專利名稱：林可霉素殘留快速檢測(cè)試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種林可霉素殘留的檢測(cè)器具，特別是涉及一種林可霉素殘留快速檢測(cè)的試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
林可霉素(lincomycin, LIN)又稱潔霉素,是由林肯鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的林可酰胺類抗生素，分子式C18H34N206S，分子量406. 53，具有較強(qiáng)的抑菌活性，主要作用于革蘭氏陽性細(xì)菌，是RNA依賴的乙酰膽堿酯酶抑制劑。LIN不具備突出的毒性，但是它在食品及藥物中的殘留通過食物鏈進(jìn)入人體后易累積，可導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性，導(dǎo)致對(duì)疾病缺乏治療效率。因此，各國(guó)都對(duì)林可霉素有限量要求。中國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定了 LIN在牛、羊、豬、禽中的最高殘留限量，其中肌肉 lOOyg/kg、脂肪 lOOyg/kg、肝臟 SOOyg/kg、腎臟 MOOyg/kg。
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)LIN殘留限量常用的檢測(cè)方法主要有微生物法、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法、高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法(UPLC-MS/MS)、液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)、薄層色譜法(TLC)等。上述方法不僅需要昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜繁瑣的操作過程，并且對(duì)檢驗(yàn)人員的技能要求較高,不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的篩查。因此,急切需要一種快速簡(jiǎn)便的LIN檢測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題提供了一種特異性強(qiáng)、敏感性高、快速簡(jiǎn)便檢測(cè)林可霉素的試紙條，還提供了該試紙條的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種林可霉素殘留快速檢測(cè)試紙條，底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，夕卜層保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)林可霉素載體蛋白溶液印制的檢測(cè)印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體溶液印制的對(duì)照印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層用吸附林可霉素的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗林可霉素單克隆抗體。所述支撐層用硬質(zhì)塑膠片條或不吸水的硬紙條制成；所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；所述吸水材料層用吸水紙制成。所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。所述載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。所述外層保護(hù)層為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋的保護(hù)膜，在吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層的交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向吸附纖維層一側(cè)0. 3 0. 7cm。所述檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為平行排列的“ Il ”直線式印跡，或?yàn)椤笆弊中团帕杏≯E，或?yàn)椤癟 T”字型排列印跡，或?yàn)椤皝A丄”字型排列印跡，或?yàn)椤安稰，字型排列印跡，或?yàn)椤癬| ”字型排列印跡。所述試紙條的制備方法包括以下步驟
(I)偶聯(lián)林可霉素載體蛋白溶液的制備稱取12. 6mg林可霉素置于反應(yīng)器中，加入500 1000 μ L的PBS緩沖液溶解，得到LIN溶液；稱取6. 7mg NaIO4置于另一反應(yīng)器中，用500 1000 μ L雙蒸水溶解，得到NaI04溶液；將NaIO4溶液在攪拌下逐滴加入到LIN溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h ；
