(xì)胞樣品的圖像。(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c)反射光通道，(d)FITC通道，（e）a，b，c，d的疊加圖。圖10為光漂白前后各個(gè)通道圖像，(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c)反射光通道，(d)FITC通道，（e）a，b，c，d的疊加圖。圖11為光漂白區(qū)域的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)圖像，(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c)反射光通道，(d)FITC通道，（e）a，b，c，d的疊加圖。圖12為光漂白區(qū)域的各通道光強(qiáng)度的定量曲線，(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c)反射光通道，(d)FITC通道。具體實(shí)施方式為了對(duì)發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合以下實(shí)施例說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。本發(fā)明使用的nano-HA-Gd（含釓羥基磷灰石納米顆粒）的制備：以CaHPO4和Ca(OH)2為起始原料，按Ca：P=1.67：1的配比混合，加一定量的GdCl3(8x10-5mol/mol,Gd3+/Ca2+)，溶解于去離子水，分別用冰醋酸溶液或KOH溶液調(diào)pH值為9，攪拌30min，然后放入聚四氟乙烯的高壓釜中，水熱條件下加熱至140℃反應(yīng)24小時(shí)，然后將高壓釜冷卻至室溫，離心，用無水乙醇洗滌,在60至100℃下烘干。使用前經(jīng)120℃高壓滅菌30分鐘。此外，也可通過市購(gòu)獲得nano-HA-Gd。nano-HA-Gd的熒光標(biāo)記：取nano-HA-Gd10mg，混懸于裝有10ml無水乙醇的圓底燒瓶中，超聲30分鐘后，加入0.25mlAPTS（3-氨丙基三乙氧基硅烷）及50ul三蒸水，密封后室溫?cái)嚢?4小時(shí)。收集全部液體，10000r/min離心30分鐘，甲醇洗沉淀3遍。將沉淀加入到5ml無水甲醇中，超聲10分鐘后轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，加5mgFITC（異硫氰酸熒光素）（用DMSO稀釋50mgFITC粉末至50mg/ml），密封，避光室溫?cái)嚢?4小時(shí)。收集全部液體，10000r/min離心30分鐘，甲醇洗沉淀5次，室溫?fù)]干，得到熒光標(biāo)記的羥基磷灰石納米顆粒（nano-HA-Gd-FITC）。整個(gè)過程須在避光下操作，所得產(chǎn)物在-20℃避光保存。以下實(shí)施例中使用的激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）為L(zhǎng)eicaTCSSP2。實(shí)施例1：干燥的nano-HA-Gd用CLSM檢測(cè)及光譜掃描。將少量nano-HA-Gd懸浮于少量無水乙醇中，滴加在CLSM玻璃皿中，待無水乙醇揮干，置于CLSM鏡下。在光譜掃描過程，激發(fā)光波長(zhǎng)可設(shè)置為200nm至1050nm范圍內(nèi)的任何一個(gè)或者幾個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍可設(shè)置為200nm至1050nm范圍內(nèi)的、包含激發(fā)波長(zhǎng)的檢測(cè)波長(zhǎng)范圍。此實(shí)施例中選擇四種波長(zhǎng)的激光：UV-405nm，Ar-488nm，Kr-561nm，HeNe-633nm，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍設(shè)為400nm至650nm，步距為2nm，繪制光強(qiáng)-波長(zhǎng)曲線。檢測(cè)結(jié)果如圖1中(a)所示，為nano-HA-Gd在400-650nm的接收波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜圖。在nano-HA-Gd光譜圖上405，488，561，633nm處都有一個(gè)尖銳的峰，峰寬只有約5nm，這些峰都處在其激發(fā)波長(zhǎng)的位置。實(shí)施例2：干燥的nano-HA-Gd-FITC用CLSM檢測(cè)及光譜掃描。將少量nano-HA-Gd-FITC懸浮于少量無水乙醇中，滴加在CLSM玻璃皿中，待無水乙醇揮干，置于CLSM鏡下。以FITC溶液作為對(duì)照組。