專利名稱：一種井岡霉素各組分的定性與定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種井R霉素(Validamycin)相關(guān)產(chǎn)品中井R霉素定量檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種井R霉素產(chǎn)品中井R霉素A及相關(guān)組分的定性與定量檢測(cè)方法.可用于井R霉素相關(guān)產(chǎn)品各組分定性與定量檢測(cè)及為生產(chǎn)高品質(zhì)井R霉素產(chǎn)品提供依據(jù)。
背景技術(shù)：
井R霉素(Validamycin)是由吸水鏈球菌井R變種產(chǎn)生的水溶性抗生素葡萄糖苷類(lèi)化合物，分子式C2tlH35O13N,分子量497.51，毒性低，純品為白色無(wú)定型粉末，溶于水、二甲基甲酰胺，微溶于乙醇，不溶于丙酮、苯、乙酸乙酯、等有機(jī)溶劑，吸濕性強(qiáng)，在室溫PH3-9水溶液中穩(wěn)定。井岡霉素主要由井岡霉素A(Validamycin A, VA)、井岡霉素B(ValidamycinB, VM-B)、井岡霉素 C (Validamycin C，VM-C)、井岡霉素 D (Validamycin D, VM-D)、井網(wǎng)霉素 E (Validamycin E, VM-E)、井同霉素 F (Validamycin F，VM-F)、井網(wǎng)霉亞基胺 A(ValidoxylamineA, VxA-A)等組分組成。主要用于防治各類(lèi)紋枯病，對(duì)稻曲病也有效，也可用于防治棉花、瓜類(lèi)立枯病，其有效成分為井R霉素A (ISWA T, KAMEDAY, ASA IM, studieson validamycins, new antibiotics IV[J].Antibiotics.1971，24(2):119-123);VxA_A 是昆蟲(chóng)的海藻糖酶抑制劑，可開(kāi)發(fā)為生物殺蟲(chóng)劑；井網(wǎng)胺和井網(wǎng)霉亞基胺是重要的糖苷霉抑制劑，是合成其他新酶抑制劑類(lèi)降糖藥的重要醫(yī)藥中間體和原藥(金利群，井R霉亞基胺A的制備及其對(duì)海澡糖酶的抑制作用[D]。杭州:浙江工業(yè)大學(xué)，2003.)。井R霉素在我國(guó)已經(jīng)形成了一個(gè)經(jīng)濟(jì)效益較高的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，以井R霉素為原料開(kāi)發(fā)附加值更高的醫(yī)藥品和安全性能更高的生物殺蟲(chóng)劑是十分必要的，具有社會(huì)和經(jīng)濟(jì)雙重效益(上海農(nóng)藥研究所農(nóng)抗組，《井R霉素》[M]，上海人民出版社，1977)。而獲得這些高品質(zhì)的井R霉素需要分離或純化井R霉素各種組分，因此，采用有效的手段對(duì)井R霉素各組分進(jìn)行定性和定量分析具有重要意義。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)井R霉素的定量分析方法有離子交換比色法、薄層熒光法(徐輝，薄層-熒光法測(cè)定井R霉素水劑，上海農(nóng)學(xué)院報(bào)1998，16 (2):148-151.)、液相色譜法(GB/T9553-93)，前兩者只能測(cè)定井R霉素總含量，不能將各組分分離并定量；GB/T9553_93所用的液相色譜法也只能將井岡霉素A分離并定量。日本在檢測(cè)井岡霉素產(chǎn)品中的VA、VM-B, VM-C, VM-D, VM-E, VM-F, VxA-A方面也有相關(guān)報(bào)道，其檢驗(yàn)方法采用100%的20mmol/L磷酸緩沖鹽作為流動(dòng)相，該方法雖然基本能分離井R霉素產(chǎn)品中的不同組分，但是各組分分離效果不夠理想。其不足之處表現(xiàn)為:1、系統(tǒng)壓力高達(dá)200bar以上，隨著檢測(cè)量的增加，壓力會(huì)不斷升高，高濃度高比例的緩沖鹽很容易破壞色譜柱結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致色譜柱壽命極短；2、分析時(shí)間長(zhǎng)達(dá)I小時(shí)，用于大量生產(chǎn)檢驗(yàn)不夠現(xiàn)實(shí)；3、由于時(shí)間長(zhǎng)，峰形變差，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，很容易產(chǎn)生基線飄移，因此會(huì)造成定量不準(zhǔn)確；4、響應(yīng)值小，同樣的進(jìn)樣濃度與進(jìn)樣量，其峰高與峰面積響應(yīng)基本是本發(fā)明的三分之一。