補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物的醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物的醫(yī)藥用途，所述補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物為具有式(I)結(jié)構(gòu)的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或前藥：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自獨立地選自下組：氫、ORa、OCOORa、OCONRaRb、OSO2Ra和OSO3Ra；所述Ra和Rb各自獨立地選自下組：氫、取代或未取代的C1-C12烷基、取代的或未取代的C2-C12烯基、取代的或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的C6-C30芳基，和取代或未取代的C1-C30雜芳基；所述補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物用于制備促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)和/或血管新生的藥物或保健品。
【專利說明】
補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物的醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化的始動因素，血管損傷后還可能導(dǎo)致肢端缺血、冠 心病等疾病。而成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞受增殖分裂所限，其修復(fù)受損內(nèi)皮的功能有限。近年研究 發(fā)現(xiàn):體內(nèi)外周血液中存在內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)，其可分化 成內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)一步修復(fù)受損血管或參與血管新生。內(nèi)皮祖細(xì)胞是一種能特異性歸巢于損 傷區(qū)域并直接分化增殖成血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial Cells，ECs)的前驅(qū)細(xì)胞。出生后， EPCs參與血管發(fā)生，具有促進(jìn)血管再生和血管內(nèi)皮修復(fù)的功能。在正常情況下，成人骨髓干 細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，臍帶血和外周血中干細(xì)胞數(shù)量很少。在受到特定刺激后，骨髓干細(xì)胞被 激活，經(jīng)過動員、迀移和分化，形成EPCs到外周循環(huán)中，一方面通過旁分泌的作用促進(jìn)缺血 組織血管新生，另一方面歸巢到受損血管叢，直接分化成新生血管。某些疾病和生物學(xué)因 素，如高血壓、糖尿病、腦卒中、動脈粥樣硬化等會引起外周血中EPCs數(shù)量減少、功能受損。 而心肌梗塞[Thum T，et al. Cardiovasc Res .2006 Apr 1; 70(1 ):50-60 .Shintani S，et al.Circulation.2001Jun 12;103(23):2776_9·]、糖尿病[Asai J，et al.Int Wound J.20130ct；10(5):527-33.Marrotte EJ,et al.J Clin Invest.2010Dec；120(12):4207-19·]、腦卒中[Yip HK，et al.Stroke.2008Jan;39(l):69-74.Teng H，et al.J Cereb Blood Flow Metab.2008Apr;28(4):764-71·]、動脈粥樣硬化[Fadini GP，et al. Atherosclerosis .2007Sep；194( I):46-54.Lenk K,et al.J Appl Physiol (1985) .201 IJul; 111 (I): 321-8.]等疾病均存在血管內(nèi)皮受損，需要EPCs的參與修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)： EPCs也參與創(chuàng)傷[Herdrich BJ,et al.Cytotherapy.2008;10(6):543_50.Foresta C，et al.J Trauma.2011Feb;70(2):459-65·]、糖尿病足傷口 [Tecilazich F，et al.PLoS 0ne.2013Dec 16；8(12):e83314.Drela E,et al.Adv Clin Exp Med.2012Mar-Apr；21(2): 249-54·]、缺血組織[Tu TC,et al.Stem Cells Dev.2016Feb l;25(3):266-76.Lee SP，et al. Circulation. 2006Jul 11; 114(2) :150-9.]的愈合。在創(chuàng)傷愈合過程中，供血供氧均有 賴于傷口局部的血管新生。
[0003] 中藥補(bǔ)骨脂是一種常見的補(bǔ)腎中藥，有補(bǔ)腎壯陽、固精速尿、溫脾止瀉、納氣平喘 之效。補(bǔ)骨脂查爾酮(Bavachalcone)是從中藥補(bǔ)骨脂(Psoralea Corylifolia L.)中提取 分離出的一種異戊烯基黃酮類單體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的旨在提供補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物的新用途。
[0005] 本發(fā)明的第一方面提供了一種活性成分的用途，所述活性成分為具有式（I)結(jié)構(gòu) 的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或前藥，
[0006]
[0007] 其中，1^、1?2、1?3、1?4、1?5、1?6、1?7、1?8和1?9各自獨立地選自下組：氫、01^、0(：001^、 OCONRaR b、0S02Ra和OSO3Ra;所述Ra和Rb各自獨立地選自下組:氫、取代或未取代的C1-C12烷 基、取代的或未取代的C2-C12烯基、取代的或未取代的C2-C12炔基、取代或未取代的C6-C30 芳基，和取代或未取代的C1-C30雜芳基；
[0008] 所述活性成分用于制備促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)和/或血管新生的藥物或保健品。
[0009] 在一優(yōu)選例中，所述R1選自氫、羥基或烷氧基，R2、R 5、R6各自獨立選自氫，R3選自羥 基或烷氧基，R4、Rs、R 9各自獨立選自氫或羥基，R7選自羥基。
[0010] 在一優(yōu)選例中，所述活性成分選自下列化合物：
[0011]
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述活性成分通過促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化進(jìn)而促進(jìn) 血管內(nèi)皮修復(fù)和/或血管新生。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)和/或血管新生的藥物或保健品可用于 防治需要內(nèi)皮祖細(xì)胞參與修復(fù)的疾病，所述疾病選自：高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿 病、心肌梗塞、腦梗塞、組織缺血或組織創(chuàng)傷。
