一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，利用Paraflim膜，采取膜夾營(yíng)養(yǎng)法提取綠盲蝽唾液酶，并測(cè)定綠盲蝽中果膠酶、淀粉酶活性，Paraflim膜法提取綠盲蝽唾液酶利用Paraflim膜、膠卷盒、紗布、橡皮筋、位于兩層Paraflim膜間的液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)，利用酶與底物反應(yīng)的原理，測(cè)定綠盲蝽唾液中果膠酶、淀粉酶活性。本方法材料易得，操作簡(jiǎn)單方便，制作成本低，占空間小，可實(shí)現(xiàn)綠盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且綠盲蝽可繼續(xù)回收利用。
【專利說明】一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]綠盲蝽是棉田的一種間歇性害蟲，主要以刺吸式口器刺吸為害植物柔嫩組織，形成孔洞，造成“破葉瘋”。隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的大面積推廣種植，以及棉田用藥量的減少，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因棉田的“非靶標(biāo)害蟲”-綠盲蝽大爆發(fā)，并且，逐漸從棉田繼續(xù)向其他寄主遷移，威脅到了葡萄、蘋果樹、桃樹、櫻桃、梨樹等果樹的生長(zhǎng)，成為多種植物的新蟲害。
[0003]綠盲蝽不同于蚜蟲、粉虱等汁液取食者，它主要取食植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，屬于細(xì)胞取食者。取食時(shí)，先將口針插入植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間，然后通過口針的劇烈活動(dòng)撕碎植物細(xì)胞同時(shí)分泌唾液，將要取食的食物變成泥漿狀，再進(jìn)行吸食。昆蟲的唾液成分是昆蟲與植物相互關(guān)系中起聯(lián)系作用的紐帶，因?yàn)槔ハx取食植物過程中，除咬食或刺探所造成的損傷外，唾液是昆蟲對(duì)植物施加影響的主要因素。植食性昆蟲唾液中含有的酶類和各種有機(jī)成分，能誘導(dǎo)植物的一系列生化反應(yīng)。研究綠盲蝽的唾液消化酶種類并測(cè)定其含量，可以一定程度揭示綠盲蝽刺吸危害爆發(fā)成災(zāi)的原因，為綠盲蝽的持續(xù)控制提供科學(xué)依據(jù)。
[0004]綠盲蝽相較于蚜蟲或者煙粉虱個(gè)體較大，活動(dòng)能力較強(qiáng)，簡(jiǎn)單易操作的唾液酶體外提取方法較少。目前，綠盲蝽唾液酶體外提取方式一般為切頭處理，加入乙酸-乙酸鈉緩沖液在研缽內(nèi)對(duì)其進(jìn)行低溫研磨，離心機(jī)低溫離心，取上清以待測(cè)定其唾液酶種類及含量。該方法操作相對(duì)繁瑣，需要的蟲量較大，對(duì)環(huán)境條件要求嚴(yán)格，條件不易控制，操作不當(dāng)對(duì)于結(jié)果有較大影響。
[0005]鑒于上述缺陷，本發(fā)明創(chuàng)作者經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的研究和實(shí)踐終于獲得了本創(chuàng)作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，用以克服上述技術(shù)缺陷。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，該具體過程為:
[0008]步驟a，提取綠盲蝽唾液酶；
[0009]取3齡綠盲蝽10頭，饑餓6h后，置于兩端開口的膠卷盒內(nèi)，頂端覆以兩層Parafl im膜，并在兩膜間的間隙內(nèi)用移液槍加入100 μ L液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)，底端覆以紗布保持通氣，重復(fù)10次；
[0010]將裝置放入光照培養(yǎng)箱中，待綠盲蝽刺吸取食6h后，移走綠盲蝽，用移液槍收集其唾液混合物，放入1.5mL離心管中，同時(shí)，設(shè)不加綠盲蝽的對(duì)照；
[0011]步驟b，測(cè)定綠盲蝽唾液酶中果膠酶活性；
[0012]步驟bl，制作lmg/mL D-半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；[0013]配制lmg/mL D-半乳糖醒酸的溶液,取10支離心管編號(hào),并按下表I加入各種試齊U，在沸水浴中加熱5min，冷卻后，在分光光度計(jì)540nm處以①號(hào)試管為標(biāo)準(zhǔn)空白樣測(cè)定其它試管內(nèi)溶液的OD值，利用回歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)；