本發(fā)明靈敏度高、選擇性好，井岡霉素產(chǎn)品中I VM-B, VM-C, VM-D, VM-E, VM-F, VxA-A均能達(dá)到基線分離；由于流動(dòng)相中加入了 1% (體積比)甲醇作為流動(dòng)相改性劑，緩沖鹽濃度低，因此對(duì)系統(tǒng)壓力、分析時(shí)間、基線飄移、色譜柱的壽命及準(zhǔn)確度方面都有很大改善。所以此方法可以用于井R霉素產(chǎn)品的井岡霉素A及相關(guān)組分的定性與定量檢測(cè)，也可用于井R霉素A及相關(guān)組分的分離、純化與研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種井岡霉素產(chǎn)品中VA及VM-B、VM-C, VM-D, VM-E,VM-F、VxA-A等相關(guān)組分的定性與定量檢測(cè)方法。本發(fā)明靈敏度高、選擇性好，井R霉素產(chǎn)品中VA、VM-B、VM-C、VM-D、VM-E、VM-F、VxA-A均能達(dá)到基線分離；由于流動(dòng)相中加入了 1%(體積百分?jǐn)?shù))甲醇作為流動(dòng)相改性劑，緩沖鹽濃度低，因此在系統(tǒng)壓力、分析時(shí)間、基線飄移、色譜柱的壽命及準(zhǔn)確度方面相對(duì)日本相關(guān)檢測(cè)方法都有很大的改善。一種井R霉素A及六種相關(guān)組分的定性與定量檢測(cè)方法，其步驟是:A、鑒別試驗(yàn)——定性:本鑒別試驗(yàn)可與井R霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定同時(shí)進(jìn)行。在相同的色譜操作條件下，井R霉素試樣溶液中各組分色譜峰的保留時(shí)間與井R霉素標(biāo)樣溶液中井R霉素各組分色譜峰的保留時(shí)間，其相對(duì)差值應(yīng)在1.5%以內(nèi)。圖6為運(yùn)用本方法檢測(cè)井R霉素標(biāo)樣的典型色圖譜，各組分保留時(shí)間分別為:VA14.967min、VM-B3.616min、VM-C16.115min、VM-D8.555min、VM-E28.902min VM-F23.545min、VxA~A7.553min。因色譜柱的批次，流動(dòng)相所用試劑批次、流動(dòng)相pH值及儀器狀態(tài)等細(xì)微差別，不同時(shí)間分析各組分的保留時(shí)間會(huì)略有差別。所述的井R霉素試樣溶液與井R霉素標(biāo)樣溶液為B步驟中定量測(cè)定所配井R霉素試樣溶液1、11與井R霉素標(biāo)樣溶液1、ΙΙ、ΠΙ。B、井R霉素各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定—— —定量:1、試劑和溶液準(zhǔn)備:試劑:新蒸二次蒸餾水，甲醇(色譜純)，磷酸(分析純)，無(wú)水磷酸氫二鉀(分析純)，濃硫酸(分析純)。2.5mmol/L磷酸緩沖溶液:稱取435.0mg無(wú)水K2HPO4于IOOOmL容量瓶中，加二次蒸餾水溶解，定容至IOOOmL,搖勻，用磷酸調(diào)至pH=7.0備用，使用前須用0.45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾。0.05mol/L H2SO4溶液:取一支IOOmL容量瓶，加入約90mL 二次蒸餾水，用移液管移取濃硫酸0.28mL緩慢加入其中后用二次蒸餾水定容。井岡霉素標(biāo)樣(日本三井公司):已知井岡霉素A93.8%。2、儀器:高效液相色譜儀(Agilent-1100色譜系統(tǒng)):具可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、四元泵、真空脫氣機(jī)。色譜數(shù)據(jù)處理工作站(Agilent)。色譜柱(日本YMC公司):250mmX4.6mm(id)不銹鋼柱，YMC-PACK 0DS-AQ，粒徑5μπι溶劑過(guò)濾器(津騰公司):濾膜孔徑0.45 μ m。針頭過(guò)濾器(津騰公司):濾膜孔徑0.22 μ m。3、樣品處理:井網(wǎng)霉素標(biāo)樣溶液:稱取井網(wǎng)霉素標(biāo)樣(購(gòu)于日本二井公司，VALIDAMYCINSTANDARD, Purity93.8%, LOT.N0.04 ①)110.0mg (精確至 0.1mg)至 50mL 容量瓶，加入2mL0.05mol/L H2S04, 二次蒸餾水定容，再分別移4、5、6mL至3個(gè)50mL容量瓶，二次蒸餾水定容，配成具一定濃度梯度的標(biāo)樣溶液1、標(biāo)樣溶液I1、標(biāo)樣溶液III。標(biāo)樣溶液1:井岡霉素A濃度約160.0 μ g/ml ；標(biāo)樣溶液I1:井岡霉素A濃度約200.0 μ g/ml ；標(biāo)樣溶液II1:井岡霉素A濃度約240.0 μ g/ml。