[0014] 本發(fā)明各個方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利要求 的描述，本發(fā)明的特點、目的和優(yōu)勢將更為明顯。
【附圖說明】：
[0015] 圖1體現(xiàn)了補(bǔ)骨脂查爾酮在體外促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化；圖IA顯示運(yùn) 用透視顯微鏡觀察到的體外培養(yǎng)第1、4和7日時，骨髓干細(xì)胞分化后形成的細(xì)胞集落形態(tài)； 圖IB是圖IA的統(tǒng)計；圖IC是體外培養(yǎng)第7日，運(yùn)用祖細(xì)胞標(biāo)志物CD34和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物 vWF抗體做的定性細(xì)胞熒光免疫染色；圖1天是運(yùn)用祖細(xì)胞標(biāo)志物CD34和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志 物CD31抗體對體外培養(yǎng)第7日的細(xì)胞實施雙標(biāo)記，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分化程度；圖IE 是對圖1天的統(tǒng)計。其中值用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，n = 3,與對照組比較，樸彡0.05;林P彡 0.01；
[0016] 圖2體現(xiàn)了補(bǔ)骨脂查爾酮可增加大鼠循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量；圖2A是運(yùn)用祖 細(xì)胞標(biāo)志物CD34和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31抗體對大鼠循環(huán)中非紅細(xì)胞實施雙標(biāo)記，使用 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞分化程度；圖2B是對圖2A的統(tǒng)計；其中值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n = 6， 與對照組比較，*P<〇. 05; #P彡0.01;
[0017] 圖3體現(xiàn)了補(bǔ)骨脂查爾酮可改善大鼠缺血性后肢血流恢復(fù)；圖3A是激光散斑血流 成像；圖3B是對圖3A的統(tǒng)計；其中值用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，n = 5,與對照組比較，*P<0.05; 與模型組比較，#P<〇.〇5;
[0018] 圖4體現(xiàn)了補(bǔ)骨脂查爾酮可促進(jìn)大鼠缺血性后肢骨骼肌中內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的毛細(xì) 血管新生和微血管網(wǎng)絡(luò)的再構(gòu)筑；圖4A是⑶34和⑶31雙免疫熒光組織染色切片；圖4B是運(yùn) 用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行統(tǒng)計分析軟件對單位區(qū)域內(nèi)毛細(xì)血管長度實施統(tǒng)計;其中數(shù)值 采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，η = 5，與對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05;
[0019] 圖5體現(xiàn)了補(bǔ)骨脂查爾酮可促進(jìn)受損血管內(nèi)皮的修復(fù)和抑制中膜的增生；圖5A顯 示，在HE染色切片中，與假手術(shù)組比較，模型組頸總動脈血管內(nèi)膜被破壞，血管中膜細(xì)胞增 生，血管壁增厚。然而，補(bǔ)骨脂查爾酮組的大鼠，其內(nèi)膜雖被破壞，但補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)大鼠 血管內(nèi)膜的修復(fù)，抑制血管中膜的細(xì)胞增生；圖5B是圖5A的統(tǒng)計，模型組的血管中膜/內(nèi)膜 面積的比值明顯大于假手術(shù)組，而補(bǔ)骨脂查爾酮組的血管中膜/內(nèi)膜面積比值明顯小于模 型組;其中數(shù)值采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，ri = 5,與假手術(shù)組相比，*P<0.05;與模型組相比，# PS0.05;圖像放大倍率100X ;
【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明人經(jīng)實驗室前期研究發(fā)現(xiàn):補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物可以延緩血管內(nèi)皮細(xì) 胞的衰老，而本發(fā)明人的進(jìn)一步研究又發(fā)現(xiàn):補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物可以促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì) 胞動員，從源頭上增加外周血循環(huán)中EPCs數(shù)量。由此證明補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物可用于 防治各種需要內(nèi)皮祖細(xì)胞參與修復(fù)的疾病。
[0021]如本發(fā)明所用，下列術(shù)語具有如下含義：
[0022]術(shù)語"Bavachalcone"與"補(bǔ)骨脂查爾酮"可互換使用，其英文同義詞還有 "Roussochalcone B"、"Broussochalcone B"等，均指化合物：
[0023] (E)-1-[2,4-Dihydroxy-5-(3-methyl-2-butenyl)phenyl]-3-(4- hydroxyphenyl )-2_propen-1-〇ne【（E)-l_[2,4-二羥基-5-(3-甲基-2-丁烯基）苯基]-3_ (4-羥基苯基)-2-丙烯-I-酮】。
[0024]術(shù)語"C1-C12烷基"是指具有1-12個碳原子的直鏈或支鏈烷基或環(huán)烷基，例如：甲 基、亞甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán) 己基、環(huán)庚基，或類似基團(tuán)。
[0025]術(shù)語"C2-C12烯基"是指具有2-6個碳原子的、具有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈 的烯基或環(huán)烯基，例如：乙烯基、稀丙基、I-丙烯基、異丙烯基、I-丁烯基、2-丁烯基、環(huán)己稀 基、環(huán)庚烯基、1，3-環(huán)己二烯基、1，4-環(huán)己二烯基、或類似基團(tuán)。
[0026]術(shù)語"C2-C12炔基"是指具有2-12個碳原子的、具有一個或多個三鍵的直鏈或支鏈 的炔基，例如：乙炔基、丙炔基、或類似基團(tuán)。
[0027]術(shù)語"C6~C30芳基"是指具有6~30個碳原子的芳基，包括單環(huán)或二環(huán)芳基，例如： 苯基、萘基、或類似基團(tuán)。
[0028]術(shù)語"C1~C30雜芳基"是指具有1~30個碳原子的雜芳基，例如：吡咯基、吡啶基、 呋喃基、或類似基團(tuán)。
