專利名稱：一種新型酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)合微處理技術(shù)、離心流體技術(shù)與酶聯(lián)免疫技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)藥、臨床診斷、食品安全和環(huán)境檢測等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
常用的酶聯(lián)免疫反應(yīng)分析方法(ELISA)在傳統(tǒng)的96孔板上操作，由系列混合、孵育和洗滌過程組成。第一步，將抗體(一抗)加入孔板中，孵育一定時(shí)間以使抗體吸附到固體表面，再洗滌除去未吸附的抗體；第二步，加封閉蛋白溶液占領(lǐng)未被一抗吸附的固體表面，以減少蛋白或抗體的非特異性吸附。第三步，加入樣品或含已知抗原的標(biāo)準(zhǔn)品，孵育一定時(shí)間以促進(jìn)抗原與抗體的結(jié)合。第四步，加入特異酶標(biāo)記的二抗，孵育一定時(shí)間，促進(jìn)二 抗與抗原結(jié)合，并洗滌除去多余的二抗。第五步，加入底物，底物經(jīng)酶催化反應(yīng)產(chǎn)生檢測信號(如顏色或熒光)進(jìn)行檢測。由于每一酶分子可催化大量的底物反應(yīng)產(chǎn)生檢測信號，因此ELISA法檢測靈敏度高。然而，常規(guī)ELISA分析在96孔板上進(jìn)行，為技術(shù)密集型手工操作，不僅操作步驟繁瑣、耗時(shí)長(數(shù)小時(shí)甚至更長時(shí)間)、勞動(dòng)強(qiáng)度大、抗體和試劑消耗大，且結(jié)果誤差大、重現(xiàn)性差，直接導(dǎo)致ELISA檢驗(yàn)費(fèi)用高。目前國內(nèi)市場對酶聯(lián)免疫試劑耗材和自動(dòng)化酶聯(lián)免疫檢測的需求量很大,大型醫(yī)院和研究機(jī)構(gòu)大多從國外進(jìn)口相關(guān)的試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了適應(yīng)大量樣品的檢測，已有機(jī)器人操作的384或1536孔板ELISA，但價(jià)格昂貴，不適于小型企業(yè)和臨床日常檢驗(yàn)。GyroLab 開發(fā)的機(jī)器人光盤酶聯(lián)免疫(Compact disk-Enzyme-l inked immunosorbentassay (⑶-ELISA))芯片因價(jià)格昂貴而限制了其廣泛使用。一套完整的GyroLab工作站價(jià)值$250，000，且該工作站主要用于蛋白藥物早期開發(fā)，還未涉足醫(yī)學(xué)臨床診斷。因此，開發(fā)系列無需機(jī)器人操作、低成本、檢測快速的自動(dòng)酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，是目前最重要的發(fā)展方向。國內(nèi)該領(lǐng)域發(fā)展較慢，目前，尚沒有企業(yè)從事用于酶聯(lián)免疫蛋白檢測的自動(dòng)生化檢測光盤的研究和開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服上述背景技術(shù)的不足，提供一種高效、低廉的酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)將微流體技術(shù)與ELISA結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化的生化檢測光盤系統(tǒng)。其特點(diǎn)是快速，易于操作，試劑和樣品消耗量少，僅需最少的人工操作，可最大程度降低人員操作所帶來的誤差，且無需機(jī)器人。與常規(guī)96孔板相比，將以數(shù)量級的倍數(shù)降低免疫反應(yīng)所需試液體積，檢測時(shí)間，并提高反應(yīng)靈敏度。本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種新型酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，該檢測系統(tǒng)包括酶聯(lián)免疫檢測光盤和檢測裝置兩部分。其中，酶聯(lián)免疫檢測光盤包含微流通道、貯液室和閥門系統(tǒng)。酶聯(lián)免疫檢測光盤制作工藝包括微通道刻痕，閥門超疏水改性，檢測室的表面改性，一抗的吸附與洗滌，光盤粘接和加蓋。檢測裝置由三部分組成旋轉(zhuǎn)臺(tái)，精密的光電倍增管和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)。具體方案包括I)超疏水閥門的改進(jìn)與流速控制；2) 一抗吸附的優(yōu)化；高效率的抗體有序化固定技術(shù)是開發(fā)微量免疫分析的關(guān)鍵所在。3)生物良性芯片的粘；生化檢測光盤的粘接和加蓋應(yīng)密封，無泄漏。所述的超疏水閥門的改進(jìn)采用非晶型的氟聚合物(CYTOP 805A)和聚苯胺納米纖維覆蓋于PMMA表面。所述的一抗的有序化固定采用聚乙烯亞胺PEI為橋接劑，絡(luò)氨酸酶(TR)催化反 應(yīng)，使得抗體有足夠的空間進(jìn)行有序排列并保持良好活性。所述的生化檢測光盤的粘接和加蓋采用間隙鍵合和C02介導(dǎo)鍵合。