試樣溶液:分別稱取適量(根據(jù)試樣中井霉素A的含量選擇合適的稱樣量，使稀釋后的試樣溶液中井R霉素A最終濃度與標(biāo)樣溶液II中井R霉素A濃度相當(dāng)，準(zhǔn)確至0.1mg)井岡霉素試樣2次于2支50mL容量瓶中，二次蒸餾水定容。量取2mL此溶液于IOOmL容量瓶，二次蒸餾水定容，0.22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾后備用，這樣配得試樣溶液1、試樣溶液II。(試樣溶液I與試樣溶液II為同一試樣分別取兩次不同的稱樣量，配成井R霉素A濃度相當(dāng)?shù)钠叫性嚇尤芤?。做平行試樣的目的是提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度，減小檢測(cè)誤差。)所述的井岡霉素(英文名稱:Validamycin)分子式/ 結(jié)構(gòu)式=C2tlH35O13N
權(quán)利要求
1.一種井R霉素各組分的定性與定量檢測(cè)方法，其步驟是: A、鑒別試驗(yàn)定性: 本鑒別試驗(yàn)與井R霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定同時(shí)進(jìn)行，在相同的色譜操作條件下，井岡霉素試樣溶液中各組分色譜峰的保留時(shí)間與井R霉素標(biāo)樣溶液中井R霉素各組分色譜峰的保留時(shí)間，其相對(duì)差值在1.5%以內(nèi)，運(yùn)用本方法檢測(cè)井R霉素標(biāo)樣，各組分保留時(shí)間分別為:VA14.967min、VM-B3.616min、VM-C16.115min、VM-D8.555min、VM-E28.902minVM-F23.545min、VxA-A7.553min; B、井R霉素各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定——定量: I)、試劑和溶液準(zhǔn)備: 試劑:新蒸二次蒸餾水，甲醇，磷酸，無(wú)水磷酸氫二鉀，濃硫酸； 溶液:2.5mmol/L磷酸緩沖溶液:稱取435.0mg無(wú)水K2HPO4于I OOOmL容量瓶中，加二次蒸餾水溶解，定容至I OOOmL，搖勻，用磷酸調(diào)至pH=7.0備用，使用前用0.45 μ m的微孔濾膜過(guò)濾；0.05mol/L H2SO4溶液:取一支100 mL容量瓶，加入90mL 二次蒸餾水，用移液管移取濃硫酸0.28mL緩慢加入其中，并用二次蒸餾水定容； 2)、儀器: 高效液相色譜儀:具可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、四元泵、真空脫氣機(jī)； 色譜數(shù)據(jù)處理工作站； 色譜柱:250_X 4.6m m 不銹鋼柱，YMC-PACK ODS-AQ,粒徑 5 μ m ; 溶劑過(guò)濾器:濾膜孔徑0.45 μ m ; 針頭過(guò)濾器:濾膜孔徑0.22 μ m; 3)、樣品處理: 井岡霉素標(biāo)樣溶液:稱取井R霉素標(biāo)樣110.0 mg至50mL容量瓶，二次蒸餾水溶解，力口入2mL0.05mol/L H2S04, 二次蒸餾水定容，再分別移4、5、6mL至3個(gè)50mL容量瓶，二次蒸餾水定容，配成濃度梯度的標(biāo)樣溶液1、標(biāo)樣溶液I1、標(biāo)樣溶液III ; 標(biāo)樣溶液1:井岡霉素A濃度約160.0μδ/πι1 ； 標(biāo)樣溶液I1:井岡霉素A濃度約200.θμδ/πι I ； 標(biāo)樣溶液II1:井R霉素A濃度約240.θμδ/πι I ； 試樣溶液:分別稱取適量井R霉素試樣2次于2支50mL容量瓶中，二次蒸餾水定容，量取2mL此溶液于IOOmL容量瓶，二次蒸餾水定容，0.22Mm過(guò)濾器過(guò)濾后備用，配得試樣溶液1、試樣溶液II，其井岡霉素A濃度約200.0Pg/m I; 4)、色譜操作條件: 流動(dòng)相:2.5mmol/L磷酸緩沖液+甲醇=99+1 ； 流速:1.2mL/min ； 柱溫:30°C ； 檢測(cè)波長(zhǎng):2IOnm ； 進(jìn)樣體積:10 μ L ; 色譜柱:250_X4.6mm 不銹鋼柱，YMC-PACK ODS-AQ,粒徑 5 μ m; 5)、編制進(jìn)樣分析程序表: 編制進(jìn)樣程序表:進(jìn)樣順序?yàn)闃?biāo)樣溶液1、標(biāo)樣溶液I1、標(biāo)樣溶液II1、試樣溶液1、試樣溶液II，填寫(xiě)檢測(cè)方法與樣品信息；6)、測(cè)定: 在上述色譜條件下，待儀器基線平穩(wěn)后，點(diǎn)擊化學(xué)工作站中的開(kāi)始按扭，色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)抽取標(biāo)樣溶液I I Ομ 