專利名稱：：枇杷木質(zhì)素代謝相關(guān)乙烯響應(yīng)因子克隆與轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于果實(shí)貯藏與植物分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及枇杷木質(zhì)素代謝相關(guān)乙烯響應(yīng)因子克隆與轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法。
背景技術(shù)：
：枇杷(iZrijaponicaLindl.)是原產(chǎn)我國(guó)的薔薇科常綠果樹(shù),屬于非躍變型果實(shí)。不同于其他果實(shí)在采后軟化的過(guò)程，紅肉枇杷在采后貯藏過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)木質(zhì)化現(xiàn)象，造成果實(shí)硬度上升、風(fēng)味變淡、粗糙少汁等，嚴(yán)重影響了果實(shí)品質(zhì)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。05°C低溫能顯著抑制枇杷果實(shí)的呼吸和乙烯釋放，從而延長(zhǎng)貨架期，但是在01°C會(huì)使果實(shí)發(fā)生冷害，反而會(huì)加速枇杷果實(shí)木質(zhì)化的產(chǎn)生。程序降溫(LTC)，即先將枇杷果實(shí)于5°C貯藏6天，然后再轉(zhuǎn)到0°C貯藏，可以減輕冷害，減緩木質(zhì)素的生成。熱激處理(HT)是將果實(shí)經(jīng)過(guò)400C的4h處理之后放入0°C貯藏，也可以減輕果實(shí)的木質(zhì)化進(jìn)程。乙烯是一種重要的植物激素，參與植物生長(zhǎng)的整個(gè)過(guò)程,包括種子萌發(fā)、花的發(fā)育與分化、果實(shí)的成熟與衰老等過(guò)程，同時(shí)乙烯還是一種信號(hào)物質(zhì)，參與植物對(duì)各種生物或是非生物(環(huán)境)脅迫的反應(yīng)。在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，乙烯響應(yīng)因子(ERF)位于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的末端，直接誘導(dǎo)或是抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，并且可能順式調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄因子，從而實(shí)現(xiàn)乙烯的生物學(xué)效應(yīng)。如在番茄中，通過(guò)抑制番茄LeERFl基因表達(dá)可有效延緩番茄果實(shí)成熟，同時(shí)LeERF2可特異調(diào)控乙烯合成基因，進(jìn)而反饋調(diào)控乙烯合成。果實(shí)在低溫、短時(shí)高溫等逆境環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生一定的防御反應(yīng)，其中ERF可能是響應(yīng)的基因之一,不同的逆境環(huán)境中可能有不同的ERF基因家族成員進(jìn)行響應(yīng)。枇杷果實(shí)低溫貯藏中，ERFs家族成員調(diào)控木質(zhì)化的生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種枇杷木質(zhì)素代謝相關(guān)乙烯響應(yīng)因子克隆與轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)克隆得到乙烯響應(yīng)因子(ERF)基因家族成員，以及這些成員在枇杷果實(shí)采后冷藏過(guò)程中表達(dá)量的變化情況，得到調(diào)控木質(zhì)素合成有關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子成員，豐富枇杷果實(shí)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的理論內(nèi)容，并為果實(shí)保鮮提供新途徑。本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下I、枇杷乙烯響應(yīng)因子序列的獲得根據(jù)華大公司深度測(cè)序返回的結(jié)果中，查找到與乙烯相關(guān)的Unigene約395條，其中與AP2/ERF乙烯響應(yīng)因子有關(guān)的Unigene共164條。將這164條Unigene翻譯的蛋白序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行蛋白序列的比對(duì)(proteinblast),篩選出含有一個(gè)完整AP2結(jié)構(gòu)域的Unigene。2、乙烯響應(yīng)因子3’末端序列的獲得參照Clontech公司SMARTRACEcDNAAmplification試劑盒說(shuō)明書(shū)，合成3’cDNA模板并根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求在http://frodo.wi.mit.edu/primer3/網(wǎng)站上設(shè)計(jì)相應(yīng)基因的特異3’末端引物,每個(gè)基因設(shè)計(jì)兩個(gè)特異引物，分別為內(nèi)側(cè)引物、外測(cè)引物，引物序列見(jiàn)SEQIDNO:1-32，下游引物參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的通用引物。