專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基因c型鴨甲型肝炎病毒定性和定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家禽傳染病診斷，具體涉及基因C型鴨甲型肝炎病毒熒光定量RT-PCR方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，由基因C型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-C)引起的鴨病毒性肝炎廣泛流行于韓國(guó)和中國(guó)，該病毒主要侵害3周齡內(nèi)雛鴨，發(fā)病急，病死率高，嚴(yán)重影響?zhàn)B鴨業(yè)的發(fā)展。DHAV-C引起的鴨病毒性肝炎與基因A型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-A)引起的鴨肝炎在流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化等非常相似，只有借助實(shí)驗(yàn)室診斷才能鑒別，病毒分離鑒定是傳染病病原學(xué)診斷的經(jīng)典方法，但該方法至少需要I 2周才能確診，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能滿臨床實(shí)踐中對(duì)傳染病及早診斷、迅速采取有效措施進(jìn)行防治的的需求。RT-PCR作為一種常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)以其快速、靈敏、特異、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于人類(lèi)和多種動(dòng)物病毒病的診斷([l]Pritchard L I, Morrissy C, Van Phuc K, et al. Development of a polymerase chain reaction to detect Vietnamese isolates of duck virus enteritis. [J].Vet Microbiol, 1999,68 (1-2) 149-156. [2]Keramas G, Bang D D, Lund M, et al. Use ofculture,PCR analysis,and DNA microarrays for detection of Campylobacter jejuniand Campylobacter coli from chicken feces. [J]. J Clin Microbiol,2004,42 (9)3985-3991. [3]Lund M, Nordentoft S, Pedersen K，et al. Detection ofCampylobacter spp. in chicken fecal samples by real-time PCR. [J]. JClin Microbiol,2004,42(11) :5125-5132. [4]Identifcation of duck plague virus bypolymerase chain reaction. [J], 1999,43(1) :106_115·)。目前已有 RT-PCR 用于 DHAV-C鴨肝炎的診斷韓國(guó)學(xué)者 Kim 等(Kim MC, Kwon YK, Joh SJ, et al. Differential diagnosisbetween type-specifc duck hepatitis virus type I (DHV-I) and recent KoreanDHV-l-like isolates using a multiplex polymerase chain reaction. [J]. AvianPathology, 2008, 37 (2) : 171-177.)分別針對(duì) DHAV-A 基因組的 DRL-62 基因和 DHAV-C 基因組的AP-04203基因設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物(API 5’ -GTTCCAAATGATGATTATTATG-3’ ；AP2 5，-GGATCTGATTAGTACCAGATAAG-3，； CPI : CCC AY(C 或 T)GTCTAAGTCTTAATGGAT-3，；CP2 :5’ -CTAAAGGTGTCTGTATCCAAGC-3’ )，建立了鑒別診斷 DHAV-A 和 DHAV-C 的雙重 RT-PCR方法，具體操作步驟如下采集疑似鴨肝炎病毒感染鴨的肝臟，用Triol試劑提取總肝臟總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑將肝臟總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，分別擴(kuò)增DHAV-ADRL-62基因的897 1125位點(diǎn)229bp的特異片段和DHAV-CAP-04203基因的204 514位點(diǎn)311bp的特異片段，該方法對(duì)DHAV-C的最低檢出量為IOOpg/反應(yīng)。研究結(jié)果表明，該雙重RT-PCR方法可用于DHAV-A和DHAV-C感染臨床樣本的鑒別診斷。宋永峰等(Levine P P J F. A hitherto-undescribed virus disease of ducks in NorthAmerica [J]. Cornell Vet, 1950 (40) :71-76.)根據(jù) GenBank 中已發(fā)表的 DHAV-C 全基因序列(DQ256134、DQ25613)，在非同源區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物 Pl :5’ -CTGAGAAGCGGGATATTAGT-3’ ；P2 :5’ -AATCAACCTAGACGGGGAAT-3’)，從其臨床分離鑒定的DHAV-C樣本中提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增DHAV-C638bp的基因片段。該學(xué)者建立的RT-PCR方法能特異地檢出DHAV-C，此方法對(duì)DHAV-C的最低檢出量為21pg/反應(yīng)。