稱取載體蛋白15mg，用5mL PBS緩沖液溶解，得到載體蛋白溶液，置于4°C冰箱2h，備用JfLIN與NaIO4的反應(yīng)液在攪拌下逐滴加入到載體蛋白溶液中，4°C攪拌反應(yīng)2h ;然后加Λ 50 μ L、2mg/mL的NaIO4溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h ;最后將反應(yīng)液裝入透析袋，用pH7. 4的PBS溶液透析3d，每8h換透析液一次，收集反應(yīng)液，即得到林可霉素的偶聯(lián)物溶液；
(2)抗林可霉素單克隆抗體的制備；
(3)林可霉素金標(biāo)抗體的制備；
(4)羊抗或兔抗小鼠IgG抗體的制備；
用所得的偶聯(lián)物溶液在纖維素膜層上制成檢測(cè)印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體在纖·維素膜層上制備對(duì)照印跡；百菌清金標(biāo)抗體用于制備金標(biāo)抗體纖維層，然后依次將支撐層、吸附層和保護(hù)層組裝成試紙條。所述林可霉素金標(biāo)抗體是由以下方法制備的量取50 IOOmL沸騰的O. 01 O. 05%的氯金酸溶液，向氯金酸溶液中加入2 4mL、0. 5 2%的檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得粒徑10 15nm的膠體金顆粒；用O. lmol/L的K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶膠的pH至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的標(biāo)記比將抗LIN單克隆抗體加入到膠體金溶膠中，標(biāo)記IOmin ;力口Λ 20% 的 PEG 10000 至 PEG 10000 的終濃度為 O. 05%，4°C、1500 3000rpm 離心 20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、15000rpm離心Ih,棄上清液；將獲得的初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，獲得LIN膠體金標(biāo)記抗體；將I :100 500稀釋的膠體金標(biāo)記抗體吸附于玻璃纖維棉中，于4°C低溫真空干燥，制備LIN金標(biāo)抗體。本發(fā)明的積極有意效果
(I)特異性強(qiáng)，敏感性高。LIN快速檢測(cè)試紙條以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價(jià)鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)對(duì)單克隆抗體特異性及親和力影響較小，且具有較高的標(biāo)記率。(2)操作簡(jiǎn)便快速。使用本發(fā)明試紙條時(shí)無需任何其它試劑，只要將其插入待檢樣品中10秒左右，2分鐘內(nèi)即可判定檢測(cè)結(jié)果。(3)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。本發(fā)明試紙條以顯示紅棕色“ I ”(或“十”、“丁”、“丄”、“ ”)印跡作為檢測(cè)的陽性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色“ I ”印跡表示在被檢測(cè)樣品中含有LIN，顯示兩條棕紅色“ I I ”印跡表示在被檢樣品中不含LIN。結(jié)果判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單明了，不易出現(xiàn)假陰性和假陽性等人為誤判。(4)成本低，投資少。使用該試紙條不需另配儀器設(shè)備及其它試劑，可隨時(shí)隨地進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)費(fèi)用低廉。采用通常的儀器分析費(fèi)用為300元每頭/份，采用進(jìn)口 ELISA試劑盒的檢測(cè)費(fèi)用為50元每頭/份，本發(fā)明試紙條的檢測(cè)費(fèi)用為8 10元每頭/份，檢測(cè)費(fèi)用大幅下降，可節(jié)省大量?jī)x器和設(shè)備費(fèi)用。(5)應(yīng)用范圍廣，便于推廣。本發(fā)明試紙條操作簡(jiǎn)單，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生防疫、質(zhì)量監(jiān)測(cè)、畜產(chǎn)品加工、集約化養(yǎng)殖及個(gè)體養(yǎng)殖等方面。本發(fā)明在保障食品安全和保護(hù)消費(fèi)者健康方面具有極其重要的意義，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。(6)本發(fā)明應(yīng)用高碘酸鈉制備免疫原及檢測(cè)印跡，和其他方法相比，高碘酸鈉氧化法是糖類或含糖基化合物分子中的鄰二醇結(jié)構(gòu)被高碘酸鈉氧化為醛基，然后與蛋白分子中的氨基形成Schiff氏堿，反應(yīng)過程比較溫和，可在常溫和中性pH條件下進(jìn)行，易于操作和控制。


