專利名稱：杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材的指紋圖譜的建立方法，尤其是杠板歸藥材高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜的建立方法，以及由此方法所得到的杠板歸藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
背景技術(shù)：
我國傳統(tǒng)的中藥及其制劑大多缺乏嚴(yán)密的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和科學(xué)的檢測手段，難以有效的控制其內(nèi)在質(zhì)量，不能保證用藥的安全、有效，也不符合國際醫(yī)藥市場的要求，嚴(yán)重制約了我國中藥行業(yè)的發(fā)展。加強(qiáng)中藥材質(zhì)量控制研究是中藥規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵問題。只有對中藥材進(jìn)行科學(xué)的質(zhì)量控制，才能保證中藥質(zhì)量，實現(xiàn)中藥的“安全、有效、穩(wěn)定、可控”。杠板歸(Polygonum perfoliatum L.)為寥科寥屬植物，其以全草入藥，性味酸、苦、寒，有小毒，具有清熱解毒、利水消腫、清熱活血等功效；別名蛇不過、蛇倒退、貓爪刺、梨頭刺等；廣布于四川、湖南、貴州等地，生于山谷、灌木叢中或水溝旁；是貴州常用的苗族 藥材，在民間有廣泛應(yīng)用，在治療炎癥尤其是婦科炎癥方面有很好的療效。它具有較高的藥用價值，全株可入藥，并且療效確切，具有很大的開發(fā)潛力。杠板歸藥材成分復(fù)雜，主要包括以下幾類黃酮類、蒽醌類化合物、苯丙素類化合物、香豆素類的衍生物、苯丙素類及其他一些常見物質(zhì)。研究表明，杠板歸藥材具有一定的藥理作用。因此，對其某ー種或幾種活性成分進(jìn)行檢測，就有失全面，不能真實反映杠板歸藥效的整體性。要全面有效地控制杠板歸及其成方制劑的質(zhì)量，必須對它的物質(zhì)群整體予以控制。中藥指紋圖譜是指某種中藥材或中成藥中所共有的、具有特征性的某類或數(shù)類成分的色譜或光譜的圖譜。在現(xiàn)階段中藥的有效成分絕大多數(shù)沒有明確的情況下，指紋圖譜對于有效控制中藥材或中成藥的質(zhì)量，具有重要的意義。日本漢方藥主要生產(chǎn)企業(yè)在20世紀(jì)80年代就采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。德國、法國在對銀杏葉提取物的質(zhì)量控制中亦采用高效液相指紋圖譜方法。美國FDA近幾年制定的植物草藥指南中已經(jīng)明確把指紋圖譜作為混合物質(zhì)群的質(zhì)量控制方法。指紋圖譜作為中草藥及其提取物質(zhì)量控制方法，目前已成為國際共識。為了有效控制及評價杠板歸藥材的質(zhì)量，使其質(zhì)量控制技術(shù)更加完善、科學(xué)，申請人對杠板歸こ醇提取物進(jìn)行了全面系統(tǒng)的指紋圖譜研究，建立了杠板歸藥材こ醇提取物的指紋圖譜測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明通過對杠板歸藥材HPLC指紋圖譜的研究，提供了一種更好的杠板歸質(zhì)量檢測方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足，使杠板歸藥材的質(zhì)量控制技術(shù)更為完善、科學(xué)。本發(fā)明的技術(shù)方案杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法包括以下步驟( I)供試品溶液的制備取杠板歸藥材粉碎，過篩，稱取樣品，用こ醇加熱回流提取I 4次，每次O. 5-3小時，然后濃縮，用甲醇定容,過濾,濾液作為供試品溶液；(2)對照品溶液的制備取適量槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸對照品，分別加入甲醇制成對照品溶液；(3)測定分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，用高效液相色譜儀測定；將杠板歸供試品溶液注入高效液相色譜儀，以O(shè). 05%H3P04水溶液為A相、こ腈為B相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液進(jìn)入DAD紫外檢測器，檢測器采集85min的檢測數(shù)據(jù)；