[0029] 術(shù)語"取代"是指基團(tuán)上的一個或多個氫原子被選自下組的取代基取代:Cl~ClO 烷基、C3~ClO環(huán)烷基、Cl~ClO烷氧基、鹵素、羥基、羧基(-⑶OH)、C1~ClO醛基、C2~ClO酰 基、C2~ClO酯基、氨基、苯基;所述的苯基包括未取代的苯基或具有1-3個取代基的取代苯 基，所述的取代基選自鹵素、Cl-ClO烷基、氰基、0H、硝基、C3~ClO環(huán)烷基、Cl~ClO烷氧基或 氨基。
[0030] 術(shù)語"藥學(xué)上可接受的"是指適用于人而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài) 反應(yīng)），即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。
[0031] 術(shù)語"藥學(xué)上可接受的鹽"是指所述化合物與藥學(xué)上可接受的無機(jī)酸或有機(jī)酸所 形成的鹽，所述的無機(jī)酸包括:鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸;所述的有機(jī)酸包括：甲酸、乙 酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸（1，5 )、亞細(xì)亞酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、戊酸、二 乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡 糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸。
[0032]術(shù)語"互變異構(gòu)體"是指因分子中某一原子在兩個位置迅速移動而產(chǎn)生的官能團(tuán) 異構(gòu)體，例如:烯醇與相應(yīng)的酮。
[0033] 術(shù)語"立體異構(gòu)體"是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產(chǎn)生的異構(gòu)體，例 如:順反異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、構(gòu)象異構(gòu)體等。
[0034] 術(shù)語"前藥"是指在體外無活性，但能夠在生物體內(nèi)進(jìn)行代謝或化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化為本 發(fā)明的活性成分，從而發(fā)揮其藥理作用的化合物。
[0035] 本發(fā)明的補(bǔ)骨脂查爾酮(Bavachalcone)是屬薔薇目豆科補(bǔ)骨脂(又名:破故紙、婆 固脂、胡韭子）的主要活性成分。2005年由Ming Hong Lee等人首次從補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia)中分離出來，并命名為Bavachalcone，其CAS號為：28448-85-3，分子式為： C20H2QO4，分子量為:324.4，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0036]
[0037] 本發(fā)明的補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物可通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法從中藥補(bǔ)骨脂等植 物中提取獲得，亦可通過商業(yè)途徑購買或者利用市售原料，通過現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)的化合物 合成方法合成獲得。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有公知技術(shù)可以合成本發(fā)明的化合物。 合成的化合物可以進(jìn)一步通過柱色譜法、高效液相色譜法或結(jié)晶等方式進(jìn)一步純化。
[0038] 合成化學(xué)改造、保護(hù)官能團(tuán)方法學(xué)(保護(hù)或去保護(hù))對合成應(yīng)用化合物是很有幫助 的，并且是現(xiàn)有技術(shù)中的公知的技術(shù)，如R.Larock ,Comprehensive Organic TransformationsjVCH Publishers(1989)；T.ff.Greene and P.G.M.ffuts,Protective Groups in Organic Synthesis ,3rd Ed., John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis1John Wiley and Sons(1994)；and L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons(1995)中都有公開。
[0039] 本發(fā)明的補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物可以通過促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化 進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)和/或血管新生，故而其可用于制備促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)和/或血管新 生的藥物或保健品。。
[0040] 本發(fā)明的補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物在組合物或藥物制劑中的含量例如0.0001-50wt% ;較佳的0.001-30wt% ;更加的0.01-20wt%。
[00411治療有效量的本發(fā)明的組合物的用量介于0.001-500mg/kg體重/天之間，任何介 于上述范圍之內(nèi)的用量皆為本發(fā)明的有效量。優(yōu)選的，本發(fā)明的組合物的用量介于0.005-300mg/kg體重/天之間；更優(yōu)選的，本發(fā)明的組合物的用量介于0.01-100mg/kg體重/天之 間。所述的"治療有效量"可用于相關(guān)疾病的單一用藥或聯(lián)合用藥治療。本領(lǐng)域的專業(yè)人員 能夠理解，在實際給藥時的用量可高于或低于上述劑量范圍。針對某一對象(如哺乳動物一 人)的"治療有效量"和具體治療方案可受諸多因素的影響，包括所用化合物或其前藥的藥 效活性、給藥對象的年齡、體重、一般情況、性別、飲食、給藥時間、疾病易感性、疾病進(jìn)程以 及治療醫(yī)師的判斷等。所述"治療"指的是給予機(jī)體(含有肥胖、具有肥胖的癥狀、或者具有 肥胖的前兆)本發(fā)明的補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物，以治療、減輕、減緩、改變、治愈、影響、改 善其疾病、疾病的癥狀或疾病的前兆。
[0042]本發(fā)明的補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物或其組合物或其藥物制劑可以通過口服、靜脈 內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻腔內(nèi)、直腸內(nèi)等途徑給藥。固體載體如:淀粉、乳糖、磷酸二醇、微晶纖維 素、黑糖和白陶土，而液態(tài)載體如:無菌水、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油（如玉 米油、花生油和芝麻油），只要適合活性成分的特性和所需要的特定給藥方式。在制備藥物 組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，如，調(diào)味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生 素E、維生素C、BHT和BHA。