何冉婭等(Haider SA,Calnek Bff. In vitro isolation,propagation,and characterization of duck hepatitisvirus type III. [J]. Avian Dis，1979，23 (3) :715-729.)根據(jù)GenBank 中已發(fā)表的DHAV-C全基因組序列(DQ256134、DQ25613)，應(yīng)用Primer Primier 5. O設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物(Pl 5’ -TGTGCCTGAGAAGCGGGATA-3’;P2 :5’ -CCGAAAGTGGAGATTAGGTG-3’)，從廣東省采集到的鴨病毒性肝炎病毒感染鴨的肝臟病料中采用Trizol試劑進(jìn)行總RNA的提取，并將提取到的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板擴(kuò)增DHAV_C705bp的基因片段。該學(xué)者建立的RT-PCR方法能特異地檢出DHAV-C，并且此方法對(duì)DHAV-C的最低檢出量為2X103pg/反應(yīng)。另夕卜，本發(fā)明申請(qǐng)的發(fā)明人(黃秋雪，湯承，聶培婷等.鴨甲型肝炎 病毒基因A型和C型雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J],中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34(2) =120-123.)根據(jù)GenBank中公布的DHAV-A和DHAV-C全基因組序列，應(yīng)用Primer Premier5. O軟件，針對(duì)DHAV-A的3C、3D 和 DHAV-C 的 2C 區(qū)域分別設(shè)計(jì)了 2 對(duì)引物(DHAV-A Pl :5’ -GCAATGGCACTATGGGAGC-3’，DHAV-AP2 :5’ -GAGGAGGCTGAAACA-3’ ；DHAV-C Pl :5’ -TCCAACAGGGTCAAAGC-3’，DHAV-C P2 5’ -AACTACTACAAGTCTGCCACG-3’)，擴(kuò)增 DHAV-A (259bp)和 DHAV-C (194bp)的特異性片段，從四川省采集到的鴨病毒性肝炎病毒感染鴨的肝臟病料中提取總RNA，并以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，建立檢測(cè)DHAV-A和DHAV-C的雙重RT-PCR方法。該方法可用于臨床樣本的檢測(cè)，最低檢測(cè)限達(dá)到3.4X10_3pg/反應(yīng)。RT-PCR用于病毒病的診斷雖然具有靈敏度高、快速、特異的特點(diǎn)，但是存在無(wú)法對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量、檢測(cè)通量不高，且存在電泳等PCR后處理過(guò)程，易造成污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性等缺陷，限制了該方法的應(yīng)用。熒光定量PCR(Real-Time RT-PCR, RRT-PCR)方法通過(guò)在反應(yīng)體系中引入熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)和PCR雙放大，不僅大大提高了檢測(cè)的靈敏度，而且不需要電泳等PCR后處理過(guò)程，在反應(yīng)管中一次操作即可完成對(duì)數(shù)十至數(shù)百個(gè)樣本的定性和定量，易于標(biāo)準(zhǔn)化，有效克服了 PCR方法的不足。在傳染病診斷中廣泛應(yīng)用(Mackay I MjArden K E, Nitsche A. Real-time PCRin virology. [J]. Nucleic Acids Res,2002，30(6) : 1292-1305 和 Heid C A, Stevens J,Livak K J,et al. Real time quantitative PCR. [J]. Genome Res,1996,6(10) :986-994.)目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)檢測(cè)DHAV-C的熒光定量PCR方法報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的以上不足，本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)一種基因C型鴨甲型肝炎病毒熒光定量PT-PCR方法，使之能克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，使之能夠有更高的靈敏度以降低漏診率，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的定量檢測(cè)。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下的手段實(shí)現(xiàn)的。一種DHAV-C定性和定量檢測(cè)方法，采用一對(duì)特異性引物，包括上游引物DHAV-CFP (SEQ ID No I)、下游引物 DHAV-C RP (SEQ ID No2);以 cDNA 為模板，進(jìn)行熒光定量 RT-PCR，擴(kuò)增DHAV-C 194bp的特異片段，所述檢測(cè)的最佳反應(yīng)體系為20 μ L，包括SYBR Green Imaster mix 10 μ L ;上下游引物各0. 4 μ L ;cDNA模板2 μ L,補(bǔ)充去離子水至20 μ L ;采用的反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性3min ;95°C變性15s ;60°C退火31s，進(jìn)行30個(gè)以內(nèi)循環(huán)，得到Ct值，即可用于DHAV-C感染的定性；由預(yù)先建立的的熒光定量RT-PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方程獲得所檢測(cè)病毒的荷載量。采用本發(fā)明的方法，建立的熒光定量RT-PCR對(duì)DHAV-C的核酸最低檢測(cè)限可達(dá)到