在光譜掃描過程，激發(fā)光波長(zhǎng)可設(shè)置為200nm至1050nm范圍內(nèi)的任何一個(gè)或者幾個(gè)激發(fā)波長(zhǎng)，其中包括FITC的激發(fā)波長(zhǎng)，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍可設(shè)置為200nm至1050nm范圍內(nèi)的、包含激發(fā)波長(zhǎng)及FITC檢測(cè)波長(zhǎng)的檢測(cè)波長(zhǎng)范圍。此實(shí)施例中選擇四種波長(zhǎng)的激光：UV-405nm，Ar-488nm，Kr-561nm，HeNe-633nm，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍設(shè)為400nm至650nm，步距為2nm，繪制光強(qiáng)-波長(zhǎng)曲線。檢測(cè)結(jié)果如圖1中(b)和(c)所示，分別為nano-HA-Gd-FITC和FITC溶液在400-650nm的接收波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜圖。其中(b)代表nano-HA-Gd-FITC，(c)代表FITC溶液。在nano-HA-Gd-FITC光譜圖上405，488，561，633nm處都有一個(gè)尖銳的峰，峰寬只有約5nm，這些峰都處在其激發(fā)波長(zhǎng)的位置。在nano-HA-Gd-FITC光譜圖中，除了這四組峰，在520nm處有一個(gè)很寬的峰，這組峰的位置和形狀與FITC溶液的光譜中的峰一致，是FITC的發(fā)射光譜（FITC于488nm處激發(fā)）。圖2是CLSM的反射光通道（561nm處激發(fā)，561nm處檢測(cè)其反射光）和FITC通道（488nm處激發(fā)，520nm附近檢測(cè)其熒光）光路示意圖，以及實(shí)施例1和2中nano-HA-Gd(a)，nano-HA-Gd-FITC(b)和FITC溶液(c)在上述通道下的成像。當(dāng)被激光照射時(shí)，nano-HA-Gd能夠用激光的反射光波長(zhǎng)成像，F(xiàn)ITC熒光通道下無任何熒光；nano-HA-Gd-FITC既能夠在激發(fā)光位置處檢測(cè)到反射光圖像，又能表現(xiàn)出FITC熒光性質(zhì)得到熒光圖像；而FITC溶液只呈現(xiàn)熒光圖像。將nano-HA-Gd或nano-HA-Gd-FITC懸浮于溶液（例如磷酸鹽緩沖液或液體培養(yǎng)基）中，置于CLSM鏡下。在光譜掃描過程中打開CLSM四組激發(fā)光源通道，發(fā)出四種波長(zhǎng)的激光：UV-405nm，Ar-488nm，Kr-561nm，HeNe-633nm，檢測(cè)波長(zhǎng)范圍設(shè)為400nm至650nm，步距為3nm，繪制光強(qiáng)-波長(zhǎng)曲線。其檢測(cè)結(jié)果與干燥的nano-HA-Gd或nano-HA-Gd-FITC的CLSM光譜掃描結(jié)果一致。實(shí)施例3：干燥的nano-HA-Gd的定量分析。1、操作步驟：1.1、將nano-HA-Gd用乙醇對(duì)其逐級(jí)稀釋，分別依次向CLSM玻璃皿中加一滴混懸乙醇液，待乙醇揮發(fā)，在CLSM下用反射光通道（以一組激發(fā)光的反射光為例，561nm處激發(fā)，561nm處檢測(cè)其反射光）對(duì)其成像；通過圖像分析儀對(duì)圖像提取光信號(hào)面積，結(jié)合對(duì)應(yīng)的濃度比率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；1.2、將含有nano-HA-Gd的待測(cè)物用乙醇稀釋，向CLSM玻璃皿中加一滴混懸乙醇液，待乙醇揮發(fā)，在CLSM下用反射光通道對(duì)其成像；通過圖像分析儀對(duì)圖像提取光信號(hào)面積，并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)物中nano-HA-Gd的濃度。用反射光通道能檢測(cè)到nano-HA-Gd的光面積隨濃度呈現(xiàn)良好的線性，這些結(jié)果表明反射光信號(hào)能夠用于定量分析，且本方法具有較好的檢測(cè)回收率。實(shí)施例4：干燥的nano-HA-Gd-FITC的定量分析。1、操作步驟：1.1、將nano-HA-Gd-FITC用乙醇對(duì)其逐級(jí)稀釋，分別依次向CLSM玻璃皿中加一滴混懸乙醇液，待乙醇揮發(fā)，在CLSM下用FITC通道（488nm處激發(fā)，在520nm附近檢測(cè)其熒光）和反射光通道（以一組激發(fā)光的反射光為例，561nm處激發(fā)，561nm處檢測(cè)其反射光）對(duì)其成像；通過圖像分析儀對(duì)圖像提取光信號(hào)面積，結(jié)合對(duì)應(yīng)的濃度比率，分別繪制對(duì)應(yīng)于FITC通道和反射光通道的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；1.2、將含有nano-HA-Gd-FITC的待測(cè)物用乙醇稀釋，向CLSM玻璃皿中加一滴混懸乙醇液，待乙醇揮發(fā)，在CLSM下用FITC通道和反射光通道對(duì)其成像；通過圖像分析儀對(duì)圖像提取光信號(hào)面積，并分別對(duì)應(yīng)FITC通道和反射光通道的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)物中nano-HA-Gd的濃度。