[0043] 本發(fā)明的補(bǔ)骨脂查爾酮及其類似物也可胃腸外或腹腔內(nèi)給藥。也可在適當(dāng)混合有 表面活性劑(如羥丙基纖維素）的水中制備這些活性化合物(作為游離堿或藥學(xué)上可接受的 鹽）的溶液或懸浮液。還可在甘油、聚乙二醇及其在油中的混合物中制備分散液。在常規(guī)儲 存和使用條件下，這些制劑中含有防腐劑以防止微生物的生長。
[0044] 適用于注射的藥物形式包括:無菌水溶液或分散液和無菌粉（用于臨時制備無菌 注射液或分散液）。在所有情況中，這些形式必須是無菌的且必須是流體以易于注射器排出 流體。在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染和影 響。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有如水、醇、它們的適當(dāng)混合物和植物油。
[0045] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所 建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計。
[0046] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載的內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。本 文所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0047] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本專利說明書所揭 示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似 特征的一般性例子。
[0048] 實施例1.補(bǔ)骨脂查爾酮體外促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞分化的作用
[0049] 1.1目的：在細(xì)胞培養(yǎng)的狀態(tài)下，觀察補(bǔ)骨脂查爾酮是否具有促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向內(nèi) 皮祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用。
[0050] 1.2實驗材料：
[0051 ] 1.2.1試劑
[0052]補(bǔ)骨脂查爾酮單體購自上海友思生物科技有限公司（上海市寶山區(qū)月羅路566 號），其純度高于99.8 % ; GBM-2培養(yǎng)基購自美國Lonza公司；白細(xì)胞分離液Histopaquc?-1083、Triton-100、明膠購自美國Sigma公司；抗體：CD34(abl85732)、vWF(ab6994)、驢來源 抗兔IgG抗體(abl50073、FITC標(biāo)記熒光)購自美國Abcam公司；鏈霉素和青霉素，美國Life公 司；
[0053] 1.2.2實驗動物
[0054] SD大鼠，雄性，體重(230~270g)，適齡、健康。購自上海西普爾-必凱實驗動物有限 公司，動物許可證號：SYXK(滬）2013-0058。動物飼料輻照鼠料來源于上海仕林生物科技有 限公司，飼料生產(chǎn)許可證:滬飼審(2008) 04031。
[0055] 1.2.3實驗儀器
[0056] 手術(shù)器械(手術(shù)剪、彎鉗、直鉗和咬骨鉗等），上海宇昊生物科技有限公司；生物安 全柜(Delta series)、C02細(xì)胞培養(yǎng)箱(HEPA CLASS 100)美國Thermo公司；細(xì)菌超凈臺（BJ-1⑶），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；焚光顯微鏡，日本Olympus公司；流式細(xì)胞儀，美 國Beckman Coulter公司；常溫離心機(jī)：100mm、60mm和30mm培養(yǎng)皿，離心管等，購自德國 Geriner 公司。
[0057] 1.3實驗方法：
[0058] 1.3.1分離及鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞
[0059] 1.3.1.1采用密度梯度離心法提取大鼠骨髓中的干細(xì)胞。
[0060] 1.3.1.1.1提取細(xì)胞前準(zhǔn)備工作：
[0061] 將實驗過程所涉及的手術(shù)器械高壓蒸汽滅菌處理;將EGM-2中的多種細(xì)胞因子及 血清加入到EBM-2培養(yǎng)基中并向培養(yǎng)基中加入雙抗(每I OOml體積的培養(yǎng)基，加入1ml體積的 雙抗）；PBS做高壓蒸汽滅菌處理，待其冷卻后加入雙抗(每100mL體積的roS，加入1ml體積的 雙抗）；用純水配置0.5%的明膠高壓蒸汽滅菌，冷卻后加入雙抗(每100mL體積的明膠，加入 Iml體積的雙抗）。1.3.1.1.2提取骨髓干細(xì)胞：
[0062]將體重為250±20g的SD雄性大鼠脫頸椎處死，并將其浸泡在75%的乙醇中10分 鐘；將其轉(zhuǎn)移到超凈臺中，并取出大鼠的股骨和脛骨，浸泡在含有適量I3BS的IOOmm培養(yǎng)皿 中，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到生物安全柜中；用PBS清洗骨兩次，用咬骨鉗去掉兩端骨垢，用IOml注射 器吸取PBS將骨腔中的骨髓沖出至50ml離心管中；1000 rpm室溫離心5min，離心后棄去上清， 加入3ml的PBS吹打混勻;在15ml離心管中加入5ml白細(xì)胞分離液，然后將3ml含有骨髓的PBS 緩慢轉(zhuǎn)移至該含有白細(xì)胞分離液的離心管中（將離心管傾斜，緩慢的將含有白細(xì)胞的混懸 液加入到離心管中，使其位于白細(xì)胞分離液的上層）；1500rpm室溫離心30min(調(diào)整離心機(jī)， 使離心機(jī)緩慢降速，不得使用制動降速），離心結(jié)束后，離心管中的液體分為五層:最上層為 脂肪細(xì)胞層，第二層為PBS，中間為白細(xì)胞層，下面倒數(shù)第二層為白細(xì)胞分離液層，最后為紅 細(xì)胞層；取中間白細(xì)胞層（約2ml)至15ml離心管中，向其中加入IOml的PBS，吹打混勻， 1000 rpm室溫離心5min;離心結(jié)束后，棄去上清，并加入IOml的PBS，吹打混勾，1000 rpm室溫 離心5min;棄去上清，加入適量EBM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)，以107個/IOOmm培養(yǎng)皿的數(shù)量 將細(xì)胞鋪到IOOmm的培養(yǎng)皿中，放在37°C，5%C0 2飽和濕度下培養(yǎng)。
[0063] 1.3.1.1.3分離骨髓干細(xì)胞：
