山莨菪根的hplc指紋圖譜檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了山莨菪根的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法。本發(fā)明檢測(cè)方法中，各批山莨菪根樣品的指紋圖譜具有相似性，主要峰群的整體面貌基本一致，僅各成分的峰面積有較大差異，這與產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境等因素有關(guān)。試驗(yàn)表明，運(yùn)用本發(fā)明指紋圖譜技術(shù)，能綜合、全面地判別藥材的品質(zhì)，因此，可作為山莨菪根的鑒別和質(zhì)量檢測(cè)的一種手段。
【專利說(shuō)明】山莨菪根的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及山莨菪根的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 山莨菪Anisodus tanguticus(Maxim. )Pascher為爺科山莨菪屬植物，是中國(guó)特有 植物，野生分布于海拔2 800?4 200m的山坡及草坡陽(yáng)處，目前尚有少量栽培。四川甘孜 州和阿壩州的野生山莨菪資源極為豐富，藏醫(yī)常以種子和根入藥，其根的藏藥名為"唐沖那 保"或"唐沖納波"，已收入2014年版《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》，具有止痛解痙、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)驚、止咳 平喘等功效。現(xiàn)代研究表明，山莨菪根主要含莨菪烷類生物堿，如樟柳堿、山莨菪堿、東莨菪 堿、阿托品等，具有調(diào)節(jié)植物神經(jīng)功能紊亂，興奮循環(huán)和呼吸中樞，調(diào)節(jié)免疫功能，解除平滑 肌痙攣，封閉Μ和α受體，活化β受體，活躍和疏通微循環(huán)，增強(qiáng)人工膜的流動(dòng)性等藥理活 性。
[0003] 前期研究發(fā)現(xiàn)，由于受產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境等的影響，不同來(lái)源的山莨菪根的生物堿類 成分含量差異較大，目前尚未見國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道該藥材的高效液相色譜指紋圖譜，因此本 發(fā)明將采用HPLC-DAD進(jìn)行山莨菪根的指紋圖譜研究，并對(duì)不同產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境的山莨菪根 進(jìn)行比較，為其鑒別與質(zhì)量控制提供依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供對(duì)山莨菪根品質(zhì)的鑒別方法。
[0005] 具體地，本發(fā)明提供了山莨菪根的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，它包括如下操作步 驟：
[0006] (1)供試品溶液的制備：取待檢藥材，粉碎后，以甲醇提取，提取液過濾，制備供試 品溶液；
[0007] (2)將供試品溶液注入高效液相色譜儀中，在如下色譜條件下檢測(cè)即可：
[0008] 色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：210±3nm ;流速0· 8?1. 2mL/min ;柱溫 30±5°C ;
[0009] 流動(dòng)相：A(乙腈）一B(10mmol/L ΚΗ2Ρ04 緩沖液，用 Η3Ρ04調(diào)節(jié)pH至 2. 5 ?4. 0),流 動(dòng)相六的濃度變化為：0?5111丨11，10%;5?40111丨11，10%?25% ;40?41111丨11，25%?90%; 41 ?50min，90%?90% ;50 ?55min，90%?10% ;55 ?60min，10%?10%。
[0010] 進(jìn)一步地，所述色譜柱尺寸為5 μ m, 4. 6 X 250mm。
[0011] 更進(jìn)一步地，所述色譜柱為Ultimate AQ C18柱。
[0012] 進(jìn)一步地，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。
[0013] 進(jìn)一步地，流速為1. OmL/min。
[0014] 進(jìn)一步地，：柱溫為30°C。
[0015] 進(jìn)一步地，步驟（1)中，提取方法為回流、浸漬或超聲。
[0016] 進(jìn)一步地，將供試品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，相似度為0. 850的藥材即 為山莨菪根；所述對(duì)照指紋圖譜中有15個(gè)共有峰，以阿托品為對(duì)照，各共有峰的相對(duì)保留 時(shí)間為：峰 1 :〇· 281，峰 2 :0· 336,峰 3 :0· 353,峰 4 :0· 413,峰 5 :0· 493,峰 6 :0· 576,峰 7 : 0· 613,峰 8 :0· 724,峰 9 :0· 793,峰 10 :0· 897,峰 11 :1· 000,峰 12 :1· 235,峰 13 :1· 346,峰 4 :1· 439,峰 15 :1· 569。
[0017] 進(jìn)一步地，所述對(duì)照指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)峰面積為：峰1 :0. 205?9. 169、 峰 2 :0· 059 ?4. 681、峰 3 :0· 033 ?2. 253、峰 4 :0· 017 ?1. 991、峰 5 :0· 047 ?30. 551、 峰 6 :1· 673 ?123. 29、峰 7 :0· 505 ?39. 002、峰 8 :0· 076 ?1. 637、峰 9 :0· 158 ?15. 372、 峰 10 :0· 247 ?17. 305、峰 11 :1· 000、峰 12 :0· 427 ?11. 843、峰 13 :0· 016 ?2. 53、峰 14 : 0· 02 ?0· 474、峰 15 :0· 005 ?0· 925。
