專利名稱：一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員身高的細(xì)胞生物學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員身高的細(xì)胞生物學(xué)方法。適合于優(yōu)秀冰雪運動員在基因和蛋白水平上的早期選材，屬于體育科學(xué)與生命科學(xué)交叉的學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是多功能生長因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor-β , TGF- β )超家族，是一組具有結(jié)構(gòu)類似、高度保守的功能蛋白，能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)骨和軟骨形成的因子，并在肢體生長、軟骨內(nèi)骨化、骨折早期、軟骨修復(fù)時表達(dá)，對骨骼的胚胎發(fā)育和再生修復(fù)起重要作用。BMP的活性最早發(fā)現(xiàn)在20世紀(jì)60年代，直到20世紀(jì)80年代純化并克隆人類BMP后，才發(fā)現(xiàn)這種蛋白有骨誘導(dǎo)作用。迄今為止，已有約20多種被發(fā)現(xiàn)。BMP信號通過絲/蘇氨酸激酶受體I型和II型的亞型觸發(fā)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種I型受體與BMP配位體結(jié)合，也就是:1a、Ib型BMP受體和Ia型活化素受體。BMP還涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，但它們是以常位和異位誘導(dǎo)骨、軟骨、韌帶和腱形成能力為標(biāo)志的。BMP參與骨骼的生長、發(fā)育及創(chuàng)傷的修復(fù)，主要表現(xiàn)為BMP的誘導(dǎo)成骨作用。正常骨形成需要3個必備條件:(I)特定的干細(xì)胞；(2)誘導(dǎo)因子；(3)允許骨形成的環(huán)境。BMP作用的靶細(xì)胞是未分化的、有活性的間充質(zhì)細(xì)胞。它能誘導(dǎo)特定的、包括肌肉中和血管周圍的間充質(zhì)細(xì)胞，不可逆地分化為軟骨和骨細(xì)胞。將BMP植入軟組織內(nèi)， 可誘導(dǎo)異位新骨的形成。在骨折后愈合的過程中，骨折的骨痂形成區(qū)BMP的表達(dá)水平顯著增高。目前，骨形成蛋白已被成功地應(yīng)用于骨延遲愈合的治療、骨不連接、骨折和骨缺損的治療。已有很多關(guān)于報道基因重組人的具有骨誘導(dǎo)活性的骨形成蛋白BMP2、BMP4、BMP5、BMP7。其中尤以BMP2和BMP7的報道最多，其成骨作用也較強。進一步的研究表明，BMP9在14種BMP中的成骨作用最強，其成骨作用甚至比目前已廣泛證實的BMP2、BMP7的成骨作用更強大。BMP誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的作用已經(jīng)大量實驗證實，還有實驗發(fā)現(xiàn)BMP2能誘導(dǎo)提高成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，顯著地誘導(dǎo)骨鈣蛋白的表達(dá)，從而提高成骨細(xì)胞的成骨活性，而成骨細(xì)胞的活性又影響著優(yōu)秀冰雪運動員骨的形成和增長，因此，可以通過檢測優(yōu)秀冰雪運動員成骨細(xì)胞中BMPs的表達(dá)水平來預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員的最適身高，為冰雪運動員選材提供一個最適的細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。運動員的成長過程中伴隨著身體形態(tài)的變化，對運動員身體形態(tài)尤其是身高的研究是體育科學(xué)研究中基礎(chǔ)而又重要的一個環(huán)節(jié)。我國優(yōu)秀冰雪運動員身高特征的研究結(jié)果將有助于完善、系統(tǒng)的科學(xué)研究體系的建立，同時對構(gòu)建科學(xué)、系統(tǒng)的我國優(yōu)秀冰雪運動員的高模型起到積極作用，并為今后的身體機能、技戰(zhàn)術(shù)和心理的研究體系奠定一定的理論基礎(chǔ)。自1998年長野冬季奧運會短道速滑由表演項目正式獲準(zhǔn)成為比賽項目以來，該項目的6枚金牌倍受冰雪強國矚目。短道運動員的選材和育材也理所當(dāng)然的受到關(guān)注。