(4)以對照品色譜峰的相對保留時間和峰面積為1，計算供試品色譜峰的相對保留時間和峰面積，用指紋圖譜軟件對所得的數(shù)據(jù)和圖譜進(jìn)行處理，即得到杠板歸藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。前述方法中，高效液相色譜測定時的色譜條件為色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為B相こ腈和A相O. 05%H3P04水溶液；檢測波長340nm ;流速lmL/min。前述方法中，供試品溶液的制備過程為取杠板歸藥材粉碎過40目篩，準(zhǔn)確稱取樣品I克，加入70%こ醇溶液80mL，置于80°C水浴中，加熱回流提取I次、3h，然后濃縮至干，用甲醇定容至25mL，過濾，即得供試品溶液。前述方法中，對照品溶液的制備為取槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸兩種對照品，分別加入甲醇，制成每Irnl分別含10 μ g槲皮素、10 μ g槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸的兩種對照品溶液。前述方法的步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20 μし前述方法的流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的Α、B相變化為0 lOmin，B相10% 15% ；10 40min，B 相 15% 25% ；40 55min，B 相 25% 35% ；55 75min，B 相35% 50% ；75 76min，B 相 50% 90% ；76 85min，B 相 90%。如上所述杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法得到的杠板歸藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；該圖譜中的共用峰不得少于15個。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)I.研究表明，杠板歸藥材有各種具體的藥理作用，若對其某ー種活性成分進(jìn)行檢測，就有失全面。本發(fā)明以杠板歸こ醇提取物建立起來的HPLC指紋圖譜，提供了一種可全面評價杠板歸藥材的科學(xué)途徑，能有效地表征杠板歸藥材的質(zhì)量，可作為杠板歸藥材質(zhì)量檢測和質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)之一。2.將杠板歸藥材指紋圖譜作為ー個整體看待，注重其整體面貌特征，既避免了只測定一、兩個化學(xué)成分來判定杠板歸整體質(zhì)量的片面性，又減少了為質(zhì)量達(dá)標(biāo)而人為處理的可能性。本發(fā)明為完整、準(zhǔn)確評價杠板歸藥材的質(zhì)量提供了新的對照標(biāo)準(zhǔn)，為提高杠板歸及其成方制劑的質(zhì)量和療效做出貢獻(xiàn)。3.本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高以及重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。由于指紋圖譜不是為了測定某個成分的精確含量，而是要充分反映化學(xué)成分的信息。因此，本發(fā)明選擇在340nm波長處進(jìn)行測定，其出峰較多，反映的信息較完全；各個峰吸收值良好，基線平穩(wěn)，也避免了近紫外雜質(zhì)峰較大吸收情況。4.以往為測定杠板歸中某種化學(xué)成分的含量，往往要對樣品進(jìn)行較復(fù)雜的處理，而本發(fā)明選用加熱回流提取其成分，提取方法簡單，節(jié)約了檢驗的成本和時間。5.本發(fā)明方法所得杠板歸指紋圖譜的峰多，峰形好，易于鑒別，相似性高，準(zhǔn)確可靠。下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)ー步的說明。


圖I是加熱回流提取的杠板歸藥材指紋圖譜。圖2是超聲提取的杠板歸藥材指紋圖譜。圖3是甲醇作為提取溶劑的杠板歸HPLC指紋圖譜。圖4是90%こ醇作為提取溶劑的杠板歸HPLC指紋圖譜。圖5是70%こ醇作為提取溶劑的杠板歸HPLC指紋圖譜。圖6是こ酸こ酯作為提取溶劑的杠板歸HPLC指紋圖譜。圖7是以CH3CN-O. 2%HC00H為流動相按不同梯度進(jìn)行測定的杠板歸指紋圖譜。圖8是以CH3CN-O. 2%HAc為流動相按不同梯度進(jìn)行測定的杠板歸指紋圖譜。 圖9是以CH3CN-O. 02%H3P04為流動相按不同梯度進(jìn)行測定的杠板歸指紋圖譜。圖10是以CH3CN-O. 05%H3P04為流動相按不同梯度進(jìn)行測定的杠板歸指紋圖譜。圖11是用色譜柱ZORBAX SB-C18 (4. 6 X 250mm，5 μ m)測得的杠板歸藥材指紋圖