[0018] 優(yōu)選地，所述對(duì)照指紋圖譜如圖1所示。
[0019] 本發(fā)明檢測(cè)方法中，各批山莨菪根樣品的指紋圖譜具有相似性，主要峰群的整體 面貌基本一致，僅各成分的峰面積有較大差異，這與產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境等因素有關(guān)。試驗(yàn)表明， 運(yùn)用本發(fā)明指紋圖譜技術(shù)，能綜合、全面地判別藥材的品質(zhì)，因此，可作為山莨菪根的鑒別 和質(zhì)量檢測(cè)的一種手段。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1山莨菪根的HPLC對(duì)照指紋圖譜
[0021] 圖2對(duì)照品（A)和樣品（B)的HPLC色譜圖（2.樟柳堿a.東莨菪堿8.山莨菪堿 11.阿托品）
[0022] 圖318批山莨菪根HPLC指紋圖譜
[0023] 圖44種生物堿的紫外光譜掃描圖
[0024] 圖5樣品的3D紫外光譜掃描圖
[0025] 圖6不同流動(dòng)相的比較[A為乙腈-水，B為乙腈-KH2P04 (10mm0l/L，用Η3Ρ04調(diào)節(jié) pH = 3. 0)]
[0026] 圖7色譜適應(yīng)性考察

【具體實(shí)施方式】 [0027] 儀器與材料
[0028] SHIMADZU LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）， Sartorius BP211D十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius公司），METTLER AE240萬(wàn)分之 一分析天平（瑞士 Mettler公司），KQ5200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）， Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher 公司），水由Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)制得，其他試劑試藥為分析純。對(duì)照品氫溴 酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿和硫酸阿托品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所 (批號(hào)分別為：100399-200601，100049-201009,100051-201105,100399-200601)。
[0029] 實(shí)施例1本發(fā)明檢測(cè)方法
[0030] 供試品溶液的制備：取待檢藥材粉末（過三號(hào)篩）約〇.5g，精密稱定，置具塞錐形 瓶中，加入10mL甲醇，密塞，稱定重量，超聲（功率300W，頻率50kHz) 30min，放冷，再稱定重 量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0031] 將供試品溶液注入液相色譜儀中，檢測(cè)后，所得供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜 比對(duì)，相似度在0. 850以上，即為山莨菪根。
[0032] 色譜條件如下：
[0033] 色譜柱為 Ultimate AQ C18(5 μ m, 4· 6X 250mm)，流動(dòng)相為 A (乙腈）一B (10mmol/L KH2P04緩沖液，用H3P0 4調(diào)節(jié)pH至3· 0)，流動(dòng)相A的濃度變化為：0?5min，10% ;5?40min， 10%?25%;40 ?41min,25%?90%;41 ?50min,90%?90%;50 ?55min,90%?10%; 55 ?60min，10%?10%。流速 LOmL/min ;柱溫 30°C ;檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm;進(jìn)樣量 10yL。
[0034] 對(duì)照指紋圖譜見圖1。
[0035] 實(shí)施例2方法學(xué)考察
[0036] 1 材料
[0037] 實(shí)驗(yàn)所用山莨菪根樣品來(lái)源見表1，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院馬逾英教授鑒定，均 為爺科植物山直菪 Anisodus tanguticus (Maxim. )Pascher 的根。
[0038] 表1 18批山莨菪根樣品信息
[0039] 編號(hào) 產(chǎn)地 經(jīng)煒度/(N，E) 海拔/(m) 采收時(shí)間 -- 四川甘孜州德格縣錯(cuò)阿鄉(xiāng) (31°4848.76'99°2512.84") 3 715 2013.08 52 四川甘孜州德格縣柯洛洞鄉(xiāng) （31。58,24.29〃,98。40, 59.36〃） 3 600 2013.07 53 四川甘孜州德格縣馬尼干戈鄉(xiāng) （31。5539.78〃,99。12"7.85〃） 3 867 2013.07 54 四川甘孜州石渠縣蒙宜鄉(xiāng) （33。01，17.07'98。09，18.10) 4 106 2013.06 55 四川甘孜州石渠縣蒙沙鄉(xiāng) （33。01，55.02'98。16,7.93") 4 151 2013,06 56 四川甘孜州白玉縣安孜鄉(xiāng) （31。07,27.37'99。