外周血中循環(huán)非血液細胞標識基因的檢測與鑒定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明設(shè)計用分子信標檢測外周血中循環(huán)非血液細胞(外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTC))，將選擇合成CTC標識基因EP-CAM、CK基因的分子信標，與CTC細胞內(nèi)的這些基因和mRNA雜交，而檢測其基因和mRNA表達水平。通過(1)活細胞檢測CTC標識基因或固定細胞檢測CTC標識基因，從基因水平檢測CTC；(2)再用化學染色法從病理形態(tài)學水平鑒定CTC。本方法具有準確(基因水平和細胞病理形態(tài)學檢測鑒定細胞)、快速(1～3.5小時內(nèi)報告結(jié)果)、經(jīng)濟(成本低)的優(yōu)點。具有廣闊的市場前景，將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。
【專利說明】外周血中循環(huán)非血液細胞標識基因的檢測與鑒定
一、所屬【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明專利涉及外周血中循環(huán)非血液細胞的富集與標識基因的檢測。適宜于外周血中循環(huán)非血液細胞(循環(huán)腫瘤細胞)內(nèi)標識基因的檢測。
二、【背景技術(shù)】
[0002]本方法所述外周血非循環(huán)血液細胞主要指外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTC)。外周血循環(huán)癌細胞和癌細胞栓(團)標識基因的檢測與鑒定，對于腫瘤的轉(zhuǎn)移、腫瘤的復發(fā)、腫瘤化療藥物的敏感性測定、腫瘤的預(yù)后及早期診斷具有重要應(yīng)用價值。本專利通過癌細胞特有的上皮細胞粘附分子(Ep-CAM)、細胞角蛋白(CK8、18、19等)等基因合成的分子燈標，通過細胞內(nèi)分子，達到從基因水平檢測腫瘤細胞標識基因、并通過化學染色從病理形態(tài)學水平檢定CTC的目的。
[0003]目前，國內(nèi)外還沒有通過上述循環(huán)腫瘤細胞標志基因檢測鑒定腫瘤細胞的報道?，F(xiàn)有的方法是通過免疫熒光從免疫學方面和病理形態(tài)學方面檢測鑒定CTC。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]1、分子信標檢測、鑒定CTC標志基因:循環(huán)腫瘤細胞含有EP-CAM、CK標識基因，本專利設(shè)計合成與EP-CAM、CK等基因和與其mRNA特異性雜交的分子信標，經(jīng)細胞內(nèi)分子雜交的方法檢測鑒定CTC的標志基因及mRNA的表達水。熒光顯微鏡觀察記錄反應(yīng)結(jié)果。
[0005]2、顯微鏡:將熒光顯微鏡觀察的細胞片，用化學方法染色，用一般化學染色就能清晰的從病理形態(tài)學上鑒定腫瘤細胞。
[0006]四、要解決的技術(shù)問題
[0007]1、細胞內(nèi)分子雜交從基因水平檢測CTC:通過合成CTC標志基因的分子信標，采用細胞內(nèi)分子雜交的方法，從基因水平檢測鑒定CTC并分析其基因表達水平。
[0008]2、化學染色從病理形態(tài)學水平鑒定CTC:通過分子信標從基因水平檢測CTC，在循環(huán)腫瘤細胞的檢測，特別是癌癥的早期篩查、癌轉(zhuǎn)移或復發(fā)是非常重要的；再用化學染色從病理形態(tài)學角度鑒定癌細胞，是非常必要的。
四、【具體實施方式】
[0009](一 )實施例1、活細胞檢測CTC標識基因
[0010]1、用抗凝管采集被檢者全血8ml，混勻。
[0011]2、采用膜分離、磁分離、梯度離心等方法富集CTC。
[0012]3、用1640或其它細胞培養(yǎng)液在微孔板內(nèi)培養(yǎng)CTC。
[0013]4、將稀釋0.01-800nM EP-CAM、CK等的分子信標溶液加入微孔板內(nèi)，370C?520C溫浴雜交0.5?12小時。
[0014]5、用DAPI復染5?25分鐘。
[0015]6、熒光顯微鏡觀察熒光細胞:通過腫瘤細胞(CK、Ep_CAM)及DAPI的熒光顏色及形態(tài)分辨非血液性細胞(癌細胞)和白細胞。拍照、存檔。
[0016]7、用化學染色劑復染細胞片5?40分鐘，淋洗染液時注意不要直接淋洗細胞部位，水沖力要小。
[0017]8、用一般顯微鏡觀察細胞病理學形態(tài)，盡可能和免疫熒光對邊觀察細胞。通過癌細胞特有的核大、核畸形、核漿比失調(diào)等特征，從病理形態(tài)學方面鑒定非血液細胞(癌細胞)。