身高作為身體形態(tài)的一個主要方面，有哪些特點，頂尖選手和非項尖選手之間的身高是否有差別，根據(jù)項目的特點究竟哪種身高更為適宜，此前曾有過專門研究，但隨著時間的推移，該項目水平的提高，運動員的身高又有哪些新的特點，需要我們進一步做出更科學(xué)的研究和推斷，探討當(dāng)今世界優(yōu)秀冰雪運動員的身高特征會對我國的該項目的選材和育材方面有一定的參考價值。由于我國對優(yōu)秀冰雪運動員最適身高的研究起步比較晚，而且冰雪運動員的育材和選材大部分都是靠經(jīng)驗，沒有建立在生命科學(xué)的基礎(chǔ)上。近些年來，隨著體育科學(xué)和生命科學(xué)的飛速發(fā)展及兩者在理論、方法、技術(shù)和手段上的相互交叉和滲透，強有力地推動者冰雪運動員早期選材向著科學(xué)化和系統(tǒng)化的方向轉(zhuǎn)型和發(fā)展。因此，有必要建立一套完善的、科學(xué)的、系統(tǒng)的細(xì)胞生物學(xué)方法，從細(xì)胞水平上有效地預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員的最適身高。骨是骨干和骨骺的積聚物，骺軟骨區(qū)形成成骨細(xì)胞，然后由軟骨變成骨頭，身體因此變高。骨形成蛋白是檢測成骨細(xì)胞活性的特異性表面標(biāo)記，通過免疫組化技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)對成骨細(xì)胞中的骨形成蛋白進行檢測，從而推斷出軟骨組織中特定基因表達(dá)量的差異情況，從細(xì)胞生物學(xué)水平上預(yù)測 基因表達(dá)與身高的聯(lián)系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種在細(xì)胞生物學(xué)水平上預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員身高的方法。本發(fā)明從細(xì)胞生物學(xué)水平上預(yù)測了優(yōu)秀冰雪運動員的最適身高，通過免疫組化技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測優(yōu)秀冰雪運動員成骨細(xì)胞中關(guān)鍵基因BMP2、BMP7和BMP9表達(dá)水平，進而從人體組織中特異蛋白水平上比較和預(yù)測與身高的聯(lián)系。方法簡單，易操作。
具體實施例方式下面以優(yōu)秀冰雪運動員成骨細(xì)胞中的分子標(biāo)記BMP2、BMP7和BMP9基因為例，通過檢測其相對表達(dá)水平來詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施。實施例:檢測優(yōu)秀冰雪運動員成骨細(xì)胞中的分子標(biāo)記BMP2、BMP7和BMP9基因的表達(dá)水平選取普通人和優(yōu)秀冰雪運動員的成骨細(xì)胞分別作為對照組和實驗組，對細(xì)胞中的關(guān)鍵蛋白BMP2、BMP7和BMP9做免疫組化檢測和流式檢測。(一 )成骨細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白的免疫組化檢測設(shè)置空白對照組、對照組和實驗組?？瞻讓φ战M采用PBS作為一抗，羊抗兔IgG (中杉金橋Zf-0311)作為二抗；對照組和實驗組采用兔抗人IgG作為一抗，羊抗兔IgG(中杉金橋Zf-0311)作為二抗；免疫組化具體方法如下:1、標(biāo)本制備將細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的蓋玻片，待細(xì)胞在蓋玻片上貼壁，PBS清洗三次，4%的多聚甲醛固定。2、染色I)石固定后的蓋玻片在0.25% Tritonx-1OO通透15min ；
2)用 PBS 洗 2min/ 次 X 3 次；3)加一滴封閉用山羊血清于蓋玻片上封閉30min ；4)倒掉或吸干液體；5)每張蓋玻片加IOOul —抗，濕盒內(nèi)孵育30 60min ；6)用 PBS 洗 2min/ 次 X 3 次；7)每張蓋玻片加一滴二抗，孵育60min ；8)用 PBS 洗 2min/ 次 X 3 次；9)鏡檢。激光共聚焦顯微鏡下觀察免疫組化結(jié)果。( 二)成骨細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白的流式檢測(I)微球準(zhǔn)備:取適量微球并用PBS離心洗滌2次，1500r/minX10min,棄上清液，用PBS重懸，計數(shù)并調(diào)整微球濃度至I X IO7個/ml ；(2)結(jié)合:取2只流式管，并分別標(biāo)記陰性對照、實驗管，加入100 μ I微球懸液；再于實驗管中加入一定量待檢可溶性蛋白溶液，陰性對照管加等體積的PBS ;4°C，結(jié)合60min ;定量檢測蛋白分子時，可把標(biāo)準(zhǔn) 蛋白進行倍比稀釋，分別與微球結(jié)合；(3)封閉:用PBS洗滌I次，1500r/minX lOmin，棄上清液，加入封閉液(含1% BSA的PBS)500y 1，4°C，封閉30min，以封閉微球上剩余的活性基團；(4)檢測抗體標(biāo)記:用PBS離心洗漆2次，1500r/minX IOmin,棄上清液,于各管中加入目的蛋白熒光抗體IOyl ;4°C，避光反應(yīng)30min(也可進行間接免疫熒光標(biāo)記)。