[0014]步驟b2，活性測(cè)定；
[0015]取50 μ L待測(cè)酶混合液與100 μ L果膠溶液(5g/L)放入1.5mL離心管中，加入100 μ L的乙酸-乙酸鈉溶液(ΡΗ4.8,0.2mol/L)，進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)照組加入50 μ L不含消化酶的營(yíng)養(yǎng)液，沸水終止反應(yīng)；以不含消化酶的營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照；再取反應(yīng)液100 μ L加蒸餾水150 μ L和顯示劑DNS溶液(3g/L) 150 μ L，沸水浴5min，立即冷卻，以不含消化酶的營(yíng)養(yǎng)液空白調(diào)零，重復(fù)10次，在分光光度計(jì)540nm下測(cè)定待測(cè)酶混合液的OD值；
[0016]步驟C，淀粉酶活性測(cè)定；
[0017]步驟Cl，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018]首先配制濃度為5.0mg/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL，測(cè)定時(shí)分別稀釋至0.2,0.4、
0.6、0.8、1.0mg/mL ;依次取上述溶液40 μ L分別置于1.5mL離心管中，每管各加入40 μ L顯色劑DNS (3g/L),然后置于沸水浴5min,冰浴冷卻后再加入蒸懼水160 μ I,于分光光度計(jì)490nm處測(cè)OD值；
[0019]步驟c2，活性測(cè)定:
[0020]取20 μ L濃度為I %的淀粉溶液于1.5mL離心管中，加入20 μ L制備好的待測(cè)酶混合液，對(duì)照組加入20 μ L不含酶的營(yíng)養(yǎng)液，混合均勻，于29°C溫浴3min后，再加入40 μ L顯示劑DNS (3g/L)和160 μ L蒸餾水，于分光光度計(jì)490nm處分別測(cè)定兩組OD值，重復(fù)10次。
[0021]進(jìn)一步，在上述步驟a中，所述培養(yǎng)箱施以溫度為25°C ±1°C，光周期為16L: 8D。
[0022]進(jìn)一步,在上述步驟a中,覆膜時(shí),在頂端開口 2先覆一層足夠薄的Paraflim封口膜，用移液槍在膜上滴加ΙΟΟμ L的液體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，再覆以一層Paraflim封口膜，在盒身與膜接觸處壓緊貼合以防止液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)外漏流失，將饑餓過的綠盲蝽放入蟲室，迅速以紗布覆住底端開口，以保持通氣，用橡皮筋封住，以防止綠盲蝽逃逸。
[0023]進(jìn)一步,在上述步驟a中，所述的液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)為20%鹿糖、100mmol/L絲氨酸、100mmol/L蛋氨酸、100mmol/L天冬氨酸；配制方法為準(zhǔn)確稱取20g的鹿糖，1.05g的絲氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸餾水定容至100mL。食料滅菌后，置4°C冰箱中(不超過7天)。
[0024]進(jìn)一步，在上述步驟a中，使用裝置的膠卷盒包括兩端開口，頂端開口以兩層Paraflim膜覆蓋，兩層膜間為液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)；膠卷盒瓶身為收集綠盲蝽的蟲室，底端開口以紗布覆蓋，并以橡皮筋固定。
[0025]進(jìn)一步，在上述步驟b中，配制lmg/mL D-半乳糖醛酸的溶液，在10支離心管中加入D-半乳糖醛酸的量分別為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90mL。
[0026]進(jìn)一步，所述膠卷盒外徑為3.2cm,內(nèi)徑為3.0cm ;膠卷盒材質(zhì)為硬質(zhì)塑料，高度為
5.0cm，壁厚為 0.1cm。
[0027]進(jìn)一步,所述Paraflim封口膜為高彈性封口膜；所述的蟲室體積為113.0cm3。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比較本發(fā)明的有益效果在于:方法材料易得，操作簡(jiǎn)單方便，制作成本低，占空間小，需要綠盲蝽數(shù)量少，可實(shí)現(xiàn)綠盲蝽唾液酶的大量、批量提取，并且綠盲蝽可繼續(xù)回收利用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0029]圖1為本發(fā)明的唾液提取裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)作更詳細(xì)的說明。