圖I為本發(fā)明試紙條的結(jié)構(gòu)示意 圖2為本發(fā)明試紙條的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式 以下實(shí)施例是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，并不表示對(duì)本發(fā)明的限制。文中如沒有特別說明，其中的百分含量均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例一參見圖I、圖2。圖中I為支撐層，用塑膠薄片條制成，2為吸附纖維層(測(cè)試端)，用玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體纖維層3用吸附林可霉素的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗林可霉素的單克隆抗體。纖維素膜層4采用硝酸纖維素膜制成，吸水材料層5采用吸水濾紙制成，將吸附纖維層2、金標(biāo)抗體纖維層3、纖維素膜層4、吸水材料層5從右至左依次粘貼在支撐層I上，彼此交界處的纖維互相交叉滲透。在纖維素膜層4上設(shè)有用偶聯(lián)LIN的載體蛋白BSA (牛血清白蛋白)溶液印制的檢測(cè)印跡6和用羊抗小鼠IgG溶液印制的對(duì)照印跡7，兩條印跡帶平行排列，形成組合印跡帶“ I I”。8-1為覆蓋在吸附纖維層2和金標(biāo)抗體纖維層3上面的樣品端白色保護(hù)膜，在吸附纖維層2和金標(biāo)抗體纖維層3交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜8-1上，偏向于吸附纖維層2 —側(cè)O. 5cm處印有標(biāo)記線9，標(biāo)記線9的右端印有箭頭及max字樣，吸水材料層5 (手柄端)上覆蓋有黃色保護(hù)膜8-2。用于檢測(cè)印跡的偶聯(lián)LIN載體蛋白和金標(biāo)抗體的制備，以及用于對(duì)照印跡的羊抗或兔抗小鼠IgG抗體的制備方法如下
(I)LIN與載體蛋白的偶聯(lián)
采用高碘酸鈉法，將LIN與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，制備免疫抗原。稱取12. 6mg LIN置于IOmL反應(yīng)瓶中，用500 μ L PBS溶解；稱取6. 7mg NaIO4置于IOmL反應(yīng)瓶中，用500 μ L雙蒸水溶解；然后將NaI04溶液在攪拌條件下逐滴加入到LIN溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h ;稱取載體蛋白BSA(或0VA、KLH)15mg置于IOmL反應(yīng)瓶中，用5mLPBS溶解，然后置于4°C冰箱中2h，備用；之后將LIN與NaI04的反應(yīng)混合液逐滴攪拌加入到BSA溶液中，4°C攪拌反應(yīng)2h ;再次向混合液中加入2mg/mL的NaIO4 50 μ L，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h ;將反應(yīng)混合液裝入透析袋，用pH=7. 4的PBS溶液透析3d，每8h換透析液一次，收集得到LIN與載體蛋白的偶聯(lián)物。(2)抗LIN單克隆抗體的制備
用制備的LIN載體蛋白偶聯(lián)物以2(^g 5(^g/只的用量免疫BALB/c系小鼠，采用背部皮下多點(diǎn)注射，共免疫四次，每次間隔15 30天。第四次加強(qiáng)免疫后3 4天，將免疫小鼠眼球放血，拉頸致死，用75%的酒精浸泡5 lOmin，無菌取其脾細(xì)胞，剪碎并經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾，1000r/min離心lOmin，收集脾細(xì)胞；將I X IO8個(gè)脾細(xì)胞與2 X IO7 5 X IO7個(gè)的NSO瘤細(xì)胞混合，1000r/min離心lOmin，棄上清，將細(xì)胞沉淀于37°C水浴中緩緩加入40 50%的PEG4000 (pH 8. 5 9. O) O. 7 I. OmL,作用Imin ;然后緩慢加入無血清1640培養(yǎng)基15mL，以終止PEG的作用，37°C水浴5 lOmin，1000r/min離心lOmin，棄上清；將得到的細(xì)胞沉淀重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，加入4塊96孔培養(yǎng)板(ΙΟΟμ 200μ 7孔)中，置于370C>5%的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 10天后，以5 lOPg/mL偶聯(lián)LIN的載體蛋白包被酶標(biāo)板(96孔/塊)，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)雜交瘤的培養(yǎng)上清。融合后得到陽性細(xì)胞克隆(0D492=0. 6以上)325孔，陽性率為83% ;挑取強(qiáng)陽性細(xì)胞克隆(0D492=1. 8以上)，進(jìn)行連續(xù)三次的有限稀釋克隆化，所生產(chǎn)的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)為92 98。再次連續(xù)三次的有限稀釋克隆化，選取強(qiáng)陽性細(xì)胞克隆，繼續(xù)有限稀釋克隆化。經(jīng)鑒定，其分泌的單克隆抗體特異地與LIN反應(yīng)，而不與其它蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)109 10，輕鏈亞型為K或λ，重鏈亞型為IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3，針對(duì)LIN特異抗原決定簇的單克隆抗體，用于制備金標(biāo)抗體。