一種綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，利用Paraflim膜，采取膜夾營養(yǎng)法提取綠盲蝽唾液酶，并測定綠盲蝽中蛋白酶與纖維素酶的活性，Paraflim膜法提取綠盲蝽唾液酶利用Paraflim膜、膠卷盒、紗布、橡皮筋、位于兩層Paraflim膜間的液體營養(yǎng)介質(zhì)，利用酶與底物反應的原理，測定綠盲蝽唾液中蛋白酶、纖維素酶的活性。本方法材料易得，操作簡單方便，制作成本低，占空間小，可實現(xiàn)綠盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且綠盲蝽可繼續(xù)回收利用。
【專利說明】一種綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物保護領(lǐng)域，尤其涉及一種綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]綠盲蝽是棉田的一種間歇性害蟲，主要以刺吸式口器刺吸為害植物柔嫩組織，形成孔洞，造成“破葉瘋”。隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的大面積推廣種植，以及棉田用藥量的減少，導致轉(zhuǎn)基因棉田的“非靶標害蟲”-綠盲蝽大爆發(fā)，并且，逐漸從棉田繼續(xù)向其他寄主遷移，威脅到了葡萄、蘋果樹、桃樹、櫻桃、梨樹等果樹的生長，成為多種植物的新蟲害。
[0003]綠盲蝽不同于蚜蟲、粉虱等汁液取食者，它主要取食植物細胞的細胞質(zhì)和細胞核，屬于細胞取食者。取食時，先將口針插入植物細胞內(nèi)或細胞間，然后通過口針的劇烈活動撕碎植物細胞同時分泌唾液，將要取食的食物變成泥漿狀，再進行吸食。昆蟲的唾液成分是昆蟲與植物相互關(guān)系中起聯(lián)系作用的紐帶，因為昆蟲取食植物過程中，除咬食或刺探所造成的損傷外，唾液是昆蟲對植物施加影響的主要因素。植食性昆蟲唾液中含有的酶類和各種有機成分，能誘導植物的一系列生化反應。研究綠盲蝽的唾液消化酶種類并測定其含量，可以一定程度揭示綠盲蝽刺吸危害爆發(fā)成災的原因，為綠盲蝽的持續(xù)控制提供科學依據(jù)。
[0004]綠盲蝽相較于蚜蟲或者煙粉虱個體較大，活動能力較強，簡單易操作的唾液酶體外提取方法較少。目前，綠盲蝽唾液酶體外提取方式一般為切頭處理，加入乙酸-乙酸鈉緩沖液在研缽內(nèi)對其進行低溫研磨，離心機低溫離心，取上清以待測定其唾液酶種類及含量。該方法操作相對繁瑣，需要的蟲量較大，對環(huán)境條件要求嚴格，條件不易控制，操作不當對于結(jié)果有較大影響。
[0005]鑒于上述缺陷，本發(fā)明創(chuàng)作者經(jīng)過長時間的研究和實踐終于獲得了本創(chuàng)作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，用以克服上述技術(shù)缺陷。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，該具體過程為:
[0008]步驟a，提取綠盲蝽唾液酶；
[0009]取3齡綠盲蝽10頭，饑餓6h后，置于兩端開口的膠卷盒內(nèi)，頂端覆以兩層Parafl im膜，并在兩膜間的間隙內(nèi)用移液槍加入100 μ L液體營養(yǎng)介質(zhì)，底端覆以紗布保持通氣，重復10次；
[0010]將裝置放入光照培養(yǎng)箱中，待綠盲蝽刺吸取食6h后，移走綠盲蝽，用移液槍收集其唾液混合物，放入1.5mL離心管中，同時，設(shè)不加綠盲蝽的對照；
[0011]步驟b，蛋白酶活性測定；[0012]步驟bl，制作標準曲線；
[0013]首先配制濃度為lmg/mL的酪氨酸標準溶液，測定時以蒸餾水稀釋至10、20、40、80,160,320和640 μ g/mL ;取8支1.5mL離心管編號，①管加50 μ L水，其余每管依次分別加入50 μ L濃度為10、20、40、80、160、320和640 μ g/mL的酪氨酸溶液；每管再各加入140 μ L(0.55mol/L)碳酸鈉溶液和20 μ L的Folin酚溶液，40°C下反應15min，利用分光光度計測定680nm處的OD值；