21，53.85") 3 899 2013.06 57 四川甘孜州理塘縣喇嘛埡鄉(xiāng) （29。49, 52.30'99。49，15.05〃） 3 947 2013.07 58 四川甘孜州理塘縣章納鄉(xiāng) （29。44,49.30'99。48,2.41〃） 3 623 2013.07 59 四川甘孜州理塘縣村戈鄉(xiāng) （29。5917.19'100。13，16.74") 3 959 2013.07 510 四川 〇1 孜州理塘縣禾尼鄉(xiāng) （30°13'19.10'99°49'21.77") 4 181 2013.07 511 四川甘孜州爐霍縣新都鎮(zhèn) （31。23'37.27", 100。40'49.06"：) 3 220 2013.07 512 叫川甘孜州爐霍縣上羅柯馬鄉(xiāng) （31。34'58.40", 100。45'16.33") 3 620 2013.07 513 四川甘孜州色達(dá)縣旭日鄉(xiāng) （31。59,29.78〃，100。40,49.54") 3 473 2013.07 514 四川甘孜州色達(dá)縣霍西鄉(xiāng) （32。01，29.42〃，100。30,51.42") 3 655 2013.07 515 四川甘孜州康定縣塔公鄉(xiāng) （30。19,9.12'10Ρ3Γ22.83， 3 736 2013.07 516 四川阿壩州阿壩縣洛爾達(dá)鄉(xiāng) （32。49,23.34\ 101°50,57.5Γ) 3 259 2013.08 517 四川阿壩州若爾蓋縣唐克鄉(xiāng) （33。24'38.00"，102。28'3.44") 3 440 2013.08 518 四川阿壩州紅原縣阿木鄉(xiāng) （32。54'57.98〃，丨02。38，丨2.丨4") 3 487 2013.08
[0040] 2方法與結(jié)果
[0041] 2.1色譜條件
[0042] 色譜柱為 Ultimate AQ C18(5 μ m, 4· 6Χ 250mm)，流動(dòng)相為 Α (乙腈）一B (10mmol/L KH2P04緩沖液，用H3P0 4調(diào)節(jié)pH至3· 0)，流動(dòng)相A的濃度變化為：0?5min，10% ;5?40min， 10%?25%;40 ?41min,25%?90%;41 ?50min,90%?90%;50 ?55min,90%?10%; 55 ?60min，10%?10%。流速 L0mL/min ;柱溫 30°C ;檢測(cè)波長(zhǎng) 210nm;進(jìn)樣量 10yL。
[0043] 2. 2對(duì)照品溶液的制備
[0044] 取氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪堿、氫溴酸山莨菪堿和硫酸阿托品對(duì)照品各適量， 精密稱定，分別加甲醇溶解制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品貯備溶液。精密量取上述各對(duì)照品 貯備溶液適量至同一量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得氫溴酸樟柳堿、氫溴酸東莨菪 堿、氫溴酸山莨菪堿和硫酸阿托品的質(zhì)量濃度均約為〇. lmg/mL的混合對(duì)照品溶液。
[0045] 2. 3供試品溶液的制備
[0046] 取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入10mL甲醇，密 塞，稱定重量，超聲（功率300W，頻率50kHz) 30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重 量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
[0047] 2. 4方法學(xué)考察
[0048] 2. 4. 1精密度試驗(yàn)
[0049] 取同一供試品溶液（S12)，按"2. 1"項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，測(cè)得 各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，計(jì)算出RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。
[0050] 2. 4. 2重復(fù)性試驗(yàn)
[0051] 取同一批（S12)山莨菪根樣品，共6份，精密稱定，按"2.3"項(xiàng)下方法制備供試品 溶液，按"2. 1"項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和 相對(duì)峰面積，計(jì)算出RSD均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。
[0052] 2. 4. 3穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0053] 取同一供試品溶液（S12)，按"2. 1"項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、6、8和24h進(jìn)樣 分析，記錄色譜圖，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，計(jì)算出RSD均小于2%，表 明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0054] 2. 5樣品測(cè)定
[0055] 各批樣品按照"2. 3"項(xiàng)下制備供試品溶液，按照"2. 1"項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析， 記錄40min的色譜圖。
[0056] 2. 6特征指紋圖譜的建立
[0057] 2. 6. 1色譜峰的指認(rèn)