[0064] 首先將0.5%的明膠鋪制60mm(或30mm)的培養(yǎng)皿中，每皿加600μ1 (或200μ1)，放在 37°C，5%C02飽和濕度孵育30min;使用前棄去明膠，并用PBS清洗培養(yǎng)皿一次。收集前一天 提取培養(yǎng)的白細(xì)胞的上層未貼壁的上層懸浮液，1000 rpm室溫離心5min;棄去上清液，加入 適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以4.0-6.0 X 106個/60mm培養(yǎng)皿的數(shù)量將細(xì)胞鋪到60mm用明膠包被 好的培養(yǎng)皿中（或以1.0-1.5 X 106個/30mm培養(yǎng)皿的數(shù)量將細(xì)胞鋪到30mm用明膠包被好的 培養(yǎng)皿中）；放在37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng);將分離好的干細(xì)胞培養(yǎng)7天，并分別于第4天、6 天加入1ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天。
[0065] 1.3.1.1.4干細(xì)胞分化培養(yǎng)：
[0066]將分離得到的干細(xì)胞鋪到六孔板或30mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，于第1天、4天和第7天記錄 EPCs的形態(tài)，并于第7天進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光實驗，鑒定所分化的細(xì)胞。免疫熒光實驗過程如 下：首先棄去培養(yǎng)基并用I3BS洗3次，每次Imin;然后每孔/皿加入200μ1 4%多聚甲醛固定 20min，PBS洗3次，每次Imin;再然后每孔/皿用200μ1 0 · 3 % Triton X-100室溫透化15min， PBS洗3次，每次3min;每孔/皿加入200μ1 10 %的FBS室溫封閉Ih;棄去封閉液，向每孔或每 皿加入用10%FBS(PBS作為溶劑)稀釋的一抗，4°C過夜;PBS洗3次，每次5min;避光條件下加 入用10%FBS(roS作為溶劑）稀釋的熒光二抗200μ1孵育lh，避光條件下用I 3BS洗3次，每次 5min;避光加入100ng/ml天API(PBS作為溶劑)復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光15min，避光條件下用 PBS洗3次，每次5min;加入200μ1的PBS，短時間內(nèi)用熒光顯微鏡拍照。
[0067] 1.3.1.2配藥和分組
[0068] 配藥:在正常培養(yǎng)基中加入母液為5mM的補(bǔ)骨脂查爾酮，使得補(bǔ)骨脂查爾酮的終濃 度為依次為1μΜ、2μΜ和4μΜ。將分離得到的干細(xì)胞鋪到60mm的培養(yǎng)皿中，分為四組:control 組，補(bǔ)骨脂查爾酮低濃度、中濃度和高濃度組(低、中和高三組濃度分別為：1、2和4μΜ)，用正 常培養(yǎng)基或含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，每天統(tǒng)計細(xì)胞集落數(shù)，培養(yǎng)7天后收集細(xì)胞。
[0069] 1 · 3 · 1 · 3細(xì)胞集落數(shù)統(tǒng)計
[0070] 培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞7天，并分別于第1、4和7天鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及統(tǒng)計細(xì)胞集落數(shù)。 細(xì)胞集落數(shù)，即骨髓干細(xì)胞分化成EPCs時，由單個細(xì)胞形成的細(xì)胞集落，可以直接表示骨髓 中能夠分化為EPCs的細(xì)胞數(shù)量。
[0071] 1.3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測EPCs細(xì)胞數(shù)量
[0072]用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞，以CD34和CD31作為標(biāo)記物，檢測不同組別的EPCs向ECs的 分化程度。
[0073] 1.3.2.1流式細(xì)胞儀上機(jī)前準(zhǔn)備：
[0074] (1)收集細(xì)胞，將培養(yǎng)基中的上清液收集到15ml離心管中，用PBS清洗培養(yǎng)皿一次， 將PBS收集到15ml離心管中，在向每個培養(yǎng)皿中加入1ml 0.05 %的胰酶，放入37°C細(xì)胞培養(yǎng) 箱中消化l_2min，加入3ml正常培養(yǎng)基終止消化，將消化液轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，1000 rpm室 溫離心3min;
[0075] (2)棄去上清，加入適量I3BS重懸細(xì)胞，1000 rpm室溫離心3min;棄去上清，加入1ml PBS，重懸細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到1.5ml Ep管中，1000 rpm室溫離心3min;
[0076] (3)棄去上清，每管加入1ml含10%FBS的PBS，4°C孵育20min后計數(shù)，依抗體說明書 按比例加入流式抗體CD34，4°C避光孵育Ih，1000 rpm室溫離心3min，棄去上清;加入1ml PBS 混懸細(xì)胞，1000 rpm 4°C離心3min，棄去上清，重復(fù)2次;每管加入1ml含10%FBS的PBS，按比 例加入流式抗體〇)31，避光孵育111，1000印1114°(：離心31^11，棄去上清 ;加入11111?83混懸細(xì) 胞，1000 rpm 4°C離心3min，棄去上清，重復(fù)2次;加入300μ1 PBS重懸細(xì)胞，200目篩網(wǎng)過濾， 上機(jī)檢測。
[0077] 1.3.2.2流式細(xì)胞儀檢測：
[0078] 使用紅色熒光的藻紅蛋白標(biāo)記的抗⑶34抗體[IC0-115]顯示內(nèi)皮祖細(xì)胞的，和綠 色熒光的FI TC標(biāo)記的抗⑶31抗體[TLD-3 A12 ]顯示內(nèi)皮細(xì)胞。使用美國貝克曼公司的Quan ta SC MPL型流式細(xì)胞儀檢測內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)。
[0079] 1.4實驗結(jié)果
[0080]補(bǔ)骨脂查爾酮體外促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化。不同濃度的補(bǔ)骨脂查爾酮刺激大鼠股 骨骨髓由來的干細(xì)胞，伴隨培養(yǎng)日期的增加，體外培養(yǎng)骨髓干細(xì)胞由圓形分化形成貼壁的 細(xì)胞集落(見表1);運(yùn)用祖細(xì)胞標(biāo)志物CD34和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF抗體做的定性細(xì)胞熒 光免疫染色顯示集落內(nèi)細(xì)胞呈現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的特征。運(yùn)用內(nèi)皮祖 細(xì)胞標(biāo)志物CD34和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31雙抗體標(biāo)記，在流式細(xì)胞儀上的檢測結(jié)果顯示 補(bǔ)骨脂查爾酮在體外促進(jìn)大鼠骨髓干細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)分化(見 表2)。
[0081 ]表1補(bǔ)骨脂查爾酮在體外促進(jìn)骨髓干細(xì)胞分化和增加細(xì)胞集落數(shù)
[0085] 1.5小結(jié)：