對(duì)3’cDNA模板進(jìn)行2次PCR，第二次PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用Takara公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18_T載體過(guò)夜連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用100mg/ml青霉素的LB板上篩選陽(yáng)性克隆，并對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步用載體引物進(jìn)行菌落PCR確定后，送上海英俊公司測(cè)序。測(cè)序列結(jié)果用CLUSTALX軟件與已有的Unigene進(jìn)行比對(duì)，共獲得32條ERF相關(guān)基因的3’末端序列。3、枇杷果實(shí)的RNA的提取采用CTAB法提取。粗提的RNA用TURBODNase(Ambion)去除其中的DNA,取IuI去DNA的RNA用NanophotometerPearl(Implen)定量后，取3Ug用RevertAidFirstStrandcDNA試劑盒(Fermentas)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用于定量PCR。4、以冷敏性紅肉枇杷洛陽(yáng)青(LYQ)為材料進(jìn)行以下3個(gè)處理直接0°C貯藏，熱激(HT,40°C4h后轉(zhuǎn)入(TC貯藏)，程序降溫(LTC，5°C6d后轉(zhuǎn)入(TC貯藏)。檢測(cè)3個(gè)處理過(guò)程中硬度、木質(zhì)素含量的變化情況。5、對(duì)篩選出的32個(gè)乙烯響應(yīng)因子(ERF)用在線網(wǎng)站http://frodo.wi.mit.edu/primer3/設(shè)計(jì)定量PCR的引物，引物序列見(jiàn)SEQIDNO:33-640以枇杷管家基因Actin作為內(nèi)參基因，序列參見(jiàn)SEQIDN0:65。處理前的起始點(diǎn)表達(dá)量為1，計(jì)算方法采用AACt相對(duì)定量的方法計(jì)算3個(gè)處理過(guò)程中ERF基因的表達(dá)量。6、結(jié)合紅肉枇杷洛陽(yáng)青果實(shí)貯藏的三個(gè)處理中((TC、熱激、程序降溫)的硬度、木質(zhì)素含量的變化情況以及ERF基因的表達(dá)情況，篩選出2個(gè)與枇杷果實(shí)木質(zhì)化進(jìn)行有一定相關(guān)性的ERF基因，分別為SEQIDN0:66和SEQIDN0:67。SEQIDNO:66,SEQIDNO:67在直接0°C處理處理的果實(shí)中表達(dá)量上升，而在HT、LTC處理被抑制，與枇杷果實(shí)在3個(gè)處理中的硬度、木質(zhì)素含量的變化呈顯著的正相關(guān)性，SEQIDNO:66,SEQIDN0:67參與果實(shí)冷害木質(zhì)化的進(jìn)程，HT、LTC處理能夠減輕低溫時(shí)產(chǎn)生的冷害木質(zhì)化。步驟2所述二次PCR的第一次反應(yīng)參數(shù)為10XExBuffer2uL,2.5mmol/LdNTPsI.6yl，外測(cè)引物UPM2UL,10Umol/L特異外測(cè)引物0.5yl，ExTaq聚合酶0.1yL,加滅菌的雙蒸水至20uI,TouchdownPCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，72°C，150s，5個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，68°C退火30s，72°C延伸150s，5個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸150s，25個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min。第二次反應(yīng)參數(shù)為10XExBuffer2yL，2.5mmol/LdNTPsI.6UI,內(nèi)測(cè)引物NUP2uL,10iimol/L特異內(nèi)測(cè)引物0.5yl，ExTaq聚合酶0.IuL，加滅菌的雙蒸水至20yL，94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸90s，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min。步驟5所述的計(jì)算基因表達(dá)量的方法是以枇杷管家基因Actin作為內(nèi)參基因，處理前的起始點(diǎn)表達(dá)量為I,計(jì)算方法采用AACt相對(duì)定量的方法。反應(yīng)體系為SsoFastEvaGreensupermix10u1,10Mm的上下游引物各Iul，模板2UI,加無(wú)菌水至20uI0反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30s;95°C變性5s，60°C退火5s，45個(gè)循環(huán)。