[0018]( 二)實施例2、固定細胞檢測CTC標識基因:
[0019]1、用抗凝管采集被檢者全血8ml，混勻。
[0020]2、采用膜分離、磁分離、梯度離心等方法富集CTC。
[0021]3、用有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮等)或醛類(甲醛、多聚甲醛)固定細胞，5?30分鐘。用醛類固定細胞，還要用曲拉通等試劑通透細胞，時間5?30分鐘。用洗滌液洗滌I?5次。
[0022]4、用BSA或其它動物血清370C封閉10?60分鐘。用洗滌液洗滌I?5次。
[0023]5、將稀釋0.01-800nM EP-CAM、CK等的分子信標溶液加入微孔板內(nèi)，370C?520C溫浴雜交0.5?12小時。用洗滌液洗滌I?5次。
[0024]6、用DAPI復染5?25分鐘。用洗滌液洗滌I?5次。
[0025]7、熒光顯微鏡觀察熒光細胞:通過腫瘤細胞(CK、Ep_CAM)及DAPI的熒光顏色及形態(tài)分辨非血液性細胞(癌細胞)和白細胞。拍照、存檔。
[0026]8、用化學染色劑(瑞姬氏染色液、瑞氏染色液等)復染細胞片5?40分鐘，淋洗染液時注意不要直接淋洗細胞部位，水沖力要小。
[0027]9、用一般顯微鏡觀察細胞病理學形態(tài)，盡可能和免疫熒光對邊觀察細胞。通過癌細胞特有的核大、核畸形、核漿比失調(diào)等特征，從病理形態(tài)學方面鑒定非血液細胞(癌細胞)。
[0028]5、用DAPI復染5?25分鐘。
[0029]6、熒光顯微鏡觀察熒光細胞:通過腫瘤細胞(CK、Ep_CAM)及DAPI的熒光顏色及形態(tài)分辨非血液性細胞(癌細胞)和白細胞。拍照、存檔。
[0030]7、用化學染色劑復染細胞片5?40分鐘，淋洗染液時注意不要直接淋洗細胞部位，水沖力要小。
[0031]8、用一般顯微鏡觀察細胞病理學形態(tài)，盡可能和免疫熒光對邊觀察細胞。通過癌細胞特有的核大、核畸形、核漿比失調(diào)等特征，從病理形態(tài)學方面鑒定非血液細胞(癌細胞)。
[0032]( 二)實施例2、固定細胞檢測CTC標識基因:
[0033]1、用抗凝管采集被檢者全血8ml，混勻。
[0034]2、采用膜分離、磁分離、梯度離心等方法富集CTC。
[0035]3、用有機溶劑(甲醇、乙醇、丙酮等)或醛類(甲醛、多聚甲醛)固定細胞，5?30分鐘。用醛類固定細胞，還要用曲拉通等試劑通透細胞，時間5?30分鐘。用洗滌液洗滌I?5次。
[0036]4、用BSA或其它動物血清370C封閉10?60分鐘。用洗滌液洗滌I?5次。
[0037]5、將稀釋0.01-800nM EP-CAM、CK等的分子信標溶液加入微孔板內(nèi)，370C?520C溫浴雜交0.5?12小時。用洗滌液洗滌I?5次。
[0038]6、用DAPI復染5?25分鐘。用洗滌液洗滌I?5次。
[0039]7、熒光顯微鏡觀察熒光細胞:通過腫瘤細胞(CK、Ep_CAM)及DAPI的熒光顏色及形態(tài)分辨非血液性細胞(癌細胞)和白細胞。拍照、存檔。
[0040]8、用化學染色劑(瑞姬氏染色液、瑞氏染色液等)復染細胞片5?40分鐘，淋洗染液時注意不要直接淋洗細胞部位，水沖力要小。
[0041]9、用一般顯微鏡觀察細胞病理學形態(tài)，盡可能和免疫熒光對邊觀察細胞。通過癌細胞特有的核大、核畸形、核漿比失調(diào)等特征，從病理形態(tài)學方面鑒定非血液細胞(癌細胞)。
【權(quán)利要求】
1.基于外周血中循環(huán)非血液細胞(循環(huán)腫瘤細胞(CTC))標識基因(EP-CAM、CK)，用分子信標方法從基因水平檢測鑒定CTC。
2.活細胞檢測CTC標識基因:分離富集CTC，加1640等培養(yǎng)液培養(yǎng)，加CTC標識基因的分子信標，雜交檢測CTC細胞的標志基因，從基因水平檢測CTC ;再用化學染色從病理形態(tài)學水平鑒定CTC。
3.固定細胞檢測CTC標識基因:分離富集CTC，用有機溶劑固定細胞，加CTC標識基因的分子信標，雜交檢測CTC細胞的標志基因，從基因水平檢測CTC ;再用化學染色從病理形態(tài)學水平鑒定C TC。
【文檔編號】G01N21/29GK103901002SQ201210576618
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月27日
【發(fā)明者】肖樂義, 駱云連, 米明仁, 李靜靜, 李璐, 馬小麗, 李薇, 譚印成, 王秀麗, 王津津, 張志立, 陳鳳華, 韓峰, 鄭玉芬 申請人:河北燕達醫(yī)學研究院