3.4X KT4Pg/反應(yīng)，靈敏度更高，比Kim、宋永峰、何冉婭三位學(xué)者建立的RT-PCR對(duì)DHAV-C的檢測(cè)的靈敏度分別高了 2. 9 X IO5倍、6. 2 X IO4倍、5. 9 X IO6倍，比本發(fā)明人先前建立檢測(cè)DHAV-A和DHAV-C的雙重RT-PCR方法的靈敏度也提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，這保證了本發(fā)明方法可直接用于臨床樣本檢測(cè)，DHAV-C感染進(jìn)行定性和定量，與現(xiàn)有方法相比，檢出率高，可大大降低漏診率。
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。I、主要試劑普通PCR試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、pMD 19-T Vector、Amp、IPTG、X-Gal均購(gòu)自寶生物工程(大連)公司；蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉均購(gòu)自O(shè)xoid公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物有限公司；Trizol RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海博瑞克公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器隔水式恒溫培養(yǎng)箱齊欣公司，中國(guó)上海高速離心機(jī)centrifuge5804, Eppendorf 公司，德國(guó)超純水儀Milli-Q :Mi I Iipore公司，法國(guó)核酸蛋白檢測(cè)儀DU800, Beckman公司，美國(guó)凝膠成像系統(tǒng)Doc2000，Bio-Rad公司，美國(guó)恒溫水浴器國(guó)華電器，中國(guó)江蘇核酸電泳儀PowerpacuniversalTM, Bio-Rad 公司，美國(guó)；PCR 儀my cyclerTM, Bio-Rad 公司，美國(guó)梯度PCR儀=Bio-Rad公司，美國(guó)熒光定量PCR儀7300型，ABI公司，美國(guó)移液器Eppendorf公司，德國(guó)2、引物設(shè)計(jì)和制取根據(jù)20株GenBank登錄的DHAV-C 2C基因序列，米用Primer Premier 5. O軟件，采用NCBI網(wǎng)站BLAST工具對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行檢索，初步驗(yàn)證其特異性。引物序列見(jiàn)下表I。引物由上海生工生物工程公司合成。表I引物信息引物名稱(chēng)引物序列擴(kuò)增位點(diǎn)預(yù)期擴(kuò)增片段火小
PrimersSequence (5r -3J )Amplified lociSize of fragment / bp
上游引物(DHAV-CFP)TCCAACAGGGTCAAAGC.1639 4832194
下游引物(DHAV-C RP)AACTACTACAAGTCTGCCACG
3、熒光定量PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)過(guò)10倍梯度稀釋?zhuān)捎脙?yōu)化好的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。以病毒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可見(jiàn)，本發(fā)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR在1.68X 104 1.68X 109拷貝/ μ L內(nèi)有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)為O. 998，標(biāo)準(zhǔn)方程為Υ=-3. 348Χ+26. 310，擴(kuò)增效率為97. 9%0實(shí)施例I、取16份病死鴨肝臟樣本按I : 3加入滅菌的生理鹽水后勻漿，反復(fù)凍融3次，IOOOOrpm離心15min取上清液，加2000單位/mL雙抗后經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF鴨胚，各接種3枚，O. 2mL/枚；空白對(duì)照組3枚，注射滅菌生理鹽水，O. 2mL/枚。37°C孵育，收獲死亡鴨胚胚體和尿囊液。根據(jù)Invitrogen公司的Trizol說(shuō)明書(shū)提取總RNA, RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)總體系為10 μ L 5 X PrimescriptTMBuffer 2. O μ L, PrimescriptTM RT Enzyme Mix I 0. 5 μ L, Random 6 mers I. 0 μ L, RNA
2.0 μ L，Rnase Free H2O 4. 5 μ L?；靹蚝蠓湃隤CR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C15min，85°C 5s，4°C 5min。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，通過(guò)普通PCR反應(yīng)鑒定這16份病死鴨肝臟樣本為DHAV-C陽(yáng)性。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，使用Applied Biosystems公司熒光定量PCR儀7300型進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為20 μ L :SYBR Green Imaster mix 10 μ L ;取上述已制備的上下游引物各0. 4 μ L ;DNA模板2 μ L,補(bǔ)充去離子水至20 μ L0反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性3min ;95°C變性15s ;60°C退火31s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的熒光定量PCR方法對(duì)已鑒定(病毒分離、普通PCR鑒定)為DHAV-C陽(yáng)性的16份肝臟臨床樣本的檢出率為100% (16/16)。實(shí)施例2采用建立的檢測(cè)DHAV-C的熒光定量PCR方法，對(duì)收集的38份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，有22份臨床樣本為DHAV-C陽(yáng)性。其中I 5號(hào)臨床樣本檢測(cè)的Ct值分別是