FITC通道和反射光通道得出的檢測(cè)結(jié)果可以相互驗(yàn)證。用反射光通道能檢測(cè)到nano-HA-Gd-FITC的光面積隨濃度呈現(xiàn)良好的線性，這些結(jié)果表明反射光信號(hào)能夠用于定量分析，且本方法具有較好的檢測(cè)回收率。實(shí)施例5：溶液中nano-HA-Gd的定量分析。1、操作步驟：1.1、將nano-HA-Gd混懸于三蒸水中得到初始濃度為64mg/mL的混懸液，用三蒸水對(duì)其逐級(jí)稀釋，分別依次向CLSM玻璃皿中加20ul混懸液，在CLSM下用反射光通道（以一組激發(fā)光的反射光為例，561nm處激發(fā)，561nm處檢測(cè)其反射光）對(duì)其成像；通過圖像分析儀對(duì)圖像提取光信號(hào)面積，結(jié)合對(duì)應(yīng)的濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；1.2、將含有nano-HA-Gd的水溶液、磷酸鹽緩沖液或液體培養(yǎng)基作為待測(cè)物，滴加至CLSM玻璃皿中，在CLSM下用反射光通道對(duì)其成像；通過圖像分析儀對(duì)圖像提取光信號(hào)面積，并對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別得出待測(cè)物中nano-HA-Gd的濃度。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線：圖3中（a）為溶液中的nano-HA-Gd在CLSM的反射光通道下呈現(xiàn)的成像面積和濃度之間的線性關(guān)系。如圖所示，用反射光通道能檢測(cè)到nano-HA-Gd的光面積隨濃度呈現(xiàn)良好的線性，這些結(jié)果表明反射光信號(hào)能夠用于定量分析。3、方法回收率：分別向空白磷酸鹽緩沖液和培養(yǎng)基中添加一定量的nano-HA-Gd粉末，使其分別達(dá)到如下表所示的nano-HA-Gd濃度，制成空白加樣樣本。利用本檢測(cè)方法對(duì)空白加樣樣本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算本檢測(cè)方法的回收率。計(jì)算結(jié)果如下表所示（為方便計(jì)算，計(jì)算過程中將空白液體體積設(shè)為1mL）；空白溶液添加水平（mg/mL）平均回收率（%）磷酸鹽緩沖液7101.1培養(yǎng)基7105.2實(shí)施例6：溶液中nano-HA-Gd-FITC的定量分析。1、操作步驟：1.1、將nano-HA-Gd-FITC混懸于三蒸水中得到初始濃度為180mg/mL的混懸液，用三蒸水對(duì)其逐級(jí)稀釋，分別依次向CLSM玻璃皿中加20ul混懸液，在CLSM下用FITC通道（488nm處激發(fā)，在520nm附近檢測(cè)其熒光）和反射光通道（以一組激發(fā)光的反射光為例，561nm處激發(fā)，561nm處檢測(cè)其反射光）對(duì)其成像；通過圖像分析儀對(duì)圖像提取光信號(hào)面積，結(jié)合對(duì)應(yīng)的濃度，分別繪制對(duì)應(yīng)于FITC通道和反射光通道的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；1.2、將含有nano-HA-Gd-FITC的水溶液、磷酸鹽緩沖液或液體培養(yǎng)基作為待測(cè)物，滴加至CLSM玻璃皿中，在CLSM下用FITC通道（488nm處激發(fā)，在520nm附近檢測(cè)其熒光）和反射光通道（以一組激發(fā)光的反射光為例，561nm處激發(fā)，561nm處檢測(cè)其反射光）對(duì)其成像；通過圖像分析儀對(duì)圖像提取光信號(hào)面積，并分別對(duì)應(yīng)FITC通道和反射光通道的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)物中nano-HA-Gd-FITC的濃度。FITC通道和反射光通道得出的檢測(cè)結(jié)果可以相互驗(yàn)證。2、標(biāo)準(zhǔn)曲線：圖3中（b）和（c）分別為CLSM的反射光通道和FITC通道下各呈現(xiàn)的成像面積和nano-HA-Gd-FITC濃度之間的線性關(guān)系。如圖所示，用反射光通道和FITC通道均能檢測(cè)到nano-HA-Gd-FITC的光面積隨濃度梯度呈現(xiàn)良好的線性，兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程差別不大，但反射光通道檢測(cè)到的線性比FITC通道的好。這些結(jié)果表明反射光信號(hào)能夠用于定量分析。3、方法回收率：分別向空白磷酸鹽緩沖液和培養(yǎng)基中添加一定量的nano-HA-Gd-FITC粉末，使其分別達(dá)到如下表所示的nano-HA-Gd-FITC濃度，制成空白加樣樣本。