專利名稱：安胃瘍指紋圖譜的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物分析檢測領(lǐng)域，涉及ー種甘草提取物指紋圖譜的建立方法。
背景技術(shù)：
隨著現(xiàn)代藥物分析技術(shù)的發(fā)展，指紋圖譜技術(shù)是當今國際公認的控制中藥質(zhì)量的質(zhì)控模式，它在原藥材的栽培、引種，中成藥生產(chǎn)エ藝的規(guī)范與優(yōu)化，產(chǎn)品質(zhì)量標準的制定等方面都提供全方位的質(zhì)量保證。
近年來，國外對中草藥產(chǎn)品的質(zhì)量評價也在提倡指紋圖譜。隨著各種分析技術(shù)的創(chuàng)新和提高以及計算機應用技術(shù)的不斷發(fā)展，世界各國對天然藥物的了解和研究在不斷深入，中藥指紋圖譜技術(shù)在國內(nèi)外已成為ー種發(fā)展趨勢，其研究的方法和技術(shù)更趨成熟完善，成為國際公認的控制中藥和天然藥質(zhì)量最有效的方法和手段。日本漢方藥在20世紀80年代就采用高效液相指紋圖譜控制質(zhì)量。歐共體也將指紋圖譜監(jiān)控技術(shù)應用于植物藥質(zhì)量控制，美國食品藥品管理局(FDA)允許草藥保健品申報資料時提供色譜指紋圖，要求植物藥在質(zhì)量控制方面，必須制訂指紋圖譜的檢測標準。世界衛(wèi)生組織在1996年草藥評價指導原則中也規(guī)定如果草藥的活性成分不明，可以提供色譜指紋圖以證明產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。英國、印度、加拿大等國家在植物藥的研究中，也對指紋圖譜十分重視。在許多國家的藥典中，色譜指紋圖譜已成為主要的分離分析方法。目前，國外許多研究機構(gòu)對中藥指紋圖譜的研究主要為建立指紋圖譜與藥效的相關(guān)性研究，是以中藥理論和新藥開發(fā)研究體系為主的模式。在我國藥典的中藥部分，這ー分析技術(shù)還未占主導地位。在醫(yī)藥科技“十五”計劃中，重點提出解決中藥材質(zhì)量規(guī)范化問題。2000年，國家藥品監(jiān)瞀管理局頒布了《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》，要求中藥注射劑必須進行指紋圖譜的研究，并建立其相關(guān)的標準。規(guī)范了中藥指紋圖譜的研究，從而促進了國內(nèi)近幾年來對指紋圖譜的研究熱潮。我國對中藥指紋圖譜的研究尚處于初級階段，與發(fā)達國家相比有一定差距。目前主要為使用各種方法建立中藥材及制劑的指紋圖譜，以及對相應信息進行數(shù)字化處理，使其能夠評價和控制中藥材及制劑的質(zhì)量。影響中藥及民族藥發(fā)展的最重要原因之ー是無法確定其有效成分的質(zhì)與量，自從指紋圖譜被發(fā)現(xiàn)應用到中藥及民族藥的質(zhì)量控制這ー領(lǐng)域，得到國家的大力支持與推廣，國內(nèi)許多大學及研究所都在開展這方面的工作，并獲得了一定的成功，如銀杏葉、板藍根等。國內(nèi)ー些知名制藥企業(yè)開始研究使用色譜技術(shù)提高中藥材及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制標準，隨著檢測技術(shù)與儀器的發(fā)展經(jīng)過十多年的努力，已有數(shù)個中藥品種(針劑)的指紋圖譜獲得成功，但利用指紋圖譜技術(shù)在中藥固體制劑領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)化研究還沒有普及，只有少數(shù)幾家著名的有實カ的制藥企業(yè)取得幾個中藥產(chǎn)品的指紋圖譜并應用于生產(chǎn)(白云山藥業(yè)的板蘭根顆粒)。高效液相色譜法(HPLC)高效液相色譜具有分離效率高，分析速度快，定量精密度高，檢測器種類多，穩(wěn)定性好等特點。不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，樣品中大多數(shù)成分均可在高效液相色譜儀上進行分析檢測，是構(gòu)建指紋圖譜的主要方法之一。安胃瘍?yōu)楦什萏崛∥?，具有補中益氣，解毒生肌，抑制胃液分泌，修復和保護胃粘膜的效果，適用于胃及十二指腸球部潰瘍，對虛寒型和氣滯型患者療效較好，還可用于潰瘍愈合后的維持治療。目前的質(zhì)量標準是檢查安胃瘍中幾十種總黃酮類化合物的總含量，無法體現(xiàn)各種黃酮的特征，質(zhì)量沒有得到真正有效的控制，例如安胃瘍(原料藥)的現(xiàn)行質(zhì)量標準編號為WS3-001-(Z-001)-98-(Z)，其中規(guī)定總黃酮含量測定的方法為重量法，由于重量法操作誤差較大，受人為因素的影響較大，故重現(xiàn)性較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用HPLC-T0F-MS技術(shù)，用不同的色譜方法指認若干個黃酮単體化合物，找出其具有特征的指紋特性，建立了安胃瘍中黃酮類成分的高效液相色譜特征圖譜。獲得這類化合物的色譜條件，建立指紋檔案，使這類化合物的質(zhì)量得以真正控制，為安胃瘍質(zhì)量 標準的提高提供技術(shù)支撐，也為其產(chǎn)品的可控可靠提供依據(jù)。因此，本發(fā)明的目的是，提供ー種甘草提取物，例如安胃瘍的指紋圖譜建立方法。本發(fā)明的另ー個目的是，提供ー種甘草提取物，例如安胃瘍的檢測方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供ー種甘草提取物，優(yōu)選為安胃瘍的指紋圖譜建立方法，所述方法包括采用高效液相色譜法檢測甘草提取物，優(yōu)選為安胃瘍中黃酮類化合物的含量，其中所述高效液相色譜的條件如下色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充相；流動相為體積比為22:78 75:25的こ腈和O. θΓθ. 1% (體積比)的三氟醋酸水溶液進行梯度洗脫；流速為O. 5^1. 5 mL/min ;柱溫為25 40°C ;紫外檢測波長為270nm ;理論塔板數(shù)按查爾酮A峰計算，應不低于3000。優(yōu)選地，所述方法還包括通過以下方法制備對照品溶液取甘草查爾酮A對照品，加入70% (體積比)こ醇水溶液制成每Iml含O. 8mg的溶液，作為對照品溶液。優(yōu)選地，所述方法還包括通過以下方法制備供試品溶液取甘草提取物內(nèi)容物
O.lg，置25ml量瓶中，加70% (體積比)こ醇水溶液20ml，超聲提取5分鐘，取出，放冷，以70%こ醇水溶液定容至刻度，搖勻，用O. 2 μ m微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供的方法包括如下步驟( I)對照品溶液的制備取甘草查爾酮A對照品，加入70% (體積比)こ醇水溶液制成每Iml含O. 8mg的溶液，作為對照品溶液；(2)供試品溶液的制備取甘草提取物內(nèi)容物O. lg，置25ml量瓶中，加70% (體積比)こ醇水溶液20ml，超聲提取5分鐘，取出，放冷，以70% (體積比)こ醇水溶液定容至刻度，搖勻，用O. 2 μ m微孔濾膜濾過，作為供試品溶液；以及(3)測定精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下色譜條件進行測定，得到指紋圖譜色譜柱AgelaVenusil MP 5 μ m C18-IOOA 4. 6 X 250mm ；流動相體積比為22:78 75:25的こ腈和O. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液，進行梯度洗脫；流速1.O mL/min ；
柱溫30V ;紫外檢測波長270 nm。優(yōu)選地，所述梯度洗脫程序按如下體積比設(shè)置進行O分鐘時，流動相為22%的こ腈和78%的O. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液；10分鐘時，流動相為25%的こ腈和75%的O. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液；15分鐘時，流動相為30%的こ腈和70%的O. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液；25分鐘時，流動相為35%的こ腈和65%的O. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液；