[0086] 在正常的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，補(bǔ)骨脂查爾酮能夠促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向內(nèi)皮祖細(xì)胞 (EPCs)和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)分化(圖1)。
[0087] 實施例2.補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)大鼠循環(huán)血液中內(nèi)皮祖細(xì)胞的動員
[0088] 2.1目的:觀察補(bǔ)骨脂查爾酮是否能夠促進(jìn)大鼠循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞的增加。
[0089] 2.2實驗材料：
[0090] 2.2.1試劑
[0091] 補(bǔ)骨脂查爾酮單體購自上海友思生物科技有限公司（上海市寶山區(qū)月羅路566 號），其純度高于99 · 8 % ; GBM-2培養(yǎng)基購自美國Lonza公司；白細(xì)胞分離液此_1叫11沙-1083、Tr i ton-100、明膠、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)購自美國Sigma公司；抗體：CD34 (abl87284) XD3Kab33858)購自美國Abcam公司。
[0092] 2.2.2實驗動物
[0093] Wistar大鼠，雄性，8周齡，健康。購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許 可證號：SYXK(滬）2013-0058。動物飼料輻照鼠料來源于上海仕林生物科技有限公司，飼料 生產(chǎn)許可證:滬飼審（2008)04031。
[0094] 2.2.3實驗儀器
[0095] 手術(shù)器械(手術(shù)剪、彎鉗、直鉗和咬骨鉗等），一次性注射器等，上海宇昊生物科技 有限公司；
[0096] 細(xì)菌超凈臺（BJ-ICD)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；流式細(xì)胞儀，美國 Beckman Coulter公司；超速冷凍離心機(jī)Centrifuge 5810R，德國Eppen天orf公司。
[0097] 2.3實驗方法
[0098] 2.3.1血液白細(xì)胞分離
[0099]將8周齡Wistar雄性大鼠按照體重隨機(jī)分為兩組，空白對照組(Control)和補(bǔ)骨脂 查爾酮給藥組(3mg/kg)。補(bǔ)骨脂查爾酮用0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)乳化分散劑溶 液混懸，灌胃給藥三周?？瞻讓φ战M給予0.5%的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)乳化分散劑溶 液。三周后，大鼠用20 %烏拉坦（140mg/kg)的劑量麻醉，從腹主動脈取血，加入抗凝劑 (0.3 %檸檬酸鈉，以檸檬酸鈉體積:血液體積=1:9的比例加到血中），分離白細(xì)胞。
[0100] 在抗凝過的血液中以1:1的比例緩慢加入到含有等體積的白細(xì)胞分離液的15ml離 心管中（將離心管傾斜，然后將血液緩慢加入到分離液的上層），1500rpm室溫離心30min，細(xì) 胞將分為三層，上層為血漿，中層為白細(xì)胞層，最下層為紅細(xì)胞層;將白細(xì)胞層取出（約2ml) 轉(zhuǎn)移到新的15ml離心管中，向其中加入IOml PBS 1200rpm室溫離心5min，棄去上清液;然后 每管加入4ml PBS 1200rpm室溫離心5min，棄去上清，加入1ml PBS，轉(zhuǎn)移到1.5ml Ep管中， 1200rpm室溫離心5min。收集細(xì)胞，做流式細(xì)胞術(shù)，檢測其中所含有的EPCs的百分含量。
[0101] 2 · 3 · 2流式細(xì)胞儀檢測操作同1 · 3 · 2。
[0102] 2.4實驗結(jié)果：
[0103]補(bǔ)骨脂查爾酮增加Wistar大鼠循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量。對正常8周齡的Wistar 大鼠灌胃給與補(bǔ)骨脂查爾酮3mg/kg體重/天。3周后，使用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠循環(huán)中 血液中內(nèi)皮組細(xì)胞(EPCs)和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的數(shù)量，與對照組比顯著增加(見表3，η = 6)。
[0104] 表3循環(huán)血液中內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)比例（％ ) L0106J 2.5小結(jié)：
[0107] 補(bǔ)骨脂查爾酮(3mg/kg體重)給藥3周能夠促進(jìn)骨髓干細(xì)胞分化，增加大鼠循環(huán)血 液中內(nèi)皮組細(xì)胞(EPCs)和內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)的數(shù)量(圖2)。
[0108] 實施例3.補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)缺血組織的血流恢復(fù)
[0109] 3.1目的:觀察補(bǔ)骨脂查爾酮能否通過增加循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)毛細(xì)血管的新生， 并進(jìn)一步改善缺血肢體的血液循環(huán)。
[0110] 3.2實驗材料：
[0111] 3.2.1試劑
[0112] 補(bǔ)骨脂查爾酮單體購自上海友思生物科技有限公司（上海市寶山區(qū)月羅路566 號），其純度高于99.8% ;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，購自美國Sigma公司；青霉素、烏拉坦、 戊巴比妥鈉，多聚甲醛等，購自國藥。
[0113] 3.2.2實驗動物
[0114] Wi star大鼠，雄性，8周齡，健康。購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許 可證號：SYXK(滬）2013-0058。動物飼料輻照鼠料來源于上海仕林生物科技有限公司，飼料 生產(chǎn)許可證:滬飼審（2008)04031。
[0115] 3.2.3實驗儀器
[0116] 手術(shù)器械(手術(shù)剪、彎鉗、直鉗和咬骨鉗等），縫合線等，上海宇昊生物科技有限公 司;激光多普勒散斑血流儀，瑞典Perimed公司；
[0117] 3.3實驗方法：
[0118] 3.3.1大鼠后肢缺血模型的建立
[0119] 將8周齡Wistar雄性大鼠按照體重隨機(jī)分為五組，假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)骨脂查爾 酮低劑量組（〇.75mg/kg)、補(bǔ)骨脂查爾酮中劑量組（1.5mg/kg)、補(bǔ)骨脂查爾酮高劑量組 (3mg/kg)，每組六只。術(shù)前前一天禁食不禁水;并將手術(shù)中所涉及到的手術(shù)器械及生理鹽水 做高壓蒸汽滅菌處理;補(bǔ)骨脂查爾酮用0.5%的羧甲基纖維素鈉 (CMC-Na)乳化分散劑溶液 混懸。假手術(shù)組和模型組給予〇. 5 %的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)乳化分散劑。
[0120]將大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的戊巴比妥鈉以30mg/kg體重的劑量腹腔注射，將大鼠麻 醉;大鼠麻醉后在兩側(cè)后肢至腹股溝處備皮，然后放在恒溫墊上保溫10分鐘；