-i'Tfeレ曰。圖12是用色譜柱Eclipse XDB-C8 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)測得的杠板歸藥材指紋圖
-i'Tfeレ曰。圖13是用色譜柱Lichrospher C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)測得的杠板歸藥材指紋圖譜。圖14是在258nm波長處進(jìn)行測定的杠板歸藥材指紋圖譜。圖15是在310nm波長處進(jìn)行測定的杠板歸藥材指紋圖譜。圖16是在340nm波長處進(jìn)行測定的杠板歸藥材指紋圖譜。圖17是在370nm波長處進(jìn)行測定的杠板歸藥材指紋圖譜。圖18是杠板歸藥材指紋圖譜的共有模式圖。圖19是杠板歸藥材指紋圖譜的疊加圖。圖20是杠板歸藥材HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
具體實施例方式
具體實施例方式杠板歸藥材HPLC指紋圖譜的建立方法及杠板歸藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜I.儀器與試藥I. I 儀器安捷倫1100高效液相色譜儀；安捷倫DAD檢測器；安捷倫色譜工作站。I. 2 試藥槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸，由實驗室成員分離純化，經(jīng)IR、IH-NMR和13C-NMR等圖譜數(shù)據(jù)鑒定為槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸；こ腈，色譜純；樂百氏純凈水；針筒式微孔濾膜過濾器，直徑13mm，0. 45 μ m ;杠板歸藥材。2.方法與結(jié)果2. I提取方法的選擇在實驗過程中，選擇加熱回流和超聲提取兩種方式進(jìn)行了測定，分別見附圖I、圖2，結(jié)果表明，加熱回流提取，能夠體現(xiàn)更多的化學(xué)成分。為了更好更全面地選取指紋圖譜的條件，實驗對甲醇、90%こ醇、70%こ醇、こ酸こ酯等溶劑進(jìn)行了測定，分別見附圖3、圖4、圖5、圖6，結(jié)合幾個大峰峰面積的比較，結(jié)果70%こ醇提取效果最好。實驗對70%こ醇的用量進(jìn)行了考察，分別用40mL、60mL、70mL、80mL來提取杠板歸藥材，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80mL用量是最好的。還對加熱回流提取時間2h、3h、4h、5h進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn),加熱回流3h是最適合的提取時間。綜上所述，供試品溶液的制備 條件為取不同批次杠板歸藥材粉末各約lg，精密稱定，置于150mL具塞錐形瓶中，加入70%こ醇80mL，置水浴中加熱回流3h (80°C )，冷卻，濾過，取續(xù)濾液，水浴揮干，浸膏用甲醇定容至25mL容量瓶中，用O. 45Mm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。2. 2色譜條件2. 2. I流動相的選擇申請人:用了四組流動相來進(jìn)行比較，即CH3CN -O. 2%HC00H水系統(tǒng)、CH3CN -O. 2%HAc水系統(tǒng)、CH3CN -O. 02%H3P04水系統(tǒng)、CH3CN -O. 05%H3P04水系統(tǒng)。所得結(jié)果分別見附圖7、圖8、圖9、圖10。由圖可見，圖10的譜圖最好。也就是CH3CN-O. 05%H3P04水系統(tǒng)作為流動相效果比其他3種系統(tǒng)明顯要好，梯度洗脫效果最佳，譜圖上各個色譜峰的分離度良好，保留時間適中，因此選擇CH3CN-O. 05%H3P04水系統(tǒng)作為流動相梯度洗脫系統(tǒng)。2. 2. 2液相色譜柱的選擇指紋圖譜的研究一般需要用三根以上不同的色譜柱進(jìn)行比較，經(jīng)過實驗比較后，固定用同一根色譜柱做完整個指紋圖譜。申請人考察了 3根不同的色譜柱[①色譜柱ZORBAX SB-C18(4. 6X250mm，5ym) !② EclipseXDB_C8 (4· 6 X 250mm，5 μ m)色譜柱；③色譜柱Lichrospher C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)],在選定的相同色譜條件下進(jìn)行測定。由所得譜圖結(jié)果(見附圖11、圖12、圖13)可見柱③的分離效果最好，柱效最高，故選擇柱③進(jìn)行杠板歸藥材指紋圖譜的檢測。2. 2. 