利用本檢測(cè)方法對(duì)空白加樣樣本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算本檢測(cè)方法的回收率。計(jì)算結(jié)果如下表所示（為方便計(jì)算，計(jì)算過程中將空白液體體積設(shè)為1mL）；檢測(cè)通道空白溶液添加水平（mg/mL）平均回收率（%）反射光通道磷酸鹽緩沖液799.2反射光通道培養(yǎng)基7105.1FITC通道磷酸鹽緩沖液7102.0FITC通道培養(yǎng)基7104.3實(shí)施例7：與細(xì)胞共培養(yǎng)的nano-HA-Gd用CLSM實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)。1、操作方法：1.1、分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs細(xì)胞）：SD大鼠(三周周齡，雌雄不限)經(jīng)乙醚麻醉后，脊椎脫臼法處死，浸泡于75%乙醇消毒5分鐘，無菌條件下取出股骨和腓骨置于盛有10mlPBS的玻璃皿中，手術(shù)刀剔去骨表面的組織及軟骨后將其置于含有10ml完全培養(yǎng)基的玻璃皿中，剪開骨骺?jī)啥?，用注射器吸取完全培養(yǎng)基將骨髓腔中的物質(zhì)全部吹出并反復(fù)吹打呈單細(xì)胞懸液，收集至15ml離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄上清液，完全培養(yǎng)基重懸以1×106/mL的細(xì)胞濃度接種于100cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)過程中，每隔3d半量更換培養(yǎng)基，一周后每3d全量更換新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞在瓶底融合密度至80%時(shí)，用EDTA-0.25%胰酶消化，1∶2的比例稀釋細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；1.2、第三代的BMSCs細(xì)胞以104cells/cm2的密度種于CLSM玻璃皿中，待細(xì)胞完全貼壁，加入nano-HA-Gd使其終濃度為100μg/cm2，置37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，在2、6、12、24小時(shí)取出細(xì)胞樣品，置于CLSM下通過反射光通道以及光鏡成像；該方法利用CLSM采集圖像的條件是，激發(fā)光波長(zhǎng)可設(shè)置為200nm至1050nm范圍內(nèi)的任何一個(gè)或者幾個(gè)波長(zhǎng)（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一個(gè)或幾個(gè)的組合），采集相應(yīng)的反射光，使用任意偽彩色成像。以一組激發(fā)光的反射光為例，反射光通道采用561nm處激發(fā)光，561nm處檢測(cè)其反射光，偽彩色選擇紅色，對(duì)nano-HA-Gd成像。2、檢測(cè)結(jié)果：圖4呈現(xiàn)了nano-HA-Gd和BMSCs共培養(yǎng)2、6、12、24小時(shí)的實(shí)時(shí)成像圖，反射光圖像顯示nano-HA-Gd和BMSCs共培養(yǎng)2小時(shí)，少部分納米顆粒吸附在顆粒表面或者被細(xì)胞攝取。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，越來越多的納米顆粒聚集成1-2um的球狀體，并形成細(xì)胞輪廓，這說明nano-HA-Gd不斷的聚集，能夠被BMSCs攝取進(jìn)入細(xì)胞。此組圖像證明在細(xì)胞存在下反射光能夠定位nano-HA-Gd，并能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像。實(shí)施例8：與細(xì)胞共培養(yǎng)的nano-HA-Gd-FITC用CLSM實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)。1、操作方法：1.1、分離BMSCs細(xì)胞：與實(shí)施例7所述相同；1.2、第三代的BMSCs細(xì)胞以104cells/cm2的密度種于CLSM玻璃皿中，待細(xì)胞完全貼壁，加入nano-HA-Gd-FITC使其終濃度為100μg/cm2，置37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，在2、6、12、24小時(shí)取出細(xì)胞樣品，置于CLSM下通過FITC通道、反射光通道以及光鏡成像；該方法利用CLSM采集圖像的條件是，激發(fā)光波長(zhǎng)可設(shè)置為200nm至1050nm范圍內(nèi)的任何一個(gè)或者幾個(gè)波長(zhǎng)（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一個(gè)或幾個(gè)的組合），其中應(yīng)包括FITC的激發(fā)波長(zhǎng)，采集相應(yīng)的反射光和熒光，使用任意偽彩色成像。