3.43,4. 07,9. 00,4. 37,9. 97，代入標(biāo)準(zhǔn)方程 Υ=_3· 348Χ+26. 310，求得 X 的值，再算出 IOx,即可得出對(duì)DHAV-C的定量結(jié)果，依次為6. 8 X IO6拷貝/反應(yīng)、4. 4X IO6拷貝/反應(yīng)、I. 5 X IO5拷貝/反應(yīng)、3. 6 X IO6拷貝/反應(yīng)和7. 6 X IO4拷貝/反應(yīng)。實(shí)施例3將42只3日齡SPF雛鴨，飼養(yǎng)于SPF家禽隔離器內(nèi)，頸部皮下注射DHAV-C，O. 2mL/只，于感染后24h、48h及72h各取3只，頸動(dòng)脈放血處死，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺、法氏囊、胰、腸、腦等組織器官，按照Trizol RNA試劑盒提說(shuō)明書(shū)步驟提組織樣本總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以cDNA為模板，用本發(fā)明方法與本發(fā)明人先前建立檢測(cè)DHAV-A和DHAV-C的雙重RT-PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2
表2 :熒光定量RT-PCR和RT-PCR對(duì)DHAV-C的檢出情況(N = 3)
感染時(shí) ZTTTT *~Sr~inSi~
槍 則萬(wàn)法fc Ik
間(h)臟臟臟 臟臟 囊腺 腺…
~M 本發(fā)明方法 3 3 3 3 3 3 3 I 3
Γ 現(xiàn)有方法00000O0000
48 本發(fā)明方法3 3 3 3 333 3 3 3 現(xiàn)有方法00000I0002 72 本發(fā)明方法3333333 3 3 3 _現(xiàn)有方法0 2 10 0O0 0 0 0由表2可看到，本發(fā)明方法對(duì)DHAV-C陽(yáng)性樣本的檢出率為100% (90/90)，現(xiàn)有技術(shù)的最好條件只能達(dá)到檢出率為6. 7% ￠/90)。本發(fā)明方法具有更為良好的檢測(cè)靈敏度。
權(quán)利要求
1.一種基因C型鴨甲型肝炎病毒定性和定量檢測(cè)方法，采用一對(duì)特異性引物，包括上游引物DHAV-C FP、下游引物DHAV-C RP ；以cDNA為模板，擴(kuò)增194bp的目的片段，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，所述檢測(cè)的最佳反應(yīng)體系為20 μ L，包括SYBR Green I master mix10 μ L ;上下游引物各0. 4μ L ;DNA模板2 μ L，補(bǔ)充去離子水至20 μ L ;反應(yīng)條件為95 °C預(yù)變性3min ;95°C變性15s ;60°C退火31s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，得到Ct值，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢測(cè)樣本的定性檢測(cè)；由預(yù)先測(cè)定的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可獲得所檢測(cè)基因C型鴨甲型肝炎病毒拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)被檢樣本進(jìn)行定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種基因C型鴨甲型肝炎病毒定性和定量檢測(cè)方法，其特征在于所述上游引物DHAV-C FP序列為T(mén)CCAACAGGGTCAAAGC，所述下游引物DHAV-C RP序列為AACTACTACAAGTCTGCCACG，擴(kuò)增位于 DHAV-C 2C 基因 4639 4832 位點(diǎn)的片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述之一種基因C型鴨甲型肝炎病毒定性和定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3. 348Χ+26. 310，X為所測(cè)病毒拷貝數(shù)，Y為Ct值。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基因C型鴨甲型肝炎病毒定性和定量檢測(cè)方法，采用一對(duì)特異性引物，包括上游引物DHAV-C FP、下游引物DHAV-C RP；以cDNA為模板，以優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR，擴(kuò)增位于DHAV-C2C基因4639～4832位點(diǎn)的194bpDHAV-C特異片段，在所述檢測(cè)的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件測(cè)得Ct值，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)DHAV-C的定性；再由預(yù)先建立的熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得所求病毒濃度。本發(fā)明可用于DHAV-C感染的快速診斷，并能對(duì)被檢樣本病毒荷載量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、高通量和易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102827951SQ20121030244
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者湯承, 岳華, 黃秋雪 申請(qǐng)人:西南民族大學(xué)