3檢測波長的選擇為了獲取多層次的信息，申請人選擇了 258nm、310nm、340nm及370nm四個波長同時測定，并進(jìn)行全波長掃描，選取最佳波長，見附圖14、圖15、圖16及圖17，結(jié)果在波長340nm下出現(xiàn)的色譜峰較多，槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸吸收最強(qiáng)，且基線平穩(wěn)，故選擇340nm作為杠板歸HPLC指紋圖譜的檢測波長。通過以上實驗，確定色譜條件如下色譜柱LichrospherC18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m);流動相こ腈-O. 05% 磷酸水溶液；流速lmL/min ;檢測波長340nm ;柱溫30で。3.杠板歸藥材指紋圖譜的測定3. I. I杠板歸指紋圖譜的制備對照品溶液的制備取槲皮素、槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸兩種對照品，分別加入甲醇，制成姆Iml分別含10 μ g槲皮素、10 μ g槲皮素-3_0_β _D_葡萄糖醒酸的兩種對照品溶液。參照物選用槲皮素、槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸作為參照物。供試品溶液的制備取不同批次杠板歸藥材粉末各約lg，精密稱定，置于150mL具塞錐形瓶中，加入70%こ醇80mL，置水浴中加熱回流3h(80°C )，冷卻，濾過，取續(xù)濾液，水浴揮干，浸膏用甲醇定容至25mL容量瓶中，用O. 45ΜΠ1濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20 μ L，分別注入高效液相色譜儀，進(jìn)行測定，記錄85分鐘的色譜圖，即得到所需指紋圖譜。以槲皮素、槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸色譜峰的相對保留時間和峰面積計算供試品色譜峰的相對保留時間和峰面積。同吋，用指紋圖譜軟件對所得數(shù)據(jù)和圖譜進(jìn)行處理即得到標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。3. I. 2精密度實驗取修文扎佐的杠板歸藥材，按本發(fā)明技術(shù)方案所述的供試品溶液制備方法制備供試品，連續(xù)進(jìn)樣6次，以槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸為檢測指標(biāo)，計算相對峰面積的RSD 為2. 47%，結(jié)果表明儀器精密度良好。3. I. 3穩(wěn)定性實驗取修文扎佐的杠板歸藥材，按本發(fā)明技術(shù)方案所述的供試品溶液制備方法制備供試品，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，進(jìn)樣量為20 μ L，以槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸為檢測指標(biāo)，計算相對峰面積的RSD為2. 51%，結(jié)果表明在24小時內(nèi)，杠板歸指紋圖譜的色譜圖基本穩(wěn)定，沒有明顯變化，符合指紋圖譜要求。3. I. 4重現(xiàn)性實驗取修文扎佐的杠板歸藥材6份，按本發(fā)明技術(shù)方案所述的供試品溶液制備方法平行制備6份供試品，分別進(jìn)樣，以槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸為檢測指標(biāo)，計算相對峰面積的RSD為2. 51%，結(jié)果表明該方法的重現(xiàn)性良好。3. I. 5杠板歸藥材指紋圖譜共有峰的確定和相似度計算通過對全國51批不同產(chǎn)地的杠板歸藥材指紋圖譜的測定，藥材來源見表1，并通過計算機(jī)輔助相似度評價系統(tǒng)指紋圖譜軟件(國家藥典委員會中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A))對色譜圖和測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，確定共有峰15個。得到了 51批藥材的指紋圖譜疊加圖(附圖19)，指紋圖譜共有模式圖(附圖18)，藥材指紋圖譜的相似性分析結(jié)果(表2,序號同表1)，其中以槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醒酸為參照物,其峰為6號峰(附圖18)。全國不同產(chǎn)地杠板歸指紋圖譜相似度計算和相似性分析結(jié)果如下表I 51批杠板歸藥材來源
權(quán)利要求