[0031]請(qǐng)參閱圖1所示，其為本發(fā)明的唾液提取裝置的結(jié)構(gòu)示意圖，所述裝置包括Paraflim封口膜1、頂端開口 2、蟲室3、底端開口 4、紗布5、橡皮筋6和液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)7，在本發(fā)明中，膠卷盒包括兩端開口，頂端開口 2以兩層Paraflim膜I覆蓋，兩層膜間為液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)；膠卷盒瓶身為收集綠盲蝽的蟲室3，底端開口 4以紗布5覆蓋，并以橡皮筋6固定。
[0032]所述的液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)為20 %鹿糖、100mmol/L絲氨酸、100mmol/L蛋氨酸、IOOmmoI/L天冬氨酸。配制方法為準(zhǔn)確稱取20g的蔗糖，1.05g的絲氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸餾水定容至lOOmL。食料滅菌后，置4°C冰箱中(不超過7天)。
[0033]其中，膠卷盒外徑為3.2cm,內(nèi)徑為3.0cm ;膠卷盒材質(zhì)為硬質(zhì)塑料，高度為5.0cm,壁厚為0.1cm0
[0034]所述Paraflim封口膜2為高彈性封口膜。所述的蟲室3體積為113.0cm3。
[0035]該具體測(cè)定過程為:
[0036]步驟a，提取綠盲蝽唾液酶；
[0037]取3齡綠盲蝽10頭，饑餓6h后，置于兩端開口的膠卷盒內(nèi)，頂端覆以兩層Parafl im膜，并在兩膜間的間隙內(nèi)用移液槍加入100 μ L液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)，底端覆以紗布保持通氣。將裝置放入光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱施以溫度25°C，光周期16L: 8D，待綠盲蝽刺吸取食6h后，移走綠盲蝽，用移液槍收集其唾液混合物，放入1.5mL離心管中。
[0038]在上述步驟a前，洗凈膠卷盒滅菌；覆膜時(shí)，在頂端開口 2先覆一層足夠薄的Parafl im封口膜，用移液槍在膜上滴加100 μ L的液體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，再覆以一層Parafl im封口膜，在盒身與膜接觸處壓緊貼合以防止液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)外漏流失，將饑餓過的綠盲蝽放入蟲室，迅速以紗布覆住底端開口，以保持通氣，用橡皮筋封住，以防止綠盲蝽逃逸。
[0039]步驟b，測(cè)定綠盲蝽唾液酶中果膠酶活性；
[0040]步驟bl,制作lmg/mL D-半乳糖醒酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0041]配制lmg/mL D-半乳糖醛酸的溶液，取10支離心管編號(hào)，并按下表I所示加入各種試劑，在沸水浴中加熱5min，冷卻后，在分光光度計(jì)540nm處以①號(hào)試管為標(biāo)準(zhǔn)空白樣測(cè)定其它試管內(nèi)溶液的OD值，利用回歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。
[0042]表I
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一種綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，其特征在于，該具體過程為: 步驟a，提取綠盲蝽唾液酶； 取3齡綠盲蝽10頭，饑餓6h后，置于兩端開口的膠卷盒內(nèi)，頂端覆以兩層Parafl im膜，并在兩膜間的間隙內(nèi)用移液槍加入IOOyL液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)，底端覆以紗布保持通氣，重復(fù)10次； 將裝置放入光照培養(yǎng)箱中，待綠盲蝽刺吸取食6h后，移走綠盲蝽，用移液槍收集其唾液混合物，放入1.5mL離心管中；于4°C下，16000g/min離心30min，取上清，-20°C冰箱中備用； 步驟b，測(cè)定綠盲蝽唾液酶中果膠酶活性； 步驟bI,制作lmg/mL D-半乳糖醒酸標(biāo)準(zhǔn)曲線； 配制lmg/mL D-半乳糖醒酸的溶液,取10支離心管編號(hào),并按下表1加入各種試劑,在沸水浴中加熱5min,冷卻后,在分光光度計(jì)540nm處以①號(hào)試管為標(biāo)準(zhǔn)空白樣測(cè)定其它試管內(nèi)溶液的OD值，利用回歸分析求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)； 步驟b2，活性測(cè)定； 取50 μ L待測(cè)酶混合液與100 μ L果膠溶液(5g/L)放入1.5mL離心管中，加入100 μ L乙酸-乙酸鈉溶液(PH4.8,0.2mol/L)，進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)照組加入50 μ L不含消化酶的營(yíng)養(yǎng)液，沸水終止反應(yīng)；以不含消化酶的營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照；再取反應(yīng)液100 μ L加蒸餾水150 μ L和顯示劑DNS溶液(3g/L) 150 μ L，沸水浴5min，立即冷卻，以不含消化酶的營(yíng)養(yǎng)液空白調(diào)零，重復(fù)10次，在分光光度計(jì)540nm下測(cè)定待測(cè)酶混合液的OD值； 步驟c，淀粉酶活性測(cè)定； 步驟Cl，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線； 首先配制濃度為5.0mg/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL，測(cè)定時(shí)分別稀釋至0.2,0.4,0.6、0.8,1.0mg/mL ;依次取上述溶液40 μ L分別置于1.5mL離心管中，每管各加入40 μ L顯色劑DNS (3g/L)，然后置于沸水浴5min，冰浴冷卻后再加入蒸餾水160 μ L，于分光光度計(jì)490nm處測(cè)OD值； 步驟c2，活性測(cè)定: 取20 μ L濃度為1%的淀粉溶液于1.5mL離心管中，加入20 μ L制備好的待測(cè)酶混合液，對(duì)照組加入20 μ L不含消化酶的營(yíng)養(yǎng)液，混合均勻，于29°C溫浴3min后，再加入40 μ L顯示劑DNS(3g/L)和160 μ L蒸餾水，于分光光度計(jì)490nm處分別測(cè)定兩組OD值，重復(fù)10次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，其特征在于，在上述步驟a中，所述培養(yǎng)箱施以溫度為25°C ±1°C，光周期為16L: 8D。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，其特征在于，在上述步驟a中,覆膜時(shí),在頂端開口 2先覆一層足夠薄的Paraflim封口膜，用移液槍在膜上滴加100μ L的液體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，再覆以一層Paraflim封口膜，在盒身與膜接觸處壓緊貼合以防止液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)外漏流失，將饑餓過的綠盲蝽放入蟲室，迅速以紗布覆住底端開口，以保持通氣，用橡皮筋封住，以防止綠盲蝽逃逸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，其特征在于，在上述步驟a中,所述的液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)為20%鹿糖、100mmol/L絲氨酸、100mmol/L蛋氨酸、IOOmmoI/L天冬氨酸；配制方法為準(zhǔn)確稱取20g的蔗糖，1.05g的絲氨酸，1.49g的蛋氨酸，1.33g的天冬氨酸，用蒸餾水定容至IOOmL:食料滅菌后，置4°C冰箱中不超過7天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，其特征在于，在上述步驟a中，使用裝置的膠卷盒包括兩端開口，頂端開口以兩層Paraflim膜覆蓋，兩層膜間為液體營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)；膠卷盒瓶身為收集綠盲蝽的蟲室，底端開口以紗布覆蓋，并以橡皮筋固定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，其特征在于，在上述步驟bl中，配制lmg/mL D-半乳糖醛酸的溶液，在10支離心管中加入D-半乳糖醛酸的量分別為 0、10、20、30、40、50、60、70、80、90mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，其特征在于，所述膠卷盒外徑為3.2cm,內(nèi)徑為3.0cm ;膠卷盒材質(zhì)為硬質(zhì)塑料，高度為5.0cm,壁厚為0.1cm。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的綠盲蝽唾液酶中果膠酶與淀粉酶的體外提取測(cè)定方法，其特征在于，所述Paraflim封口 膜為高彈性封口膜；所述的蟲室體積為113.0cm3。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103884665SQ201410116124
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】周洪旭, 譚秀梅, 許秀蘋, 王霞 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)