[0014]步驟b2，活性測定；
[0015]取20μ L待測酶混合液于1.5mL的離心管中，加入0.5%酪蛋白50yL，40°C下反應15min,再加入10 %三氯乙酸50 μ L于離心機在IOOOrpm, 4 V條件下離心20min,對照組加入20μ L不含酶的營養(yǎng)液，重復10次；取上清50μ LWAZOyL Folin酚和140 μ L0.55mol/L的碳酸鈉溶液，40°C下反應15min，于分光光度計680nm處測定兩組的OD值；
[0016]步驟C，纖維素酶活性測定；
[0017]步驟Cl，標準曲線制作；
[0018]葡萄糖溶液:用蒸餾水溶解27mg葡萄糖定容到25ml，取10支ImL的離心管編號，并按下表I所示加入各種試劑，于分光光度計490nm處測定其OD值；
[0019]步驟c2，活性測定；
[0020]取50 μ L待測酶混合液于1.5mL離心管中，加入200 μ L0.625%的羧甲基纖維素鈉溶液，再加入50 μ L NaoH(2mol/L)和100 μ L顯色劑DNS(3g/L)，以不含酶營養(yǎng)液為對照組調(diào)零，重復10次，于分光光度計490nm處測定其OD值。
[0021]進一步，在上述步驟a中，所述培養(yǎng)箱施以溫度為25°C ±1°C，光周期為16L: 8D。
[0022]進一步,在上述步驟a中,覆膜時,在頂端開口 2先覆一層足夠薄的Paraflim封口膜，用移液槍在膜上滴加100μ L的液體營養(yǎng)物質(zhì)，再覆以一層Paraflim封口膜，在盒身與膜接觸處壓緊貼合以防止液體營養(yǎng)介質(zhì)外漏流失，將饑餓過的綠盲蝽放入蟲室，迅速以紗布覆住底端開口，以保持通氣，用橡皮筋封住，以防止綠盲蝽逃逸。
[0023]進一步,在上述步驟a中，所述的液體營養(yǎng)介質(zhì)為20%鹿糖、100mmol/L絲氨酸、100mmol/L蛋氨酸、100mmol/L天冬氨酸；配制方法為準確稱取20g的鹿糖，1.05g的絲氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸餾水定容至100mL。食料滅菌后，置4°C冰箱中(不超過7天)。
[0024]進一步，在上述步驟a中，使用裝置的膠卷盒包括兩端開口，頂端開口以兩層Paraflim膜覆蓋，兩層膜間為液體營養(yǎng)介質(zhì)；膠卷盒瓶身為收集綠盲蝽的蟲室，底端開口以紗布覆蓋，并以橡皮筋固定。
[0025]進一步，所述膠卷盒外徑為3.2cm,內(nèi)徑為3.0cm ;膠卷盒材質(zhì)為硬質(zhì)塑料，高度為
5.0cm，壁厚為 0.1cm。
[0026]進一步,所述Paraflim封口膜為高彈性封口膜；所述的蟲室體積為113.0cm3。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比較本發(fā)明的有益效果在于:方法材料易得，操作簡單方便，制作成本低，占空間小，需要綠盲蝽數(shù)量少，可實現(xiàn)綠盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且綠盲蝽可繼續(xù)回收利用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明的唾液提取裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0029]以下結(jié)合附圖，對本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點作更詳細的說明。
[0030]請參閱圖1所示，其為本發(fā)明的唾液提取裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，所述裝置包括Paraflim封口膜1、頂端開口 2、蟲室3、底端開口 4、紗布5、橡皮筋6和液體營養(yǎng)介質(zhì)7，在本發(fā)明中，膠卷盒包括兩端開口，頂端開口 2以兩層Paraflim膜I覆蓋，兩層膜間為液體營養(yǎng)介質(zhì)；膠卷盒瓶身為收集綠盲蝽的蟲室3，底端開口 4以紗布5覆蓋，并以橡皮筋6固定。