以一組激發(fā)光的反射光為例，反射光通道采用561nm處激發(fā)光，561nm處檢測(cè)其反射光，偽彩色選擇紅色。FITC通道采用488nm處激發(fā)光，在520nm附近檢測(cè)其熒光，偽彩色選擇綠色。2、檢測(cè)結(jié)果：圖5呈現(xiàn)了nano-HA-Gd-FITC和BMSCs共培養(yǎng)2、6、12、24小時(shí)的實(shí)時(shí)成像圖，其中：(A)反射光通道，(B)FITC通道。反射光圖像顯示nano-HA-Gd-FITC和BMSCs共培養(yǎng)2小時(shí)，少部分納米顆粒吸附在顆粒表面或者被細(xì)胞攝取。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，越來越多的納米顆粒分布在細(xì)胞質(zhì)中，并聚集成1-2um的球狀體，這說明nano-HA-Gd-FITC能夠被BMSCs攝取進(jìn)入細(xì)胞，并且不斷的聚集。FITC圖像和反射光圖像趨勢(shì)一致，證明二者能共同定位nano-HA-Gd-FITC。實(shí)施例9：與細(xì)胞共培養(yǎng)的nano-HA-Gd用CLSM檢測(cè)，其中細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分別用熒光探針標(biāo)記。1、本實(shí)施例中待測(cè)樣品的制備方法包括三種：1.1、活細(xì)胞熒光標(biāo)記方法一：細(xì)胞種在CLSM玻璃皿中貼壁后，先將細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核用熒光探針標(biāo)記，具體步驟為：小心吸走培養(yǎng)液，在細(xì)胞樣品上均勻滴加200ulHoechst33342(4μg/ml)，并在37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育60min，小心吸走上述染色液并均勻滴加200ulCMTMR(2μmol/ml)，同樣條件孵育30min后，PBS緩沖液小心沖洗細(xì)胞2遍，加入含有100μg/cm2nano-HA-Gd的完全培養(yǎng)基，避光，在孵育箱培養(yǎng)，可隨時(shí)取出進(jìn)行CLSM檢測(cè)；1.2、活細(xì)胞熒光標(biāo)記方法二：nano-HA-Gd與細(xì)胞共培養(yǎng)一定時(shí)間后，先加入nano-HA-Gd，避光，在孵育箱培養(yǎng)，可隨時(shí)取出，按照方案1.1的方法給細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核用熒光探針標(biāo)記，進(jìn)行CLSM檢測(cè)；1.3、固定后的細(xì)胞熒光標(biāo)記：nano-HA-Gd與細(xì)胞共培養(yǎng)一定時(shí)間后，棄去培養(yǎng)液，用37℃的PBS洗玻片2次；4%甲醛固定液固定細(xì)胞15分鐘，PBS洗2次；加-20℃丙酮覆蓋全部細(xì)胞，-20℃冰箱放置5分鐘，PBS洗三次；每個(gè)樣品加Rhodaminephalloidin（羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽）應(yīng)用液200ul，室溫放置20分鐘，PBS洗三次。載玻片標(biāo)記后，中間位置加一滴封片液，蓋玻片有細(xì)胞的一側(cè)朝下，蓋在載玻片的封片液上，注意不能有氣泡。若為共聚焦小皿，可用PBS覆蓋細(xì)胞樣品。每個(gè)樣品加Hoechst33258應(yīng)用液200ul，37℃孵育30分鐘，PBS洗三次，進(jìn)行CLSM檢測(cè)。2、針對(duì)上述待測(cè)樣品CLSM檢測(cè)圖像采集項(xiàng)目：2.1、采集條件：激發(fā)光波長(zhǎng)可設(shè)置為200nm至1050nm的任何一個(gè)或者幾個(gè)波長(zhǎng)（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一個(gè)或幾個(gè)的組合），其中應(yīng)包括Rhodaminephalloidin和Hoechst33258/Hoechst33342的激發(fā)波長(zhǎng)，采集相應(yīng)的反射光和熒光，使用任意偽彩色成像。