木質(zhì)化是枇杷果實(shí)采后貯藏過(guò)程中影響果實(shí)品質(zhì)的重要方面，尤其是在低溫環(huán)境，冷害癥狀的表現(xiàn)之一就是加快木質(zhì)化的過(guò)程，1_MCP、LTC等處理可以減輕冷害木質(zhì)化的產(chǎn)生。本發(fā)明是利用深度測(cè)序的結(jié)果，克隆到枇杷中乙烯響應(yīng)因子(ERF)Unigene的3’末端核甘酸序列，一共獲得到32個(gè)3’末端序列，并對(duì)這些乙烯響應(yīng)因子在0°C、HT、LTC處理的枇杷果實(shí)中ERF表達(dá)量的變化，得出與冷害木質(zhì)化有關(guān)的ERF基因家族成員SEQIDN0:66、SEQIDN0:67，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制、果實(shí)采后保鮮技術(shù)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。圖I為0°C、HT、LTC處理后洛陽(yáng)青果實(shí)硬度(A)和木質(zhì)素含量(B)變化情況。圖2為(TC、HT、LTC處理后洛陽(yáng)SEQIDNO:66(A)和SEQIDNO:67(B)基因表達(dá)情況。具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。以下實(shí)施例采用的方法與條件為I:使用SMARTRACEcDNAAmplification試劑盒獲得Unigene的3’末端核甘酸序列的2次PCR過(guò)程。第一次外測(cè)引物PCR反應(yīng)參數(shù)為10XExBuffer2uL,2.5mmol/LdNTPsI.6yl，外測(cè)引物UPM2uL,10ymol/L特異外測(cè)引物0.5yl，ExTaq聚合酶0.IUL,加滅菌的雙蒸水至20uL0TouchdownPCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，72°C，150s’5個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，68°C退火30s，72°C延伸150s，5個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸150s，25個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min。第二次反應(yīng)參數(shù)為10XExBuffer2yL，2.5mmol/LdNTPs1.6uI,內(nèi)測(cè)引物NUP2uL,10ymol/L特異內(nèi)測(cè)引物0.5iiI,ExTaq聚合酶0.IUL,加滅菌的雙蒸水至20uL094°C預(yù)變性5min；;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸90S，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min。2.定量PCRR的反應(yīng)體系為SsoFastEvaGreensupermixIOuI，10Mm的上下游引物各Iii1，模板2uI，加無(wú)菌水至20yl。反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30s;95°C變性5s，60°C退火5S，45個(gè)循環(huán)。實(shí)施例一枇杷ERF在程序降溫(LTC)中的表達(dá)(一)實(shí)驗(yàn)方法I.材料處理選擇大小均勻、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)擦傷的紅肉枇杷果實(shí)洛陽(yáng)青(LYQ)，一批直接放入0°C貯藏，另一批進(jìn)行程序降溫(LTC)處理，即在5°C貯藏6天后轉(zhuǎn)入0°C貯藏。2.枇杷果實(shí)硬度用質(zhì)構(gòu)儀(StableMicroSystems,UK)測(cè)定，每個(gè)果實(shí)分別測(cè)定果實(shí)對(duì)稱面赤道部位，其平均值作為一個(gè)重復(fù)，單果重復(fù)10次。測(cè)定系數(shù)如下探頭P5，穿透深度4mm,測(cè)前速度為3mms'測(cè)定速度為Imms'測(cè)后速度為10mms'最終數(shù)據(jù)用牛頓(N)表示。3.木質(zhì)素含量的測(cè)定。樣品的洗滌果實(shí)凍樣于5mL洗液(100mM的K2HPO4/KH2PO4,0.5%TritonX-100,0.5%PVP,pH7.8)中，在室溫下振蕩洗滌30min,10000g，20min離心，用洗液重懸浮沉淀，重復(fù)洗兩次，再用100%甲醇洗4次，每次洗的時(shí)間均為半小時(shí)，同樣10000g，20min離心。沉淀在80°C烘箱中烘干過(guò)夜。木質(zhì)素含量的測(cè)定精確稱取IOmg的經(jīng)洗滌烘干后的粉末于IOmL的帶蓋的管子，加入ImL的2MHCl和0.ImL的巰基乙酸，沸水浴8h后置冰上冷卻，15000g，4°C離心20min;沉淀用蒸餾水清洗、過(guò)夜烘干后重懸浮于2mL的IM的NaOH中，室溫下輕微振蕩反應(yīng)18h，再用15000g，離心20min;取0.5mL的上清液于新的試管中，加入100uL的濃鹽酸，置4°C下4h以沉淀巰基乙酸結(jié)合的木質(zhì)素，用15000g,4°C離心20min,沉淀溶于ImL的IM的NaOH。