80分鐘時，流動相為60%的こ腈和40%的O. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液；
90分鐘時，流動相為75%的こ腈和25%的O. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液；100分鐘時，流動相為75%的こ腈和25%的O. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液。優(yōu)選地，所述建立的指紋圖譜中包括7個特征峰，且所述各特征峰的相對保留時間分別為0. 52±0· 05 (峰 1),0. 65±0· 05 (峰 2),0. 80±0· 05 (峰 3),0. 93±0· 05 (峰 4)、1·00±0·05 (S 峰)、I. 07±0· 05 (峰 6)、I. 15±0· 05 (峰 7)。另ー方面，本發(fā)明提供一種檢測甘草提取物，例如安胃瘍中黃酮類化合物的方法，所述方法采用上述方法建立的指紋圖譜來檢測甘草提取物，例如安胃瘍中的黃酮類化合物?？梢姡景l(fā)明人研究用不同的色譜方法找出其具有特征的指紋特性，獲得這類化合物的色譜條件，建立指紋檔案，使這類化合物的質(zhì)量得以真正控制，為安胃瘍質(zhì)量標準的提高提供技術(shù)支撐。具體地，通過文件檢索和方法學論證，摸索色譜條件(峰種類、峰面積、保留時間)，比較種類與含量，利用高效液相法建立適用于安胃瘍的指紋圖譜，提高安胃瘍及其制劑的質(zhì)量標準，使產(chǎn)品質(zhì)量可控可靠；根據(jù)指紋圖譜，選擇利用原料，提高產(chǎn)品收率，増加經(jīng)濟效益。本發(fā)明提供的方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好，能有效表征甘草提取物(例如安胃瘍)的質(zhì)量，有利用于監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖IA為實施例2中樣品峰指認圖譜；圖IB為實施例2中對照品峰疊加圖譜；圖2為本發(fā)明提供的安胃瘍的指紋圖譜；圖3為實施例4中精密度考察的色譜結(jié)果圖；圖4為實施例4中穩(wěn)定性考察的色譜結(jié)果圖；圖5為實施例4中重復性考察的色譜結(jié)果圖。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下各實施例中所使用的對照品來源如下
甘草苷，購自中國藥品生物制品檢定所，批號111610-200604 ;甘草酸銨，購自中國藥品生物制品檢定所，批號111731-200614 ;甘草查耳酮A，購自上海同田生化技術(shù)有限公司，批號10091421o以下各實施例中所使用的供試品可購自新疆全安藥業(yè)有限公司，其制備方法如下取經(jīng)提取甘草浸膏或甘草酸粉后的甘草渣，用93%以上的こ醇水溶液提取兩遍，每遍I小時，合并提取液濃縮至稠膏狀，加2. 0%的碳酸鈉溶液溶解，沉淀24小時，取上清液用10. 0%的鹽酸中和至PH值2-3，過濾，沉淀物用純化水洗滌至pH值6，沉淀物經(jīng)40_50°C干燥后，即得甘草提取物。以下各實施例中所使用的色譜儀為美國Agilent 1100系列(G1322A在線真空脫氣機，G1311A四元梯度泵，G1313A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315B ニ極管陣列檢測器)。實施例I供試品溶液的制備本實施例從以下幾方面對供試品溶液的制備方法進行了考察。 I、提取溶劑以水、30%こ醇水溶液、50%こ醇水溶液、70%こ醇水溶液、無水こ醇為提取溶劑，采
用超聲提取方法，對同一批供試品進行了提取溶劑考察。結(jié)果表明(圖未示出)，水及30%こ醇水溶液提取率過低，且40min后色譜峰成分幾乎未提取出來，50%こ醇水溶液與70%こ醇水溶液提取效果相當，無水こ醇提取率低于50%こ醇水溶液及70%こ醇水溶液，因此選用與藥典中含量測定方法相同的70%こ醇水溶液作為供試品提取溶剤。2、供試品取樣量分別精密稱取安胃瘍內(nèi)容物O. 02g、0. 05g、0. lg、0. 2g置25ml量瓶中，以70%こ醇水溶液為溶劑，超聲提取30分鐘，制備供試品。結(jié)果表明，取樣量O. 02、. 05g,圖譜(未示出)中較多色譜峰響應值相應較低，而取樣O. 1,0. 2g各色譜鋒成分在圖譜中均能明顯顯示，考慮色譜柱的保護，選則O. Ig作為供試