[0031]所述的液體營養(yǎng)介質(zhì)為20 %鹿糖、100mmol/L絲氨酸、100mmol/L蛋氨酸、IOOmmoI/L天冬氨酸。配制方法為準確稱取20g的蔗糖，1.05g的絲氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸餾水定容至lOOmL。食料滅菌后，置4°C冰箱中(不超過7天)。
[0032]其中，膠卷盒外徑為3.2cm,內(nèi)徑為3.0cm ;膠卷盒材質(zhì)為硬質(zhì)塑料，高度為5.0cm,壁厚為0.1cm0
[0033]所述Paraflim封口膜2為高彈性封口膜。所述的蟲室3體積為113.0cm3。
[0034]該具體測定過程為:
[0035]步驟a，提取綠盲蝽唾液酶；
[0036]取3齡綠盲蝽10頭，饑餓6h后，置于兩端開口的膠卷盒內(nèi)，頂端覆以兩層Parafl im膜，并在兩膜間的間隙內(nèi)用移液槍加入100 μ L液體營養(yǎng)介質(zhì)，底端覆以紗布保持通氣。將裝置放入光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱施以溫度為25°C ±1°C，光周期為16L: 8D，待綠盲蝽刺吸取食6h后，移走綠盲蝽，用移液槍收集其唾液混合物，放入1.5mL離心管中。
[0037]在上述步驟a前，洗凈膠卷盒滅菌；覆膜時，在頂端開口 2先覆一層足夠薄的Parafl im封口膜，用移液槍在膜上滴加100 μ L的液體營養(yǎng)物質(zhì)，再覆以一層Parafl im封口膜，在盒身與膜接觸處壓緊貼合以防止液體營養(yǎng)介質(zhì)外漏流失，將饑餓過的綠盲蝽放入蟲室，迅速以紗布覆住底端開口，以保持通氣，用橡皮筋封住，以防止綠盲蝽逃逸。
[0038]步驟b，蛋白酶活性測定；
[0039]步驟bl，制作標準曲線；
[0040]首先配制濃度為lmg/mL的酪氨酸標準溶液，測定時以蒸餾水稀釋至10、20、40、80,160,320和640g/mL。取8支1.5mL離心管編號，①管加50 μ L水，其余每管依次分別加入50 μ L濃度為10、20、40、80、160、320和640 μ g/mL的酪氨酸溶液。每管再各加入140 μ L0.55mol/L的碳酸鈉溶液和20 μ L的Folin酚溶液，40°C下反應15min，利用分光光度計測定680nm處的OD值。
[0041]步驟b2，活性測定；
[0042]取20μ L待測酶混合液于1.5mL的離心管中，加入0.5%酪蛋白50yL，40°C下反應15min,再加入10 %三氯乙酸50 μ L,于IOOOrpm, 4°C的離心機條件下離心20min,對照組加入20 μ L不含酶的營養(yǎng)液，重復10次。取上清50 μ L加入20 μ L Folin酚和140 μ L0.55mol/L的碳酸鈉溶液，40°C下反應15min，利用分光光度計測定680nm處兩組實驗的OD值。
[0043]在40°C下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生I μ g麥芽糖，定義為I個淀粉酶活力單位。[0044]經(jīng)測定每頭綠盲蝽唾液中蛋白酶最終含量為:5.4?υ/μ g。
[0045]步驟c，纖維素酶活性測定；
[0046]步驟Cl，標準曲線制作；
[0047]葡萄糖溶液:用蒸餾水溶解27mg葡萄糖定容到25mL。取10支ImL的離心管編號，并按下表1所示加入各種試劑，利用分光光度計測定490nm處的OD值。
[0048]表1
【權(quán)利要求】
1.一種綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，其特征在于，該具體過程為: 步驟a，提取綠盲蝽唾液酶； 取3齡綠盲蝽10頭，饑餓6h后，置于兩端開口的膠卷盒內(nèi)，頂端覆以兩層Paraf Iim膜，并在兩膜間的間隙內(nèi)用移液槍加入IOOyL液體營養(yǎng)介質(zhì)，底端覆以紗布保持通氣，重復10次； 將裝置放入光照培養(yǎng)箱中，待綠盲蝽刺吸取食6h后，移走綠盲蝽，用移液槍收集其唾液混合物，放入1.5mL離心管中；于4°〇下，16000g/min離心30min，取上清，-20°C冰箱中備用； 步驟b，蛋白酶活性測定； 步驟bl，制作標準曲線； 