口蹄疫疫苗宿主細(xì)胞蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測口蹄疫疫苗宿主細(xì)胞蛋白的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒，所述雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒包括：標(biāo)準(zhǔn)品，兔抗BHK21細(xì)胞蛋白多克隆抗體包被的96孔酶標(biāo)板，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，抗BHK21細(xì)胞蛋白抗體液，稀釋液，封閉液，洗液，終止液2M?H2SO4，顯色液，其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為幼倉鼠腎細(xì)胞蛋白，包被抗體和檢測抗體均為兔抗BHK21細(xì)胞蛋白多克隆抗體。本發(fā)明檢測試劑盒中包被抗體量更加穩(wěn)定均一、對微量抗原的乳化更加簡便充分、結(jié)合抗體與檢測抗體為同一抗體在制作試劑盒過程中更加便捷高效，避免不同抗體之間的交叉影響。
【專利說明】口蹄疫疫苗宿主細(xì)胞蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種口蹄疫疫苗宿主細(xì)胞蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及使用方法，具體涉及一種用于檢測口蹄疫疫苗中宿主細(xì)胞(即幼倉鼠腎細(xì)胞)殘留蛋白的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫試劑盒及其使用方法，屬于生物檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]口蹄疫是豬、牛、羊等主要家畜和其它家養(yǎng)、野生偶蹄動物共患的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，易感動物達(dá)70多種。臨床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮膚發(fā)生水皰性疹。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，造成巨大政治、經(jīng)濟(jì)損失。鑒于此，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類傳染病之首。目前，有三分之二的OIE成員國流行口蹄疫，時刻威脅著無口蹄疫國家和地區(qū)的家畜安全和畜產(chǎn)品貿(mào)易。口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬。其最大顆粒直徑為23納米，最小顆粒直徑為7-8納米，是目前所知病毒中最細(xì)微的一級。
[0003]牛尤其是犢牛對口蹄疫病毒最易感，駱駝、綿羊、山羊次之，豬也可感染發(fā)病。本病具有流行快、傳播廣、發(fā)病急、危害大等流行病學(xué)特點，疫區(qū)發(fā)病率可達(dá)50% -100%，犢牛死亡率較高，其他則較低。病畜和潛伏期動物是最危險的傳染源。病畜的水皰液、乳汁、尿液、口涎、淚液和糞便中均含有病毒。該病人侵途徑主要是消化道，也可經(jīng)呼吸道傳染。本病傳播雖無明顯的季節(jié)性，且春秋兩季較多，尤其是春季。風(fēng)和鳥類也是遠(yuǎn)距離傳播的因素之一 O
[0004]口蹄疫是目前我國最具影響的動物傳染病之一。口蹄疫病毒型多易變，宿主廣泛，致病性強(qiáng)，而免疫原性又相對較弱。該病傳播方式及感染途徑多而復(fù)雜，康復(fù)動物可長期帶毒排毒，致使口蹄疫的防控十分困難。因此對口蹄疫疫苗質(zhì)量要求越來越高，致使用以衡量疫苗質(zhì)量，檢測其他無關(guān)蛋白方法及相關(guān)產(chǎn)品呼之欲出。隨著無血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生和應(yīng)用，宿主細(xì)胞殘留蛋白成為影響疫苗的主要因素，所以對宿主細(xì)胞殘留蛋白的檢測尤為重要。與這一需求相矛盾的情況是，口蹄疫疫苗宿主細(xì)胞蛋白檢測相關(guān)產(chǎn)品的缺失，這為疫苗的檢測監(jiān)督造成了缺口和漏洞。在這種供求矛盾面前顯得這一發(fā)明尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一提供一種口蹄疫疫苗宿主細(xì)胞蛋白雙抗夾心酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及使用方法。
[0006]本發(fā)明的目的之二提供一種微量抗原乳化的方法
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]—種用于檢測口蹄疫疫苗宿主細(xì)胞蛋白的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒,所述雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒包括:標(biāo)準(zhǔn)品，兔抗BHK21細(xì)胞蛋白多克隆抗體包被的96孔酶標(biāo)板，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，稀釋液，抗BHK21細(xì)胞蛋白抗體液，封閉液，洗液，終止液2M H2SO4,顯色液，其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品為幼倉鼠腎細(xì)胞蛋白，包被抗體和檢測抗體均為兔抗BHK21細(xì)胞蛋白多克隆抗體。