1.一種杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于包括以下步驟 (1)供試品溶液的制備取杠板歸藥材粉碎，過篩，稱取樣品，用乙醇加熱回流提取I 4次，每次O. 5-3小時，然后濃縮，用甲醇定容，過濾，濾液作為供試品溶液； (2)對照品溶液的制備取適量槲皮素、槲皮素-3-0-β-D-葡萄糖醛酸對照品，分別加入甲醇制成對照品溶液； (3)測定分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液，用高效液相色譜儀測定；將杠板歸供試品溶液注入高效液相色譜儀，以O(shè). 05%Η3Ρ04水溶液為A相、乙腈為B相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫液進(jìn)入DAD紫外檢測器，檢測器采集85min的檢測數(shù)據(jù)； (4)以對照品色譜峰的相對保留時間和峰面積為1，計算供試品色譜峰的相對保留時間和峰面積，用指紋圖譜軟件對所得的數(shù)據(jù)和圖譜進(jìn)行處理，即得到杠板歸藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖-i'TfeP曰。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于高效液相色譜測定時的色譜條件為色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相為B相乙腈和A相O.05%H3P04水溶液；檢測波長340nm ;流速lmL/min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于供試品溶液的制備過程為取杠板歸藥材粉碎過40目篩，準(zhǔn)確稱取樣品I克，加入70%乙醇溶液80mL，置于80°C水浴中，加熱回流提取I次、3h，然后濃縮至干，用甲醇定容至25mL，過濾，即得供試品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于對照品溶液的制備為取槲皮素、槲皮素-3_0-i3-D-葡萄糖醛酸兩種對照品，分別加入甲醇，制成每Iml分別含10 μ g槲皮素、10 μ g槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸的兩種對照品溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于步驟(3)中分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各20 μ L0
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于流動相梯度洗脫過程中，洗脫液的Α、B相變化為0 lOmin，B相10% 15% ；10 40min，B相15% 25% ；40 55min，B 相 25% 35% ；55 75min，B 相 35% 50% ；75 76min，B 相 50% 90% ；76 85min, B 相 90%。
7.如權(quán)利要求I所述杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法得到的杠板歸藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖-i'TfeP曰。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的杠板歸藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，其特征在于所述圖譜中的共用峰不得少于15個。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種杠板歸藥材指紋圖譜的建立方法，包括以下步驟供試品溶液的制備、對照品溶液的制備、高效液相色譜儀測定及對數(shù)據(jù)和圖譜的處理，以及由該方法得到的杠板歸藥材標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好，所得杠板歸指紋圖譜的峰多，峰形好，峰分離效果好，峰面積較大，易于鑒別，相似性高，準(zhǔn)確可靠；可作為杠板歸藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；提供了一種可全面評價杠板歸藥材的科學(xué)途徑，能有效地表征杠板歸藥材的質(zhì)量，可作為杠板歸藥材質(zhì)量檢測和質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)之一，為提高杠板歸及其成方制劑的質(zhì)量和療效做出貢獻(xiàn)。
文檔編號G01N30/06GK102735766SQ201210161280
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月23日
發(fā)明者周欣, 田莉, 趙超, 陳華國 申請人:貴州師范大學(xué), 貴州遠(yuǎn)程制藥有限責(zé)任公司