[0121] 將大鼠腹部向下固定于黑色不吸光的鼠板上，并將后肢后腳掌伸展開，用透明膠 帶固定住，然后用激光多普勒血流儀測其兩側(cè)后肢一一后腳掌處的血流變化，作為術(shù)前基 準(zhǔn)值；
[0122] 測完血流灌注量后，在大鼠兩側(cè)后肢近腹股溝處開一小口，分離出股動脈，其中所 有組的左后肢均做假手術(shù)，即只分離出股動脈，不做任何處理，然后縫合傷口；右后肢(除假 手術(shù)組外，假手術(shù)組右后肢亦作假手術(shù))做缺血手術(shù)，即分離出股動脈，在股動脈兩端結(jié)扎， 并離斷中間血管層，然后逐層縫合肌肉組織和皮膚;縫合完成后在傷口處，用青霉素(40萬 單位)沖洗傷口；
[0123] 將手術(shù)完成的大鼠置于保溫墊上恢復(fù)10分鐘，然后將大鼠固定在黑色不吸光的鼠 板上，將兩后肢后腳掌伸展開，測其血流量變化;待大鼠蘇醒后，給予少量飲水，第二天給予 飲食；
[0124] 術(shù)后第二天蘇醒后按照組別灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組給予按體重給予同體積 的0.5%CMC-Na溶液，給藥14天;在術(shù)后第1、4、7、10和14天上午用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉， 測其后肢血流量;給藥14天后將大鼠用20%烏拉坦(0.7ml/100g)，取大鼠后肢骨骼肌，保存 在10%中性福爾馬林中。
[0125] 3.3.2測定大鼠后肢血流量
[0126] 將大鼠按照先前所述固定好，打開電腦主機(jī)，打開軟件，待探頭后面指示燈不閃爍 時，表明機(jī)器運(yùn)行穩(wěn)定，可以使用；
[0127] 調(diào)整探頭，使得探頭距離測量后肢腳掌10厘米處(每次測量時均將探頭距離后肢 腳掌調(diào)整為10厘米），調(diào)節(jié)軟件上的監(jiān)控面積，使監(jiān)控范圍為5厘米X 5厘米大?。?br>[0128] 待軟件顯示血流穩(wěn)定后，開始測量后肢血流，測量時間為30秒-1分鐘，測量結(jié)束 后，選擇血流穩(wěn)定區(qū)域15秒即可，選擇所關(guān)注的區(qū)域，圈出所關(guān)注的腳掌區(qū)域（左右后肢的 框大小一樣，前后的框大小亦應(yīng)相同），取出所關(guān)注區(qū)域內(nèi)在穩(wěn)定區(qū)域時間內(nèi)的平均血流 量，輸出數(shù)據(jù)。以右后肢血流量(手術(shù)端)比左后肢血流量(假手術(shù)端)相比，作為大鼠后肢的 相對血流灌注量。
[0129] 3.4實驗結(jié)果：
[0130]補(bǔ)骨脂查爾酮改善Wistar大鼠缺血性后肢血流。將正常8周齡Wistar大鼠隨機(jī)分 為假手術(shù)組、模型組和補(bǔ)骨脂查爾酮組。補(bǔ)骨脂查爾酮灌胃給藥3mg/kg/天。給藥14天，使用 PeriCam PSI激光散斑血流成像儀檢測其術(shù)前、術(shù)后10分鐘、術(shù)后14天的血流量，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨 脂查爾酮組與模型組比較，顯著性地促進(jìn)缺血性的血流恢復(fù)。
[0131 ]表4補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)缺血組織的血管重建和血流恢復(fù)
[0133] 3.5 小結(jié)
[0134] 補(bǔ)骨脂查爾酮給藥14天(3mg/kg體重)促進(jìn)缺血后肢的血管新生和血管修復(fù)，誘導(dǎo) 血液循環(huán)的重建（圖3)。
[0135] 實施例4.補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)缺血組織中內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的增加和毛細(xì)血管新生
[0136] 4.1 目的：
[0137] 觀察補(bǔ)骨脂查爾酮能否促進(jìn)缺血組織內(nèi)的源于內(nèi)皮祖細(xì)胞的毛細(xì)血管的新生。
[0138] 4.2實驗材料：
[0139] 4.2.1試劑
[0140]補(bǔ)骨脂查爾酮單體購自上海友思生物科技有限公司（上海市寶山區(qū)月羅路566 號），其純度高于99.8 % ;羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)，均購自美國Sigma公司；抗體CD34 (abl85732)、CD31(abll9339);綠色熒光 Alexa F 丨 uori'. 488 標(biāo)記的抗小鼠 I gG 抗體 (abl50073)，紅色熒光Alexa Fluori)647標(biāo)記的抗兔IgG IgG H&L等;美國Abeam公司。
[0141] 4.2.2實驗動物
[0142] Wistar大鼠，雄性，8周齡，健康。購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許 可證號：SYXK(滬）2013-0058。動物飼料輻照鼠料來源于上海仕林生物科技有限公司，飼料 生產(chǎn)許可證:滬飼審（2008)04031。
[0143] 4.2.3實驗儀器
[0144] 手術(shù)器械(手術(shù)剪、彎鉗、直鉗和咬骨鉗等），上海宇昊生物科技有限公司；熒光顯 微鏡，日本Olympus公司。
[0145] 4.3實驗方法：
[0146] 4.3.1大鼠后肢缺血模型的建立
[0147] 同3.3.1方法相同。
[0148] 4.3.2肌肉組織的免疫熒光染色
[0149] 從實施例3的大鼠的后肢中，取缺血或相應(yīng)部位肌肉組織，實施石蠟包埋、切片、用 抗CD34和CD31抗體免疫紅綠雙熒光染色，并用細(xì)胞核被染料DAPI染成藍(lán)色確定切片細(xì)胞的 位置。熒光顯微鏡下拍照，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件測試和統(tǒng)計毛細(xì)血管長度。
[0150] 4.4實驗結(jié)果：
[0151] 補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)Wistar大鼠缺血性后肢骨骼肌內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的再構(gòu)筑。與實 施例3相同動物造模實施方法和給藥劑量，取實驗動物后肢手術(shù)部位骨骼肌做制作石蠟切 片，并實施⑶34和⑶31雙免疫熒光組織染色。通過熒光顯微鏡和運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析和計算毛細(xì)血管長度(見表5，n = 5)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)損傷組織內(nèi)毛細(xì)血管 網(wǎng)絡(luò)的再構(gòu)筑，⑶34和⑶31雙免疫熒光標(biāo)記的毛細(xì)血管長度顯著高于假手術(shù)組和手術(shù)模型 組。
[0152]表5每個切片視野毛細(xì)血管總長度(μπι)
[0154] 4.5小結(jié)
[0155] 補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)⑶34和⑶31雙免疫熒光標(biāo)記的毛細(xì)血管長度顯著增加，并占組 織中毛細(xì)血管的大多數(shù)，表明內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是缺血組織中血管新生的主要來源（圖4)。