經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后，用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定280nm處的吸光值。以NaOH溶液為空白對(duì)照。單位為X103A280/kgFW，重復(fù)3次。4.采用CTAB法提取果實(shí)RNA，之后去除DNA污染，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。并對(duì)獲得的32個(gè)ERFUnigene進(jìn)行定量PCR分析。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果I.直接放在0°C貯藏的枇杷果實(shí)硬度快速增加，并且果肉中的木質(zhì)素含量也隨著快速增加，LTC處理可以有效抑制LYQ果實(shí)硬度的增加并減緩果實(shí)木質(zhì)素積累(附圖1A，1B)。2.SEQIDNO:66、SEQIDNO:67在(TC表達(dá)量上升，而LTC處理下表達(dá)明顯被抑制。與硬度、木質(zhì)素含量的變化呈顯著的正相關(guān)性(附圖2A，2B)。實(shí)施例二相關(guān)ERF在熱激(HT)中的表達(dá)(一)實(shí)驗(yàn)方法(I)材料處理選擇大小一致、無(wú)病蟲(chóng)害、擦傷的紅肉枇杷果實(shí)洛陽(yáng)青(LYQ)，一批直接放入0°C貯藏，另一批進(jìn)行40°C的熱空氣處理(熱激，HT)4小時(shí)后轉(zhuǎn)入0°C貯藏。(2)枇杷果實(shí)硬度用質(zhì)構(gòu)儀(StableMicroSystems,UK)測(cè)定,木質(zhì)素含量的測(cè)定(方法如上)。(3)采用CTAB法提取果實(shí)RNA，之后去除DNA污染，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。并對(duì)獲得的32個(gè)ERFUnigene進(jìn)行定量PCR分析。(二)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(I)HT處理與直接0°C貯藏的果實(shí)相比，果實(shí)硬度、木質(zhì)素含量的增加減緩，參見(jiàn)附圖I(A)、(B))。(2)SEQIDNO:66,SEQIDNO:67在0°C表達(dá)量上升，HT處理下這2個(gè)基因表達(dá)被抑制，參見(jiàn)附圖2(A)、(2)。結(jié)合實(shí)施例一，表明LTC、HT可以減緩LYQ果實(shí)冷害木質(zhì)化的進(jìn)程，同時(shí)SEQIDNO:66,SEQIDNO:67的表達(dá)與該進(jìn)程呈正相關(guān)關(guān)系，表明可能參與調(diào)控果實(shí)冷咅木質(zhì)化。權(quán)利要求1.枇杷木質(zhì)素代謝相關(guān)乙烯響應(yīng)因子克隆與轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法，其特征在于，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)枇杷乙烯響應(yīng)因子序列的獲得根據(jù)華大公司深度測(cè)序返回的結(jié)果，一共查找到與乙烯相關(guān)的Unigene約395條，其中與AP2/ERF乙烯響應(yīng)因子有關(guān)的Unigene共164條，將這164條Unigene翻譯的蛋白序列在NCBI中進(jìn)行蛋白序列的比對(duì)，篩選出含有AP2結(jié)構(gòu)域的Unigene；(2)乙烯響應(yīng)因子3’末端序列的獲得參照Clontech公司SMARTRACEcDNAAmpIification試劑盒說(shuō)明書(shū),合成3’cDNA模板并根據(jù)說(shuō)明書(shū)要求設(shè)計(jì)相應(yīng)基因的特異3’末端引物，每個(gè)基因設(shè)計(jì)兩個(gè)特異的上游引物，分別為內(nèi)側(cè)引物、外測(cè)引物，引物序列見(jiàn)SEQIDNO:1-32，下游引物參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的通用引物，對(duì)3’cDNA模板進(jìn)行2次PCR，第二次PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用Takara公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與PMD18-T載體過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用100mg/ml青霉素的LB板上篩選陽(yáng)性克隆，并對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步用載體引物進(jìn)行菌落PCR確定后測(cè)序，一共得到32條ERF相關(guān)基因的3’末端序列；(3)枇杷果實(shí)的RNA的提取采用CTAB法提取，粗提的RNA用TURBODNase去除其中的DNA,取IUI去DNA的RNA用NanophotometerPearl定量后，取3Ug用RevertAidFirstStrandcDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用于定量PCR;(4)以冷敏性紅肉枇杷洛陽(yáng)青為材料進(jìn)行以下3個(gè)處理直接0°C貯藏；熱激，即40°C4小時(shí)后轉(zhuǎn)入0°C貯藏；程序降溫，即5°C6天后轉(zhuǎn)入0°C貯藏；檢測(cè)3個(gè)處理過(guò)程中硬度、木質(zhì)素含量的變化情況；(5)對(duì)篩選出的32個(gè)乙烯響應(yīng)因子用在線網(wǎng)站http://frodo.wi.mit.edu/primer3/設(shè)計(jì)定量PCR的引物，引物序列見(jiàn)SEQIDN0:33-64，以枇杷管家基因Actin作為內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)SEQIDN0:65，處理前的起始點(diǎn)表達(dá)量為1，計(jì)算方法采用AACt相對(duì)定量的方法計(jì)算3個(gè)處理過(guò)程中ERF基因的表達(dá)量；(6)結(jié)合紅肉枇杷洛陽(yáng)青果實(shí)貯藏的三個(gè)處理中((TC、熱激、程序降溫)的硬度、木質(zhì)素含量的變化情況以及ERF基因的表達(dá)情況，篩選出2個(gè)與枇杷果實(shí)木質(zhì)化進(jìn)行有一定相關(guān)性的ERF基因，分別為SEQIDN0:66和SEQIDN0:67。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述二次PCR的第一次反應(yīng)參數(shù)%10XExBuffer2yL，2.5mmol/LdNTPsI.6iil，外測(cè)引物UPM2yL，10ymol/L特異外測(cè)引物0.5iiI,ExTaq聚合酶0.IUL,加滅菌的雙蒸水至20iiL,TouchdownPCR反應(yīng)條件為反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性30S，72°C，150s，5個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，68°C退火30s，72°C延伸150s，5個(gè)循環(huán)；94°C變性30s，65°C退火30s，72°C延伸150s，25個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min；第二次反應(yīng)參數(shù)為10XExBuffer2yL，2.5mmol/LdNTPs1.6UI,內(nèi)測(cè)引物NUP2iiL，10iimol/L特異內(nèi)測(cè)引物0.5yl，ExTaq聚合酶0.IUL，加滅菌的雙蒸水至20UL,94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸90S，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10min。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述的計(jì)算基因表達(dá)量的方法是以枇杷管家基因Actin作為內(nèi)參基因，處理前的起始點(diǎn)表達(dá)量為1，計(jì)算方法采用AACt相對(duì)定量的方法；反應(yīng)體系為SsoFastEvaGreensupermix10uI,10Mm的上下游引物各IU1，模板2iU，加無(wú)菌水至20iU;反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性30s;95°C變性5s，60°C退火5S，45個(gè)循環(huán)。全文摘要本發(fā)明提供一種枇杷中與木質(zhì)素代謝相關(guān)的乙烯響應(yīng)因子克隆與轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法，通過(guò)從枇杷深度測(cè)序的結(jié)果中獲得乙烯響應(yīng)因子(ERF)序列片段，乙烯響應(yīng)因子(ERF)3’末端序列的獲得，乙烯響應(yīng)因子(ERF)在木質(zhì)素合成代謝中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法。本發(fā)明利用深度測(cè)序的結(jié)果，克隆到枇杷中乙烯響應(yīng)因子(ERF)Unigene的3’末端核甘酸序列，一共獲得到32個(gè)3’末端序列，并對(duì)這些乙烯響應(yīng)因子在0℃、HT、LTC處理的枇杷果實(shí)中ERF表達(dá)量的變化，得出與冷害木質(zhì)化有關(guān)的2個(gè)ERF基因家族成員，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制、果實(shí)采后保鮮技術(shù)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。文檔編號(hào)G01N21/64GK102747068SQ201210195408公開(kāi)日2012年10月24日申請(qǐng)日期2012年6月14日優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日發(fā)明者孫崇德,徐倩,殷學(xué)仁,閔婷,陳昆松申請(qǐng)人:浙江大學(xué)