(3) LIN金標(biāo)抗體和金標(biāo)抗體玻璃纖維棉的制備 以檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶膠。在50 IOOmL沸騰的O. 01 O. 05%氯金酸水溶液中加入2 4mL O. 5 2%的檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得粒徑15nm左右的膠體金。以O(shè). lmol/L的K2C03調(diào)節(jié)膠體金pH至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的標(biāo)記比將待標(biāo)記的LIN單克隆抗體加入到上述金溶膠中，標(biāo)記IOmin后，加20%的PEG 10000至終濃度為0. 05%, 4°C、1500 3000rpm離心20min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4°C、15000rpm離心Ih,棄上清；獲初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物后，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，獲得LIN膠體金標(biāo)記抗體。將I : (100 500)稀釋的膠體金標(biāo)記抗體吸附于精制玻璃纖維棉中，4°C低溫真空干燥，制備LIN金標(biāo)抗體玻璃纖維棉。(4)羊抗或兔抗小鼠IgG抗體的制備
以飽和硫酸銨提取小鼠血清IgG。取I份小鼠血清加2份PBS (pH=7. 4)混勻，加等體積飽和硫酸銨混勻，置4°C冰箱2h，4°C、1200r/min離心15min，棄上清；以適量PBS (pH=7. 4)溶解沉淀，加飽和硫酸銨至終濃度33%，置4°C冰箱內(nèi)用PBS(pH=7. 4)過夜透析，換液2 3次，4°C、12000r/min離心15min，收集上清，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定其蛋白濃度，以5(^g 100 μ g/kg體重(小鼠血清IgG)經(jīng)皮下和肌肉注射免疫健康羊或家兔3 4次，末次免疫10天后，靜脈采血，以ELISA測(cè)定其血清抗體效價(jià)在I :2000以上，心臟采血或頸動(dòng)脈放血，收集其血清，用于試紙條對(duì)照印跡的制備。以飽和硫酸銨提取羊抗或兔抗小鼠IgG，方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述。(5)試紙條的檢測(cè)反應(yīng)原理
當(dāng)LIN檢測(cè)試紙條樣品端插入待檢測(cè)樣品溶液后，待測(cè)溶液通過虹吸作用帶動(dòng)待檢LIN及金標(biāo)抗體棉中的金標(biāo)抗體一起向纖維素膜層擴(kuò)散，并最終滲入手柄端的吸水材料層中，擴(kuò)散過程中待檢LIN與金標(biāo)抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉金標(biāo)抗體上LIN的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上偶聯(lián)LIN載體蛋白的檢測(cè)印跡結(jié)合，不能顯示檢測(cè)印跡，而羊抗或兔抗小鼠IgG則可與金標(biāo)抗體結(jié)合，形成紅棕色對(duì)照印跡“ I ”，即一條紅棕色“ I ”印跡為陽性標(biāo)記；若樣品溶液中無LIN，則不能阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上偶聯(lián)LIN的載體蛋白檢測(cè)印跡結(jié)合，顯示紅棕色檢測(cè)印跡“ I ”，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG也與金標(biāo)抗體結(jié)合，顯示紅棕色對(duì)照印跡“ I ”，形成兩條紅棕色“ I I ”，為陰性標(biāo)記；如果纖維素膜上沒有紅棕色標(biāo)記顯示，則表明試紙條已失效。(6)檢測(cè)方法
a.樣品液制備檢測(cè)雞肉時(shí)，將雞肉樣品絞碎后加入少許鹽酸，反應(yīng)5 10min，之后加入緩沖液，振蕩I 2min，倒出提取液進(jìn)行檢測(cè)。其他肉類樣品液的制備與此相似。b.操作方法將試紙條樣品端插入樣品液中，插入深度不超過標(biāo)記線，約10秒取出試紙條，水平放置約2分鐘，觀察結(jié)果。c.結(jié)果判斷如果在纖維素膜上有一條紅棕色標(biāo)記“ I ”顯示，測(cè)檢結(jié)果呈陽性，說明在被檢測(cè)樣品液中含有LIN ;如果檢測(cè)試紙條上的纖維素膜出現(xiàn)兩條紅棕色標(biāo)記“ I
I ”，檢測(cè)結(jié)果呈陰性，待檢樣品中不含LIN。 實(shí)施例二 試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于
支撐層I用不吸水的硬紙條制成，吸附纖維層2用尼龍膜，金標(biāo)抗體纖維層3吸附有膠體金標(biāo)記的抗林可霉素的多克隆抗體，纖維素膜層4采用純纖維素膜，檢測(cè)印跡6中偶聯(lián)LIN的載體蛋白為雞卵清白蛋白(OVA)，對(duì)照印跡7用兔抗小鼠IgG溶液在纖維素膜上制成。實(shí)施例三試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于