[0156] 實施例5.補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)受損血管內(nèi)皮的修復(fù)和抑制血管內(nèi)膜的增生
[0157] 5.1 目的：
[0158] 觀察補(bǔ)骨脂查爾酮能否促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞對血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)。
[0159] 5.2實驗材料：
[0160] 5.2.1試劑
[0161] 補(bǔ)骨脂查爾酮單體購自上海友思生物科技有限公司（上海市寶山區(qū)月羅路566 號），其純度高于99.8%;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，購自美國Sigma公司。
[0162] 5.2.2實驗動物
[0163] 自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously hypertensive rats，SHR)，雄性，8周齡，健 康。購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物許可證號：SYXK(滬）2013-0058。動物飼 料輻照鼠料來源于上海仕林生物科技有限公司，飼料生產(chǎn)許可證:滬飼審（2008)04031。SHR 大鼠在上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)至40周齡用于動物實驗。
[0164] 5.2.3實驗儀器
[0165] 手術(shù)器械（手術(shù)剪、彎鉗、直鉗和咬骨鉗等）購自上海宇昊生物科技有限公司。 Fogarty動脈取栓導(dǎo)管（型號120602F)，購自美國愛德華生命科學(xué)公司。
[0166] 5.3實驗方法：
[0167] 5.3.1球囊損傷法頸動脈內(nèi)皮損傷模型的建立
[0168] 將40周齡SHR雄性大鼠隨機(jī)分為三組，假手術(shù)組、模型組和補(bǔ)骨脂查爾酮給藥 (3mg/kg)組。戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后，應(yīng)用球囊損傷法制備頸動脈內(nèi)皮損傷模型。沿 頸前正中線切開皮膚，暴露左頸總動脈及頸內(nèi)外動脈。頸總動脈近心端暫時阻斷血流，分離 出頸外動脈，在其近心端和遠(yuǎn)心端各穿絲線待用。自頸外動脈向近心端插入前端攜帶球囊 的Fogarty取栓導(dǎo)管（120602F型）至頸總動脈起始部。用注射器給取栓導(dǎo)管的球囊注入 0.2mL生理鹽水，使球囊末端膨脹維持壓力，緩慢回拉導(dǎo)管至平切口處，再次插入球囊，上述 過程進(jìn)行三次。然后取出球囊，經(jīng)頸外動脈開口處近心端位置結(jié)扎，逐層縫合肌肉層及皮 膚。用青霉素40萬單位沖洗傷口。假手術(shù)組切開頸外動脈而不插入球囊，其余手術(shù)步驟與手 術(shù)組和補(bǔ)骨脂查爾酮給藥組相同。
[0169] 5.3.2動物給藥
[0170] 術(shù)后第二天開始給藥，每日給予補(bǔ)骨脂查爾酮(3mg/kg )，采用灌胃給藥的方式;假 手術(shù)組和手術(shù)組給予0.5%的CMC-Na乳化分散劑。持續(xù)給藥10天。解剖術(shù)前禁食12h，自由飲 水。麻醉和解剖動物，取包含頸總動脈血管的組織，經(jīng)含肝素的生理鹽水沖洗后，于液氮中 保存。
[0171] 5.3.3組織 HE染色
[0172] 將含頸總動脈的組織制作冰凍切片，實施HE染色。用ImageJ Pro-Plus統(tǒng)計血管內(nèi) 膜和中膜面積。計算血管中膜與內(nèi)膜的比值，數(shù)值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。
[0173] 5.4實驗結(jié)果
[0174] 與假手術(shù)組比較，模型組頸總動脈血管內(nèi)膜被破壞，血管中膜細(xì)胞增生，血管壁增 厚，中膜/內(nèi)膜面積的比值明顯大于假手術(shù)組。而補(bǔ)骨脂查爾酮組的大鼠，其內(nèi)膜雖被破壞， 但補(bǔ)骨脂查爾酮促進(jìn)大鼠血管內(nèi)膜的修復(fù)，抑制血管中膜的細(xì)胞增生，血管中膜/內(nèi)膜面積 比值明顯小于模型組(見表6)。
[0175] 表6補(bǔ)骨脂查爾酮抑制頸總動脈損傷(血管中膜/內(nèi)膜面積比值）
[0177] 5.5小結(jié)
[0178] 補(bǔ)骨脂查爾酮通過誘導(dǎo)循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞增加而促進(jìn)損傷血管的修復(fù)和抑制血 管中膜的增生(圖5)。
[0179]本發(fā)明所涉及的多個方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神 之前提下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可對其進(jìn)行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請 所附權(quán)利要求的覆蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種活性成分的用途，所述活性成分為具有式（I)結(jié)構(gòu)的化合物，或其藥學(xué)上可接受 的鹽、互變異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或前藥，其中，Ri、R2、R3、R4、Rs、R6、R?、Rs 和 R9 各自獨立地選自下組：氨、ORa、OCOORa、OCONfoi 化、 OS化Ra和OSOsRa;所述Ra和化各自獨立地選自下組:氨、取代或未取代的Cl-Cl 2烷基、取代的 或未取代的C2-C12締基、取代的或未取代的C2-C12烘基、取代或未取代的C6-C30芳基，和取 代或未取代的C1-C30雜芳基； 其特征在于，所述活性成分用于制備促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)和/或血管新生的藥物或保健 品。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述Ri選自氨、徑基或烷氧基，R2、化、R6各自獨 立選自氨，R3選自徑基或烷氧基，R4、Rs、R9各自獨立選自氨或徑基，R?選自徑基。3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述活性成分選自下列化合物：b·4. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述活性成分通過促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向內(nèi)皮祖 細(xì)胞分化進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)和/或血管新生。5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)和/或血管新生的藥 物或保健品可用于防治需要內(nèi)皮祖細(xì)胞參與修復(fù)的疾病，所述疾病選自：高血壓、動脈粥樣 硬化、冠屯、病、糖尿病、屯、肌梗塞、腦梗塞、組織缺血或組織創(chuàng)傷。
【文檔編號】A23L33/105GK105963284SQ201610370803
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月30日
【發(fā)明人】許錦文, 凌霜, 倪榮鎮(zhèn)
【申請人】上海中醫(yī)藥大學(xué)