[0009]1、兔抗BHK21細(xì)胞蛋白多克隆抗體的制備
[0010]首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化抗原，家兔背部脊柱兩側(cè)四點注射，注射BHK21細(xì)胞蛋白總量IOOOug/只；首次免疫后14天后進(jìn)行二次免疫，步驟及劑量與首次免疫相同，二次免疫采用弗氏不完全佐劑乳化抗原；二次免疫后21天進(jìn)行三次免疫，步驟及劑量與二次免疫相同；之后每隔21天檢測抗體效價，免疫一次，效價超過1:32000可以心臟大量采血。
[0011]2、BHK21細(xì)胞(幼倉鼠腎細(xì)胞)蛋白的制備
[0012]BHK21細(xì)胞(幼倉鼠腎細(xì)胞)購自中檢所，應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基加馬血清培養(yǎng)傳代，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底用PH7.2的10XPBS洗滌5次，將培養(yǎng)基洗滌干凈，胰酶消化細(xì)胞待細(xì)胞脫落，后再用10XPBS洗滌5次后裝入孔徑為8000-14000nm的透析袋，在100倍體積10XPBS緩沖液中4°C透析12小時，而后將細(xì)胞放入離心管中，_80°C反復(fù)凍容5次，鏡下觀察無完整細(xì)胞后進(jìn)行7500r/min離心，去除細(xì)胞碎片，取上層溶液，此溶液為所需抗原蛋白溶液，考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白含量。
[0013]3、抗原蛋白溶液的乳化方法
[0014]將2中獲得的抗原蛋白溶液用10XPBS稀釋成所需濃度，再與蛋白液等體積的弗氏佐劑混合后乳化。做冰水點滴試驗，冰水中超過IOmin不擴(kuò)散即達(dá)到乳化標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的乳化方法可以快速充分乳化少量抗原蛋白液，具體操作方法為硅膠管兩端分別加裝5號針頭，硅膠管處加蠕動泵作為乳化動力源，兩針頭放入同一裝有抗原液與佐劑混合的混合液的尚心管，一端插入蛋白液另一端在液面上，抽吸40min后乳化完成。
[0015]5、包被抗體血清的制備
[0016]應(yīng)用3中獲得的乳化抗原進(jìn)行免疫，首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化抗原，家兔背部脊柱兩側(cè)四點注射，注射BHK21細(xì)胞蛋白總量IOOOug/只；首次免疫后14天后進(jìn)行二次免疫，二次免疫采用弗氏不完全佐劑乳化抗原，步驟及劑量與首次免疫相同；二次免疫后21天進(jìn)行三次免疫，步驟及劑量與二次免疫相同；之后每隔21天免疫一次并且采血檢測抗體效價，當(dāng)效價超過1:32000可以大量采血，置于血凝管中離心制備血清。
[0017]6、間接ELISA法檢測抗體效價
[0018]用2中提取的蛋白以10ug/ml量包被后，用0.1%BSA封閉90分鐘，然后將4中制備的血清稀釋16倍后加入第一列，然后依次兩倍稀釋，結(jié)合110分鐘，加入稀釋到工作濃度的酶標(biāo)二抗20分鐘，之后顯色終止，酶標(biāo)儀設(shè)定波長為450nm，讀取數(shù)據(jù)，每個步驟完成后用洗滌液洗滌3到5次。
[0019]7、包被抗體的純化
[0020]( I)辛酸硫酸銨法粗提抗體
[0021]首先動物血清用4倍體積的乙酸乙酸鈉緩沖液稀釋，0.1mol/LNaOH調(diào)pH至4.5，室溫下攪拌并緩慢加入辛酸，10000r/min離心20min，取上清，量體積，按1/10體積加入10XPBS,并用5mol/L的NaOH調(diào)pH至7.4，在4°C按277g/L緩慢加入硫酸銨粉末，加完后繼續(xù)攪拌30min,離心棄上清，收集沉淀,沉淀用10XPBS溶解,透析過夜,透析后的抗體溶液在50-55°C水浴中加熱20min，5000r/min離心20min，取上清液放置_20°C保存。[0022](2)親和層析柱純化抗體
[0023]用結(jié)合緩沖液稀釋4中獲得的抗體，至pH接近7.0，然后將蛋白A填料裝入柱子，用5倍體積結(jié)合緩沖液平衡柱子。上樣，結(jié)合緩沖液洗柱子，收集洗脫緩沖液洗下的結(jié)合在柱料上的抗體，然后用結(jié)合緩沖液復(fù)生柱料。
[0024]8、酶標(biāo)板的處理
[0025]用10%硫酸魚精蛋白溶液每孔100ul37°C 2小時處理酶標(biāo)板，后用抗體效價對照稀釋包被，即將間接ELISA檢測效價為1:2048的抗體液稀釋32倍后加入酶標(biāo)板每孔lOOul，37°C包被過夜，后封閉2小時，封存。
[0026]9、使用本發(fā)明雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟:
[0027](I)加入待測樣品:取出酶標(biāo)板加入稀釋后的待測樣品，IOOul每孔，37 C，2小時；
[0028](2)加入檢測抗體:取出檢測抗體稀釋32倍，每孔加入100ul，37°C，1.5小時；
[0029](3)加酶標(biāo)二抗:將酶標(biāo)二抗稀釋10000倍后每孔加入lOOul，37°C，20分鐘；
[0030](4)顯色:每孔加入顯色液100ul37°C 4分鐘；
[0031](5)終止:每孔加入40ul2M硫酸溶液；
[0032](6)酶標(biāo)儀測量在波長為450nm的值，計算BHK21細(xì)胞蛋白含量；
[0033]其中，所述的計算方法為:
[0034]采用樣品讀取值與陰性值作差后引入公式y(tǒng)=Z (4925.2χ-702.52)中計算細(xì)胞蛋白含量，其中Y代表細(xì)胞蛋白含量，單位ug/ml，X值為陰陽性吸光值之差，Z為稀釋倍數(shù)。
[0035]Y=Z (4925.2X-702.52)的確立過程如下:
[0036]依照雙抗夾心ELISA體系對BHK21細(xì)胞蛋白液進(jìn)行檢測，具體方法如下:
[0037](I)將提取的BHK21細(xì)胞破碎提取蛋白；
[0038](2)用考馬斯亮藍(lán)法定量蛋白液中蛋白含量；
[0039](3)稀釋蛋白液使蛋白含量分別為100ug/ml200ug/ml300ug/ml400ug/ml四個梯度，完成ELISA ;
[0040](4)進(jìn)行多次實驗分別得到四個蛋白含量梯度陰陽性差值的平均值，依照得到的四個平均值確定標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方程。
[0041]試驗陰陽性差平均值如下:
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測口蹄疫疫苗宿主細(xì)胞蛋白的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒包括:標(biāo)準(zhǔn)品，兔抗BHK21細(xì)胞蛋白多克隆抗體包被的96孔酶標(biāo)板，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，抗BHK21細(xì)胞蛋白抗體液，稀釋液，封閉液，洗液，終止液2M H2SO4,顯色液,其中,所述的標(biāo)準(zhǔn)品為所述標(biāo)準(zhǔn)品為幼倉鼠腎細(xì)胞蛋白，包被抗體和檢測抗體均為兔抗BHK21細(xì)胞蛋白多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述兔抗BHK21細(xì)胞蛋白多克隆抗體的制備方法為: 首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化抗原，家兔背部脊柱兩側(cè)四點注射，注射BHK21蛋白總量IOOOug/只；首次免疫后14天后進(jìn)行二次免疫,步驟及劑量與首次免疫相同,二次免疫采用弗氏不完全佐劑乳化抗原；二次免疫后21天進(jìn)行三次免疫，步驟及劑量與二次免疫相同；之后每隔21天檢測抗體效價，免疫一次，效價超過1:32000可以心臟大量采血。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述幼倉鼠腎細(xì)胞蛋白的制備方法如下: 將BHK21細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基加馬血清培養(yǎng)傳代，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底用pH為7.2的10 X PBS洗滌5次，將培養(yǎng)基洗滌干凈，胰酶消化細(xì)胞待細(xì)胞脫落，后再用10 X PBS洗滌5次后裝入孔徑為8000-14000nm的透析袋，在100倍體積10XPBS緩沖液中4°C透析12小時，而后將細(xì)胞放入離心管中，-80°C反復(fù)凍容5次，鏡下觀察無完整細(xì)胞后進(jìn)行7500r/min離心，去除細(xì)胞碎片，取上層溶液，此溶液為所需抗原蛋白溶液，考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，可以快速充分乳化少量抗原蛋白液，方法為硅膠管兩端分別加裝5號針頭，硅膠管處加蠕動泵作為乳化動力源，兩針頭放入同一裝有抗原液與佐劑混合的混合液的離心管，一端插入蛋白液另一端在液面上，抽吸40min后乳化完成。
5.酶標(biāo)板處理方法用10%硫酸魚精蛋白溶液每孔100ul37°C2小時處理酶標(biāo)板，后用抗據(jù)權(quán)利要求1中所述的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于，所述抗體效價對照稀釋包被，即將間接ELISA檢測效價為1:2048的抗體液稀釋32倍后加入酶標(biāo)板每孔lOOul，37°C包被過夜，后封閉2小時，封存。
6.使用如權(quán)利要求1-5任一項所述的雙抗夾心酶聯(lián)免疫試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)加入待測樣品:取出酶標(biāo)板加入稀釋后的待測樣品，IOOul每孔，37°C，2小時； (2)加入檢測抗體:取出檢測抗體稀釋32倍，每孔加入100ul，37°C，1.5小時； (3)加酶標(biāo)二抗:將酶標(biāo)二抗稀釋10000倍后每孔加入lOOul，37°C，20分鐘； (4)顯色:每孔加入顯色液IOOul，37°C，4分鐘； (5)終止:每孔加入40ul，2M硫酸溶液； (6)酶標(biāo)儀測量在波長為450nm的值，計算BHK21細(xì)胞蛋白含量； 其中，所述的計算方法為: 采用樣品讀取值與陰性值作差后引入公式y(tǒng)=Z (4925.2x-702.52)中計算細(xì)胞蛋白含量，其中Y代表細(xì)胞蛋白含量，單位ug/ml，X值為陰陽性吸光值之差，Z為稀釋倍數(shù)。
【文檔編號】G01N33/543GK103792366SQ201410026997
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】趙炳武, 趙宏凱, 任美榮, 劉金萍, 王永偉, 呂宏亮, 張澍 申請人:內(nèi)蒙古必威安泰生物科技有限公司