首先配制濃度為lmg/mL的酪氨酸標準溶液，測定時以蒸餾水稀釋至10、20、40、80、160,320和640 μ g/mL ;取8支1.5mL離心管編號，①管加50 μ L水，其余每管依次分別加入50 μ L濃度為10、20、40、80、160、320和640 μ g/mL的酪氨酸溶液；每管再各加入140 μ L0.55mol/L的碳酸鈉溶液和20 μ L的Folin酚溶液，40°C下反應15min，利用分光光度計測定680nm處的OD值； 步驟b2，活性測定； 取20 μ L待 測酶混合液于1.5mL的離心管中，加入0.5 %酪蛋白50 μ L，40 V下反應15min,再加入10%三氯乙酸50 μ L于離心機在1000rpm, 4°C條件下離心20min,對照組加入20 μ L不含酶的營養(yǎng)液，重復10次；取上清50 μ L加入20 μ L Folin酚和140 μ L0.55mol/L的碳酸鈉溶液，40°C下反應15min,于分光光度計680nm處測兩組的OD值； 步驟C，纖維素酶活性測定； 步驟Cl，標準曲線制作； 葡萄糖溶液:用蒸餾水溶解27mg葡萄糖定容到25ml，取10支ImL的離心管編號，并按下表1所示加入各種試劑，于分光光度計490nm處測定其OD值； 步驟c2，活性測定； 取50 μ L待測酶混合液于1.5mL離心管中，加入200 μ L0.625 %的羧甲基纖維素鈉溶液，再加入50 μ L NaoH(2mol/L)和100 μ L顯色劑DNS (3g/L)，以不含酶營養(yǎng)液為對照組調(diào)零，重復10次，利用分光光度計測定490nm處的OD值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，其特征在于，在上述步驟a中，所述培養(yǎng)箱施以溫度為25°C ±1°C，光周期為16L: 8D。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，其特征在于，在上述步驟a中，覆膜時,在頂端開口 2先覆一層足夠薄的Paraflim封口膜，用移液槍在膜上滴加100 μ L的液體營養(yǎng)物質(zhì)，再覆以一層Paraflim封口膜，在盒身與膜接觸處壓緊貼合以防止液體營養(yǎng)介質(zhì)外漏流失，將饑餓過的綠盲蝽放入蟲室，迅速以紗布覆住底端開口，以保持通氣，用橡皮筋封住，以防止綠盲蝽逃逸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，其特征在于，在上述步驟a中，所述的液體營養(yǎng)介質(zhì)為20%鹿糖、100mmol/L絲氨酸、IOOmmol/L蛋氨酸、100mmol/L天冬氨酸；配制方法為準確稱取20g的蔗糖，1.05g的絲氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸餾水定容至IOOmL ;食料滅菌后，置4°C冰箱中，不超過7天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，其特征在于，在上述步驟a中，所述的膠卷盒兩端開口，頂端開口以兩層Paraflim膜覆蓋，兩層膜間為液體營養(yǎng)介質(zhì)；膠卷盒瓶身為收集綠盲蝽的蟲室，底端開口以紗布覆蓋，并以橡皮筋固定。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，其特征在于，所述膠卷盒外徑為3.2cm,內(nèi)徑為3.0cm ;膠卷盒材質(zhì)為硬質(zhì)塑料，高度為5.0cm,壁厚為0.1cm0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的綠盲蝽唾液酶中蛋白酶與纖維素酶的體外提取測定方法，其特征在于，所述Para`flim封口膜為高彈性封口膜；所述的蟲室體積為113.0cm3。
【文檔編號】G01N21/31GK103868869SQ201410116136
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】周洪旭, 譚秀梅, 許秀蘋, 王霞 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學