針對(duì)1.3的細(xì)胞樣品，發(fā)射光波長(zhǎng)選擇570~620nm，偽彩色選擇紅色，采集細(xì)胞微絲的Rhodaminephalloidin熒光圖像；發(fā)射光波長(zhǎng)選擇400~480nm，偽彩色選擇藍(lán)色，采集細(xì)胞核區(qū)的Hoechst33258熒光圖像；選擇200nm至1050nm范圍內(nèi)的任意一種波長(zhǎng)（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一個(gè)或幾個(gè)的組合），發(fā)射波長(zhǎng)與選擇的激發(fā)波長(zhǎng)一致，本實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果以一組激發(fā)光的反射光為例，反射光通道采用561nm處激發(fā)光，561nm處檢測(cè)其反射光，偽彩色選擇綠色，采集nano-HA-Gd納米顆粒的反射光圖像；2.2、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：針對(duì)活細(xì)胞樣品可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨時(shí)進(jìn)行CLSM檢測(cè)，觀察孵育不同時(shí)間顆粒聚集狀態(tài)、被攝取的程度、顆粒的位置、細(xì)胞狀態(tài)；2.3、三維成像：實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的同時(shí)可以采集延z軸或y軸采集各個(gè)細(xì)胞層的圖像，通過軟件，合成三維立體圖像。3、檢測(cè)結(jié)果：圖6為nano-HA-Gd與BMSCs共培養(yǎng)一定時(shí)間后，經(jīng)細(xì)胞固定、細(xì)胞微絲和細(xì)胞核熒光標(biāo)記后，利用CLSM進(jìn)行平面成像，其中：(b)是(a)的局部放大圖像，(c)是(b)的xzy縱切圖像。如圖所示反射光通道能夠結(jié)合細(xì)胞微絲和細(xì)胞核的熒光通道共同定位nano-HA-Gd顆粒清晰的出現(xiàn)在交錯(cuò)的細(xì)胞微絲骨架間，細(xì)胞核中沒有顆粒存在。在xzy縱切圖中反射光通道仍然能夠結(jié)合細(xì)胞微絲和細(xì)胞核的熒光通道共同定位nano-HA-Gd存在細(xì)胞質(zhì)中。圖7為CLSM下延z軸連續(xù)掃描各層細(xì)胞樣品的圖像，其中：(a)Rhodaminephalloidin通道，(b)Hoechst33258通道，(c)反射光通道，(d)a，b，c的疊加圖。如圖所示，反射光通道和熒光通道在樣品延Z軸各層面的橫切圖像中均能清晰的成像，并且反射光通道能夠結(jié)合細(xì)胞各部分的熒光通道共同定位nano-HA-Gd顆粒清晰的出現(xiàn)在交錯(cuò)的細(xì)胞微絲骨架間。這些切面可以組合成三維立體圖像，用于nano-HA-Gd顆粒在細(xì)胞中的空間定位。實(shí)施例10：與細(xì)胞共培養(yǎng)的nano-HA-Gd-FITC用CLSM檢測(cè)，其中細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分別用熒光探針標(biāo)記。1、準(zhǔn)備待測(cè)樣品：1.1、活細(xì)胞熒光標(biāo)記方法一：細(xì)胞種在CLSM玻璃皿中貼壁后，先將細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核用熒光探針標(biāo)記，具體步驟為：小心吸走培養(yǎng)液，在細(xì)胞樣品上均勻滴加200ulHoechst33342(4μg/ml)，并在37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育60min，小心吸走上述染色液并均勻滴加200ulCMTMR(2μmol/ml)，同樣條件孵育30min后，PBS緩沖液小心沖洗細(xì)胞2遍，加入含有100μg/cm2的nano-HA-Gd-FITC的完全培養(yǎng)基，避光，在孵育箱培養(yǎng)，可隨時(shí)取出進(jìn)行CLSM檢測(cè)；1.2、活細(xì)胞熒光標(biāo)記方法二：nano-HA-Gd-FITC與細(xì)胞共培養(yǎng)一定時(shí)間后，先加入nano-HA-Gd-FITC，避光，在孵育箱培養(yǎng)，可隨時(shí)取出，按照方案一的方法給細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核用熒光探針標(biāo)記，進(jìn)行CLSM檢測(cè)；1.3、固定后的細(xì)胞熒光標(biāo)記：nano-HA-Gd-FITC與細(xì)胞共培養(yǎng)一定時(shí)間后，棄去培養(yǎng)液，用37℃的PBS洗玻片2次；4%甲醛固定液固定細(xì)胞15分鐘，PBS洗2次；加-20℃丙酮覆蓋全部細(xì)胞，-20℃冰箱放置5分鐘，PBS洗三次；每個(gè)樣品加Rhodaminephalloidin（羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽）應(yīng)用液200ul，室溫放置20分鐘，PBS洗三次。載玻片標(biāo)記后，中間位置加一滴封片液，蓋玻片有細(xì)胞的一側(cè)朝下，蓋在載玻片的封片液上，注意不能有氣泡。若為共聚焦小皿，可用PBS覆蓋細(xì)胞樣品。