本發(fā)明提供的新型酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，光盤微流通道比表面積大，體積小，不僅大大減少的抗體和試液的消耗、洗滌和孵育所需時(shí)間大大縮短，且提高了檢測靈敏度，縮短了分析時(shí)間。檢測光盤被固定在離心分析儀上，通過離心力的控制，實(shí)現(xiàn)在一張光盤上完成許多常規(guī)的分析操作如稱量、稀釋、混合、標(biāo)定和分離等，具有制作簡便，流速可控，調(diào)試簡單，在處理大量樣品時(shí)的功能強(qiáng)大等優(yōu)點(diǎn)。底物經(jīng)酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的熒光作通過光電倍增管為主要檢測信關(guān)聯(lián)到電腦，，并且實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)自動(dòng)地被保存在電腦上。實(shí)現(xiàn)了體外診斷的自動(dòng)化，成本低、快速高效、操作簡單、數(shù)據(jù)處理和傳輸方便。本發(fā)明提供的新型酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)將光盤微流體技術(shù)與酶聯(lián)免疫結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)的自動(dòng)化。該檢測系統(tǒng)可作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的臨床檢測手段，用于多種臨床疾病如癌癥、愛滋病、肝病及其他疾病的預(yù)測/診斷/治療監(jiān)測等。可用于乙肝表面抗原(HbsAg)的測定，篩選乙肝病毒通過；通過丙型肝炎病毒(HCV)的測定，篩選丙肝病毒；以及優(yōu)生優(yōu)育五項(xiàng)(TORCH)檢查中的風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、E19微小病毒及弓形體病毒的測定；Y-干擾素的定量測定，監(jiān)測惡性腫瘤的治療效果；通過IgG單克隆抗體的監(jiān)測，評價(jià)器官移植的排異反應(yīng)等；通過愛滋病(HIV-A/HIV-2)多肽EIA的測定，診斷人類免疫缺陷病毒(HIV)，通過L嗜肺軍團(tuán)菌血清組I抗原的測定，以診斷軍團(tuán)病。此夕卜，本檢測系統(tǒng)也可實(shí)現(xiàn)在一張檢測光盤上同時(shí)完成多個(gè)樣品快速蛋白檢測或一個(gè)樣品多個(gè)蛋白指標(biāo)檢測。


圖I.酶聯(lián)免疫生化檢測光盤的設(shè)計(jì)原理圖2用CYTOP-聚苯胺納米纖維方法來改性生物光盤的控制閥區(qū)域從a圖看到?jīng)]有改型的表面，便面光滑，接觸角越是72° ,改性之后(b圖)，表面非常憎水，接觸角越是160。。圖3各個(gè)閥門的臨界速度比較圖4TR催化蛋白A (protein A)為基礎(chǔ)的抗體固定技術(shù)的示意5不同方法固定微流控軌道的生物活性比較圖6(a)食用染料充滿鍵合后的微流芯片通道內(nèi)；(b)微通道鍵合良好的剖面7 (a)酶聯(lián)免疫生化檢測光盤的設(shè)計(jì)示意圖；(b)酶聯(lián)免疫生化檢測光盤的實(shí)物照片圖8酶聯(lián)免疫生化檢測光盤檢測分析系統(tǒng)照片圖9分析儀的得到的線性曲線
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :酶聯(lián)免疫生化檢測光盤的設(shè)計(jì)圖I是酶聯(lián)免疫生化檢測光盤的設(shè)計(jì)原理圖。抗體和抗原放入I和I’試劑槽，標(biāo)記物和基質(zhì)分別放入3號和5號試劑槽，2號和4號試劑槽用于洗液。本發(fā)明設(shè)計(jì)的檢測光盤包含了許多微流設(shè)計(jì)組件，例如，閥門的設(shè)計(jì)，注入孔，試劑槽，檢測區(qū)，以及廢液收集池。一張酶聯(lián)免疫生化檢測光盤可以檢測12、24或48個(gè)樣品，或一張光盤可對I個(gè)樣品進(jìn)行 12、24或48種酶聯(lián)免疫分析檢測。實(shí)施例2 :超疏水閥門的改進(jìn)與流速控制采用非晶型的氟聚合物(CYTOP 805A)和聚苯胺納米纖維覆蓋于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)表面，比較了吸附蛋白前后的接觸角和SEM照片，見圖2。結(jié)果顯示，CYTOP805A-聚苯胺納米纖維改性的PMMA表面呈超疏水性，蛋白吸附對閥門接觸角影響很小(僅由175°降至167° )。加載染料溶液后的快照照片顯示，CYTOP-聚苯胺納米纖維改性的閥門能有效控制液體程序性突釋和流速。與其他商業(yè)化表面改性技術(shù)相比，CYTOP-聚苯胺納米纖維表面改性操作簡單、幾乎無需任何儀器設(shè)備，成本低，改性表面分布均勻，批內(nèi)和批間差異更小，試驗(yàn)重現(xiàn)性更好。比較了各個(gè)閥門的臨界轉(zhuǎn)速，每兩個(gè)閥門之間的臨界轉(zhuǎn)速相差大于300rpm，保證了各個(gè)閥門的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。并且試驗(yàn)值和理論計(jì)算值匹配得很好，結(jié)果見圖3。