[0058] 通過對(duì)對(duì)照品和樣品的色譜圖和紫外光譜進(jìn)行比對(duì)，對(duì)樣品中的色譜峰進(jìn)行確 認(rèn)，指認(rèn)了 4個(gè)色譜峰（樟柳堿、東莨菪堿、山莨菪堿和阿托品），結(jié)果見圖2。
[0059] 2. 6. 2參照色譜峰的選擇
[0060] 在18批野生山莨菪根樣品色譜圖中，樟柳堿、東莨菪堿、山莨菪堿和阿托品的含 量在不同批次之間都存在較大的差異，并且東莨菪堿在有些批次樣品中含量太少，未能檢 出，因而沒有選其作共有峰。根據(jù)其余三個(gè)對(duì)照品在不同批次之間的含量差異、出峰時(shí)間和 分離度，最后選擇阿托品作為參照色譜峰（圖1中的11號(hào)峰）。
[0061] 2. 6. 3對(duì)照指紋圖譜的建立
[0062] 將18批山莨菪根樣品色譜圖導(dǎo)入"中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（版本： 2012. 130723) "軟件，以12號(hào)樣品為參照?qǐng)D譜，圖譜生成方法設(shè)為中位數(shù)，時(shí)間窗設(shè)為 0. 5min。通過多點(diǎn)校正，分析尋找共有峰，建立了具有15個(gè)共有峰的對(duì)照指紋圖譜（其中 2號(hào)峰為樟柳堿，8號(hào)峰為山莨菪堿，11號(hào)峰位阿托品），結(jié)果見圖1和圖3。15個(gè)共有峰的 出峰時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間見表2。18批山莨菪根的15個(gè)共有峰面積見表3。
[0063] 表2共有峰的出峰時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 山莨菪根的HPLC指紋圖譜檢測(cè)方法，其特征在于：它包括如下操作步驟： (1) 供試品溶液的制備：取待檢藥材，粉碎后，以甲醇提取，提取液過濾，制備供試品溶 液； (2) 將供試品溶液注入高效液相色譜儀中，在如下色譜條件下檢測(cè)即可： 色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：210±3nm ;流速0. 8?1. 2mL/min ;柱溫 30±5°C ; 流動(dòng)相：A (乙腈）一 B (10mm〇l/L ΚΗ2Ρ04緩沖液，用Η3Ρ04調(diào)節(jié)pH至2. 5?4. 0)，梯度洗 脫程序?yàn)椋憨?5111；[11，10(%;5?4〇111；[11，10(%?25(%;40?41111；[11，25 (%?90(%;41?5〇111；[11， 90%?90% ;50 ?55min,90%?10% ;55 ?60min, 10%?10%。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述色譜柱尺寸為5 μ m，4. 6 X 250mm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述色譜柱為Ultimate AQ C18柱。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：流速為1. OmL/min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：柱溫為30°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，提取方法為回流、浸漬或超 聲。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：將供試品色譜圖與對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行對(duì) t匕，相似度大于〇. 850的藥材即為山莨菪根；所述對(duì)照指紋圖譜中有15個(gè)共有峰，以阿托品 為對(duì)照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間為：峰1 :〇. 281，峰2 :0. 336,峰3 :0. 353,峰4 :0. 413,峰 5 :0· 493,峰 6 :0· 576,峰 7 :0· 613,峰 8 :0· 724,峰 9 :0· 793,峰 10 :0· 897,峰 11 :L 000,峰 12 :1· 235,峰 13 :1· 346,峰 4 :1· 439,峰 15 :1· 569。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：所述對(duì)照指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)峰 面積為：峰 1 :〇· 205 ?9. 169、峰 2 :0· 059 ?4. 681、峰 3 :0· 033 ?2. 253、峰 4 :0· 017 ? 1. 991、峰 5 :0· 047 ?30. 551、峰 6 :1· 673 ?123. 29、峰 7 :0· 505 ?39. 002、峰 8 :0· 076 ? 1.637、峰 9 :0· 158 ?15. 372、峰 10 :0.247 ?17. 305、峰 11 :1· 000、峰 12 :0.427 ?11. 843、 峰 13 :0· 016 ?2. 53、峰 14 :0· 02 ?0· 474、峰 15 :0· 005 ?0· 925。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述對(duì)照指紋圖譜如圖1所示。
【文檔編號(hào)】G01N30/86GK104215717SQ201410484686
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】馬逾英, 蔣運(yùn)斌, 茍琰, 袁茂華 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)