每個(gè)樣品加Hoechst33258應(yīng)用液200ul，37℃孵育30分鐘，PBS洗三次，進(jìn)行CLSM檢測(cè)。2、針對(duì)上述待測(cè)樣品CLSM檢測(cè)圖像采集項(xiàng)目：2.1、采集條件：激發(fā)光波長(zhǎng)可設(shè)置為200nm至1050nm的任何一個(gè)或者幾個(gè)波長(zhǎng)（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一個(gè)或幾個(gè)的組合），其中應(yīng)包括FITC、Rhodaminephalloidin和Hoechst33258/Hoechst33342的激發(fā)波長(zhǎng)，采集相應(yīng)的反射光和熒光.，使用任意偽彩色成像。針對(duì)1.1和1.2的細(xì)胞樣品，發(fā)射光波長(zhǎng)選擇570~650nm，偽彩色選擇紅色，采集細(xì)胞質(zhì)CMTMR熒光圖像；發(fā)射光波長(zhǎng)選擇400~480nm，偽彩色選擇藍(lán)色，采集細(xì)胞核區(qū)的Hoechst33342熒光圖像；選擇200nm至1050nm范圍內(nèi)的任意一種波長(zhǎng)（例如361nm，364nm，405nm，458nm，488nm，514nm，543nm，561nm和633nm中的任意一個(gè)或幾個(gè)的組合），發(fā)射波長(zhǎng)與選擇的激發(fā)波長(zhǎng)一致，本實(shí)施例的檢測(cè)結(jié)果以一組激發(fā)光的反射光為例，反射光通道采用561nm處激發(fā)光，561nm處檢測(cè)其反射光，偽彩色選擇綠色，采集nano-HA-Gd納米顆粒的反射光圖像；選擇488nm激發(fā)光，發(fā)射光波長(zhǎng)選擇500~547nm，偽彩色選擇綠色，采集nano-HA-Gd-FITC的FITC熒光圖像；2.2、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：針對(duì)活細(xì)胞樣品可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨時(shí)進(jìn)行CLSM檢測(cè)，觀察孵育不同時(shí)間顆粒聚集狀態(tài)、被攝取的程度、顆粒的位置、細(xì)胞狀態(tài)；2.3、三維成像：實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的同時(shí)可以采集延z軸或y軸采集各個(gè)細(xì)胞層的圖像，通過軟件，合成三維立體圖像。3、檢測(cè)結(jié)果。圖8為nano-HA-Gd-FITC與BMSCs共培養(yǎng)一定時(shí)間后，對(duì)活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用CLSM進(jìn)行成像，其中：(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c)反射光通道，(d)FITC通道，（e）a，b，c，d的疊加圖。II為I的xzy縱切圖像。如圖所示反射光通道能夠結(jié)合細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的熒光通道共同定位nano-HA-Gd-FITC顆粒，nano-HA-Gd-FITC顆粒以微米級(jí)別的球形聚集體存在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核周圍。在xzy縱切圖中反射光通道仍然能夠結(jié)合細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的熒光通道共同定位nano-HA-Gd-FITC。圖9nano-HA-Gd-FITC與BMSCs共培養(yǎng)一定時(shí)間后，對(duì)活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用CLSM延z軸連續(xù)掃描各層細(xì)胞樣品的圖像，其中：(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c)反射光通道，(d)FITC通道，（e）a，b，c，d的疊加圖。如圖所示，反射光通道和熒光通道在樣品延Z軸各層面的橫切圖像中均能清晰的成像，并且反射光通道能夠結(jié)合細(xì)胞各部分的熒光通道共同定位nano-HA-Gd-FITC顆粒，nano-HA-Gd-FITC顆粒以微米級(jí)別的球形聚集體存在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核周圍。這些切面可以組合成三維立體圖像，用于nano-HA-Gd-FITC顆粒在細(xì)胞中的空間定位。4、光漂白實(shí)驗(yàn)。光漂白現(xiàn)象是熒光標(biāo)記物的一個(gè)不可避免的缺陷，因此不能用于在CLSM下用激光連續(xù)的、長(zhǎng)時(shí)間照射，不利于追蹤定位熒光顆粒。但是根據(jù)反射光技術(shù)的成像原理，反射光信號(hào)具有很好的光穩(wěn)定性。