流失檢測:用PBS洗滌2次，棄上清液，用500 μ IPBS重懸，上機檢測；(5)收集10000個微球，定性檢測時用熒光陽性率表示(出現(xiàn)熒光陽性信號，則表示樣本中含待檢可溶性蛋白分子；陽性率低且熒光強度弱，則表示樣本中待檢可溶性蛋白分子含量低，反之則含量高)；若進行定量檢測時，用平均熒光強度表示，需繪制平均熒光強度與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的關(guān)系曲線，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待檢樣本的含量。(三)檢測結(jié)果實驗組和對照組的測定結(jié)果比較其差異，實驗結(jié)果顯示，實驗組中的優(yōu)秀冰雪運動員成骨細(xì)胞中的ΒΜΡ2、ΒΜΡ7和ΒΜΡ9基因的表達(dá)量較對照組普通人成骨細(xì)胞中的ΒΜΡ2、ΒΜΡ7和ΒΜΡ9基因的表達(dá)量高。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員的身高的細(xì)胞生物學(xué)方法。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞生物學(xué)方法，其特征在于通過免疫組化技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)定性和定量檢測成骨細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 (bone morphogeneticprotein2,BMP2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7 (bone morphogenetic protein7,BMP7)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bonemorphogenetic protein9, BMP9)蛋白的表達(dá)水平來預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員的身高。
3.依據(jù)權(quán)利要求2所述，通過免疫組化技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測優(yōu)秀冰雪運動員成骨細(xì)胞中BMP2、BMP7和BMP 9基因的表達(dá)量較普通人的高。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)測優(yōu)秀冰雪運動員身高的細(xì)胞生物學(xué)方法。主要通過免疫組化技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)定性和定量檢測并比較優(yōu)秀冰雪運動員和普通人成骨細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP)中的BMP2、BMP7、BMP9的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，檢測優(yōu)秀冰雪運動員成骨細(xì)胞中BMP2、BMP7和BMP9的表達(dá)量較普通人的高。說明人成骨細(xì)胞中BMP2、BMP7和BMP9相對較高的表達(dá)量是最適身高的參考標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明為建立該項目運動員潛能的早期預(yù)測、評定、選材和育材的科學(xué)體系打下堅實的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，突破一次性選材的理論和技術(shù)難關(guān)。
文檔編號G01N33/68GK103226147SQ20131010815
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月1日
發(fā)明者姜龍江, 闞軍常, 李萬哲, 崔鵬, 白春雨, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院