吸附纖維層2用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，檢測(cè)印跡6中偶聯(lián)LIN的載體蛋白為雞卵清白蛋白(0VA)，對(duì)照印跡7用羊抗小鼠IgG溶液在纖維素膜上制成。實(shí)施例四試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于
吸附纖維層2用聚酯膜，檢測(cè)印跡6中偶聯(lián)LIN的載體蛋白為血藍(lán)蛋白。實(shí)施例五試紙條結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于
纖維素膜層4上設(shè)有用偶聯(lián)LIN的血藍(lán)蛋白溶液印制的檢測(cè)印跡6，用羊抗小鼠IgG溶液印制的對(duì)照印跡7，檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡形成的組合印跡為“十十”、“τ ~?！?、“ I”、“ h卜”和H ”中的任KLH—種。實(shí)施例二 五中，檢測(cè)樣品制備、操作方法和結(jié)果判定，均同實(shí)施例一。實(shí)施例六試紙條的敏感性、特異性檢測(cè)
以實(shí)施例一的試紙條進(jìn)行檢測(cè)，其他例子中的試紙條試驗(yàn)結(jié)果和此相似。(I)用實(shí)施例一的試紙條分別檢測(cè)添加LIN濃度為0ng/g、100ng/g、200ng/g、400ng/g和800ng/g的雞肉樣品20份；室溫條件下操作,用肉眼觀測(cè)判定；結(jié)果顯示，Ong/mL的樣品全部為陰性；100ng/mL及其以上濃度的添加樣品全部為陽性。取試紙條分別檢測(cè)添加LIN濃度為Ong/g和100ng/g的雞肉樣品500份；室溫條件下操作，肉眼觀測(cè)判定；用Ong/g濃度的添加樣品計(jì)算假陽性率，假陽性率=假陽性樣品數(shù)/500。用100ng/g濃度的添加樣品計(jì)算假陰性率，假陰性率=假陰性樣品數(shù)/500。結(jié)果顯示，假陽性為3條，假陽性率為彡1% ;假陰性率為0%。(2)用已知陰性雞肉樣品配制林可霉素類藥物的標(biāo)準(zhǔn)樣，使其終濃度分別為1000ng/g，用實(shí)施例一的試紙條進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示除含LIN的樣品呈陽性、含克林霉素的樣品呈弱陽性外，與其它多種藥物均無交叉反應(yīng)，說明試紙條的反應(yīng)特異性較強(qiáng)。
權(quán)利要求
1.一種林可霉素殘留快速檢測(cè)試紙條，底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護(hù)層固定在吸附層上，其特征是吸附層從測(cè)試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有用偶聯(lián)林可霉素載體蛋白溶液印制的檢測(cè)印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體溶液印制的對(duì)照印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層用吸附林可霉素的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的抗林可霉素單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述支撐層用硬質(zhì)塑膠片條或不吸水的硬紙條制成；吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水紙制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是所述纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試紙條，其特征是其中偶聯(lián)林可霉素載體蛋白溶液是由以下方法制備的 稱取12. 6mg林可霉素置于反應(yīng)器中，加入500 1000 μ L的PBS緩沖液溶解，得到LIN溶液；稱取6. 7mg NaI04置于另一反應(yīng)器中，用500 1000 μ L雙蒸水溶解，得到NaI04溶液；將NaI04溶液在攪拌下逐滴加入到LIN溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h ； 稱取載體蛋白15mg，用5mL PBS緩沖液溶解，得到載體蛋白溶液，置于4°C冰箱2h，備用；將LIN與NaI04的反應(yīng)液在攪拌下逐滴加入到載體蛋白溶液中，4°C攪拌反應(yīng)2h ;然后加入50 μ L、2mg/mL的NaI04溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h ;最后將反應(yīng)液裝入透析袋，用pH7. 4的PBS溶液透析3d，每8h換透析液一次，收集反應(yīng)液，即得到林可霉素的偶聯(lián)物溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征是所述載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征是所述外層保護(hù)層為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋的保護(hù)膜，在吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層的交界處對(duì)應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該樣品標(biāo)記線偏向吸附纖維層一側(cè)O. 3 O. 7cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 4任一項(xiàng)所述的試紙條，其特征是所述檢測(cè)印跡和對(duì)照印跡為平行排列的“ Il ”直線式印跡，或?yàn)椤笆弊中团帕杏≯E，或?yàn)椤唉?~?！弊中团帕杏≯E，或?yàn)椤皝A丄”字型排列印跡，或?yàn)椤?h P，字型排列印跡，或?yàn)镠，，字型排列印跡。