實(shí)施例3 : —抗吸附的優(yōu)化如示意圖4所示，采用聚乙烯亞胺PEI為橋接劑，絡(luò)氨酸酶(TR)催化反應(yīng)，固定蛋白A于PMMA表面，用于Y-干擾素抗體的檢測。結(jié)果表明，因PEI鏈形成的空間距離，使得抗體有足夠的空間進(jìn)行有序排列并保持良好活性。與傳統(tǒng)戊二醛交聯(lián)法相比，不僅提高了抗體的結(jié)合率和檢測靈敏度(提高了 5-10倍)，而且檢測信號強(qiáng)度提高了 62倍(圖5)。實(shí)施例4 生物良性芯片的粘接微流芯片的的粘接采用間隙鍵合和CO2介導(dǎo)鍵合。間隙鍵合采用紫外光固化樹脂法在塑料微流芯片表面完成復(fù)雜的鍵合方式，并獲得較高鍵合率；且沒有通道變形或外來物質(zhì)污染。從圖6(a)可見，食用染料裝載鍵合后的微流芯片貯液室后，微通道內(nèi)充滿了液體，無泄漏。從圖6(b)的剖面圖可見，微通道鍵合良好，僅可見一層非常薄的樹脂。二氧化碳(CO2)是一種低成本，無毒性，無爆炸性氣體。超臨界CO2是一種具有氣體樣粘度的液體，是一種理想的聚合物溶劑，尤其在微型和納米芯片中。當(dāng)大量CO2溶于聚合物以后，可降低聚合物玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)、粘度和表面張力(如聚合物在熔融狀態(tài))，以促進(jìn)界面的微觀融合；當(dāng)壓力釋放后，CO2易從聚合物基質(zhì)中擴(kuò)散除去。我們成功將該技術(shù)用于聚苯乙烯微通道的PLGA加蓋，結(jié)果表明PLGA內(nèi)層和聚苯乙烯微通道鍵合完好。實(shí)施例5 :基于本酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)開發(fā)的Y -干擾素的檢測試劑盒Y-干擾素的檢測試劑盒，用于監(jiān)測惡性腫瘤的治療效果。以下對常規(guī)酶聯(lián)法和生化光盤檢測法定量測定Y-干擾素進(jìn)行了比較
用傳統(tǒng)96孔板總共需要600微升試劑，耗時(shí)13小時(shí)。用生化檢測光盤僅僅需要40微升試劑，耗時(shí)不到I. 4小時(shí)。(I)試劑用量比較
權(quán)利要求
1.一種新型酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，其特征在于該檢測系統(tǒng)包括酶聯(lián)免疫檢測光盤和檢測裝置兩部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，其特征在于酶聯(lián)免疫檢測光盤包含微流通道、貯液室和閥門系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I和2所述的酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，其特征在于酶聯(lián)免疫檢測光盤制作工藝包括微通道刻痕，閥門超疏水改性，檢測室的表面改性，一抗的吸附與洗漆，光盤粘接和加蓋。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，其特征在于檢測裝置由三部分組成旋轉(zhuǎn)臺(tái)，精密的光電倍增管和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，其特征在于通過超疏水閥門的設(shè)計(jì)與流速控制，控制微芯片上生物試劑按酶聯(lián)免疫步驟程序性釋放。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至3所述的酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，其特征在于采用聚乙烯亞胺為橋接劑，使得抗體有足夠的空間進(jìn)行有序排列并保持良好活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)，其特征在于酶聯(lián)免疫生化光盤的粘接采用紫外光固化樹脂法在塑料微流光盤表面完成復(fù)雜的鍵合。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型酶聯(lián)免疫生化光盤檢測系統(tǒng)。該檢測系統(tǒng)包括酶聯(lián)免疫檢測光盤和檢測裝置兩部分。酶聯(lián)免疫檢測光盤結(jié)合了微處理技術(shù)、離心流體技術(shù)與酶聯(lián)免疫技術(shù)，將微流通道、貯液室和毛細(xì)管閥門系統(tǒng)刻錄于一張?zhí)厥馑芰瞎獗P上，當(dāng)旋轉(zhuǎn)光盤產(chǎn)生的離心力大于閥門處的毛細(xì)管力時(shí)，貯液室的液體按酶聯(lián)免疫操作步驟程序性釋放，完成酶聯(lián)免疫反應(yīng)，其特點(diǎn)是檢測自動(dòng)化，試劑用量少、成本低、快速高效、信號和靈敏度高、操作簡單、數(shù)據(jù)處理和傳輸方便。本系統(tǒng)可應(yīng)用于多種臨床疾病的預(yù)測、診斷、治療監(jiān)測，食品安全評價(jià)及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。
文檔編號G01N35/00GK102967715SQ20121042098
公開日2013年3月13日 申請日期2012年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月25日
發(fā)明者余波, 李利, 何宏燕 申請人:杭州普施康生物科技有限公司