于定量環(huán)中定量,定量后的標(biāo)樣溶液I被流動(dòng)相帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離后的井R霉素各組分依次進(jìn)入檢測(cè)器流通池，檢測(cè)器對(duì)井R霉素各組分采集數(shù)據(jù)并將色譜圖及相關(guān)數(shù)據(jù)保存于電腦中，分析完畢的試樣與流動(dòng)相一起排入廢液瓶中，這樣完成標(biāo)樣溶液I進(jìn)樣分析，接著按標(biāo)樣溶液I1、標(biāo)樣溶液II1、試樣溶液1、試樣溶液II的順序依次進(jìn)樣分析； 7)、數(shù)據(jù)分析: 從色譜工作站中調(diào)出標(biāo)樣溶液1、標(biāo)樣溶液I1、標(biāo)樣溶液III的圖譜，進(jìn)行較準(zhǔn)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Area=kXAmt +b, R2須大于或等于0.999,調(diào)出試樣溶液1、試樣溶液II的圖譜，將試樣溶液中井R霉素A的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出試樣進(jìn)樣時(shí)井岡霉素A濃度Ca，則試樣中井R霉素A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Xa (%)的計(jì)算式為: Xa= Ca X50X100X100/2/V 式中=Hi1——試樣的質(zhì)量，單位為毫克； Xa——井岡霉素A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，數(shù)值以％表示； Ca——試樣進(jìn)樣時(shí)井網(wǎng)霉素A濃度，單位為微克/毫升； 試樣中井R霉素A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為兩次平行結(jié)果取平均值； 從試樣圖譜中查出試樣中井R霉素A相關(guān)組分的峰面積Ax，用加熱減量法測(cè)出試樣的固形物百分含量S，粉劑試樣其干物質(zhì)含量即為其固形物百分含量S，則試樣的純度P為:P= Xa X100/ S式中: Xa為井R霉素A的質(zhì)量百分含量； S為樣品固形物質(zhì)量百分含量； 井岡霉素A相關(guān)組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X(%)的計(jì)算式為: X=Ax XP /Aa 式中: Aa為組分A峰面積， Ax為其它相關(guān)組分峰面積， P為試樣純度； 各組分質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為兩次平行結(jié)果取平均值； 8)、對(duì)井岡霉素產(chǎn)品中VA、VM-B、VM-C、V-MD、VM-E、VM-F、VxA-A七種組分進(jìn)行定性并定量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種井岡霉素各組分的定性與定量檢測(cè)方法，步驟A、鑒別試驗(yàn)B、井岡霉素各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定1)、試劑和溶液準(zhǔn)備:2)、儀器準(zhǔn)備；3)、樣品處理；4)、色譜操作條件5)、編制進(jìn)樣程序表；6)、測(cè)定儀器基線穩(wěn)定后，點(diǎn)擊化學(xué)工作站中的開(kāi)始按扭，色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)抽取標(biāo)樣溶液于定量環(huán)中定量，定量后的標(biāo)樣溶液被流動(dòng)相帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離后的井岡霉素各組分依次進(jìn)入檢測(cè)器流通池；7)、數(shù)據(jù)分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄各組分峰面積，接合標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)井岡霉素各組分進(jìn)行定量。本方法靈敏度高、選擇性好，井岡霉素A及相關(guān)組分均能達(dá)到基線分離，能夠?qū)畬顾叵嚓P(guān)產(chǎn)品中各組分準(zhǔn)確定性與定量。
文檔編號(hào)G01N30/88GK103175906SQ20121030181
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月23日
發(fā)明者金海燕, 龔永華, 劉荷梅, 劉華梅, 李青, 葉綠筍, 劉強(qiáng), 劉洋, 周莉, 胡凌云 申請(qǐng)人:武漢科諾生物科技股份有限公司