8.權(quán)利要求I所述試紙條的制備方法，其特征是該方法包括以下步驟 (1)偶聯(lián)林可霉素載體蛋白溶液的制備 稱取12. 6mg林可霉素置于反應(yīng)器中，加入500 1000 μ L的PBS緩沖液溶解，得到LIN溶液；稱取6. 7mg NaI04置于另一反應(yīng)器中，用500 1000 μ L雙蒸水溶解，得到NaI04溶液；將NaI04溶液在攪拌下逐滴加入到LIN溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h ;稱取載體蛋白15mg，用5mL PBS緩沖液溶解，得到載體蛋白溶液，置于4°C冰箱2h，備用；將LIN與NaI04的反應(yīng)液在攪拌下逐滴加入到載體蛋白溶液中，4 °C攪拌反應(yīng)2h ;然后加入50 μ L、2mg/mL的NaI04溶液，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h ;最后將反應(yīng)液裝入透析袋，用pH7. 4的PBS溶液透析3天，每8h換透析液一次，收集反應(yīng)液，得到林可霉素的偶聯(lián)物溶液； (2)抗林可霉素單克隆抗體的制備； (3)林可霉素金標(biāo)抗體的制備； (4)羊抗或兔抗小鼠IgG抗體的制備；用所得的偶聯(lián)物溶液在纖維素膜層上制成檢測(cè)印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體在纖維素膜層上制備對(duì)照印跡，百菌清金標(biāo)抗體用于制備金標(biāo)抗體纖維層，然后依次將支撐層、吸附層和保護(hù)層組裝成試紙條。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述試紙條的制備方法，其特征是所述載體蛋白為牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白或血藍(lán)蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述試紙條的制備方法，其特征是所述林可霉素金標(biāo)抗體是由以下方法制備的 量取50 IOOmL沸騰的O. 01 O. 05%的氯金酸溶液，向氯金酸溶液中加入2 4mL、O.5 2%的檸檬酸三鈉溶液，反應(yīng)后獲得粒徑10 15nm的膠體金顆粒；用O. lmol/L的K2C03調(diào)節(jié)膠體金溶膠的pH至8. 5 9. 5，以1:1000 1300的標(biāo)記比將抗LIN單克隆抗體加入到膠體金溶膠中，標(biāo)記IOmin ;加入20%的PEG 10000至PEG 10000的終濃度為O. 05%，4°C、1500 3000rpm離心20min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒,4°C、15000rpm離心Ih,棄上清液；將獲得的初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化金標(biāo)蛋白，獲得LIN膠體金標(biāo)記抗體；將1 :100 500稀釋的膠體金標(biāo)記抗體吸附于玻璃纖維棉中，于4°C低溫真空干燥，制備林可霉素金標(biāo)抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種林可霉素殘留快速檢測(cè)試紙條及其制備方法。試紙條底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護(hù)層固定在吸附層上，吸附層從測(cè)試樣品端依次為吸附纖維層、吸附偶聯(lián)林可霉素的金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上有用林可霉素載體蛋白溶液印制的檢測(cè)印跡以及用羊抗或兔抗小鼠IgG抗體溶液印制的對(duì)照印跡。該試紙條檢測(cè)的特異性強(qiáng)、敏感性高，操作簡(jiǎn)便快速；檢測(cè)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確，檢測(cè)時(shí)不需專用儀器設(shè)備和專業(yè)人員，成本低，投資少，容易推廣實(shí)施。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102818895SQ20121028164
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者胡驍飛, 張改平, 邢廣旭, 職愛民, 王方雨, 張小輝, 楊繼飛 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院