操作步驟：按照2.1的檢測(cè)條件對(duì)1.1的細(xì)胞樣品成像，圈定細(xì)胞樣品中某一區(qū)域(Aspecificregionofinterest，ROI)提高檢測(cè)的激發(fā)光波長(zhǎng)的強(qiáng)度，連續(xù)照射ROI160s并實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)光強(qiáng)度的變化并拍照，并用CLSM的FITC通道、反射光通道、CMTMR通道、Hoechst33342通道同時(shí)成像并記錄光強(qiáng)度。圖10至圖12為本實(shí)施例反射光信號(hào)和熒光信號(hào)光穩(wěn)定性的對(duì)比。圖10為光漂白前后各個(gè)通道圖像；圖11為光漂白區(qū)域的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)圖像；圖12為光漂白區(qū)域的各通道光強(qiáng)度的定量曲線，(a)CMTMR通道，(b)Hoechst33342通道，(c)反射光通道，(d)FITC通道。如圖所示，在連續(xù)照射選定區(qū)域后，標(biāo)記在細(xì)胞上的熒光探針CMTMR，Hoechst33342和顆粒物表面的FITC的熒光強(qiáng)度明顯減弱，而反射光采集的圖像仍然很清晰地呈現(xiàn)顆粒的形態(tài)，強(qiáng)度幾乎不改變。標(biāo)準(zhǔn)化的熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線圖中定量體現(xiàn)了上述趨勢(shì)，在160s激光連續(xù)照射后，三組熒光強(qiáng)度下降了70%，而反射光強(qiáng)度僅下降了不到5%?？傊瓷涔庑盘?hào)強(qiáng)度不受連續(xù)激光照射的影響，說明了其具有非常好的光穩(wěn)定性。雖然以上實(shí)施例中，用激光照射待測(cè)樣品時(shí)，使用的激光的波長(zhǎng)為405nm，488nm，514nm，543nm，561nm或633nm，但不限于此，其他波長(zhǎng)的激光也可作為本發(fā)明激光照射的光源。雖然以上實(shí)施例中，僅公開了帶有異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的含釓羥基磷灰石納米顆粒，但不限于此，也可選用其他熒光標(biāo)記，例如Alex系列熒光探針或者羅丹明類熒光探針等。雖然以上實(shí)施例中，僅公開了用Hoechst33324和Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞核，但不限于此，也可選用其他熒光標(biāo)記。雖然以上實(shí)施例中，僅公開了用CMTMR標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)，但不限于此，也可選用其他熒光標(biāo)記。雖然以上實(shí)施例中，僅公開了用Rhodaminephalloidin標(biāo)記細(xì)胞微絲，但不限于此，也可選用其他熒光標(biāo)記。雖然以上實(shí)施例中，僅公開了對(duì)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、和細(xì)胞微絲熒光標(biāo)記，但不限于此，也可對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞器進(jìn)行熒光標(biāo)記。在本文中，“示意性”表示“充當(dāng)實(shí)例、例子或說明”，不應(yīng)將在本文中被描述為“示意性”的任何實(shí)施方式解釋為一種更優(yōu)選的或更具優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)方案。在本文中，“相等”、“相同”等并非嚴(yán)格的數(shù)學(xué)和/或幾何學(xué)意義上的限制，還包含本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的且生產(chǎn)或使用等允許的誤差。除非另有說明，本文中的數(shù)值范圍不僅包括其兩個(gè)端點(diǎn)內(nèi)的整個(gè)范圍，也包括含于其中的若干子范圍。應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書是按照各個(gè)實(shí)施例描述的，但并非每個(gè)實(shí)施例僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。上文所列出的一系列的詳細(xì)說明僅僅是針對(duì)本發(fā)明的可行性實(shí)施例的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實(shí)施方案或變更，如特征的組合、分割或重復(fù)，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3