品取樣量。3、提取時間考察在取樣量考察時，發(fā)現(xiàn)內(nèi)容物較易溶解，因此考察提取時間時分別考察了超聲時間15、30、45分鐘的提取效果，并同時使用人工振搖的方法制備了ー份供試品。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，四種方法幾乎無差異，但振搖提取需大力振搖才能使樣品全部溶解，比較費力，因此又考察了超聲5分鐘助溶的方法，對比圖譜(未示出)，亦無差異，因此選擇易操作的超聲5分鐘助溶的方法制備供試品。實施例2色譜條件與系統(tǒng)適用件試驗考察本實施例從以下各方面對安胃瘍指紋圖譜的色譜條件和與系統(tǒng)適用性進行了試
驗考察。I、指紋圖譜檢測方法的選擇文獻調(diào)研表明，甘草渣中成分主要以黃酮類成分為主，此類成分均有較好的紫外吸收，因此選用HPLC-UV檢測法進行指紋圖譜研究。2、指紋圖譜檢測波長的選擇文獻研究表明，甘草渣中主要含有黃酮類成分，其中多為查耳酮、ニ氫黃酮、異黃酮等，且甘草原藥材中尚含有甘草皂苷類成分，其紫外吸波長特征各不相同，有文獻報道使用波長梯度；采用ニ極管陣列檢測器對樣品進行全波長檢測，根據(jù)收集的三維圖譜(圖未示出)，并同時收集245 nm、270 nm、276nm(甘草苷最大吸收)、330nm、360 nm波長處的圖譜(圖未示出)。綜合考察，甘草渣在270 nm波長處的信息量最大且色譜峰峰高相當，因此最后確定270 nm為甘草渣指紋圖譜的檢測波長。3、指紋圖譜對照品峰指認研究過程中，對安胃瘍樣品進行了 HPLC-MS分析，通過HPLC-MS數(shù)據(jù)，并結(jié)文獻報道及對照品指認(對照品疊加圖譜見圖1B)，確定安胃瘍樣品中含有甘草苷、甘草酸、芒柄花素及甘草查兒酮A成分及各成分對應的色譜峰，具體參見圖1A。4、色譜柱考察 分別考察了Agela、Agilent、GRACE 及 Kromasil 四種色譜柱。結(jié)果表明，四種色譜柱的檢測圖譜各不相同，對色譜峰的分離各有特色(圖未示出)。相對比較，在同樣條件下，Agela色譜柱對樣品各色譜峰的分離度最佳，大部分色譜峰能達到基本分離，因此選用Agela Venusil MP 5 μ m C18-100A 4. 6 X 250mm色譜柱進行甘草渣指紋圖譜的測定。5、流動相洗脫系統(tǒng)考察實驗初期，在摸索指紋圖譜色譜條件時曾參考文獻分別考察了こ腈-O. 4%冰醋酸水、こ腈-O. 1%磷酸水系統(tǒng)，對比結(jié)果，磷酸水對色譜峰的分離效果優(yōu)于冰醋酸水；后又比較了こ腈-O. 01%三氟醋酸水系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸水和三氟醋酸水系統(tǒng)對大部分色譜峰的分離效果相當，只有個別色譜峰略有差異，綜合各色譜峰的分離效果(圖未示出)，確定使用こ腈-O. 01%三氟醋酸水作為指紋圖譜色譜洗脫系統(tǒng)，進行后續(xù)色譜條件摸索。6、柱流速的考察照HPLC色譜條件，分別考察了不同的柱流速(I. I ml/min, I. O ml/min,0. 9 ml/min ノ。結(jié)果表明，柱流速各成分分離效果的影響不明顯，僅個別色譜峰I. O ml/min的流速分離效果較好(圖未示出)，因此選用柱流速為I. Oml/min。7、柱溫考察照HPLC色譜條件，分別考察了 3種柱溫(25°C、30°C、35°C)。結(jié)果表明，柱溫各色譜峰成分分離效果的影響不明顯，略有差異(圖未示出)，30°C時5(T60min的色譜峰分離效果微佳，因此選用柱溫為30°C。8、指紋圖譜色譜條件2倍色譜峰采集時間考察供試品溶液進樣后，記錄200min的色譜圖，考察是否出峰完全(圖未示出)。結(jié)果表明，在此色譜條件下，100分鐘以后未檢出色譜峰。9、流動相空白考察在HPLC色譜條件下，不進樣單運行程序考察100分鐘的色譜圖，未檢測到任何色譜峰(圖未示出)，結(jié)果表明流動相空白對指紋圖譜檢測無影響。10、空白溶劑影響的考察在HPLC色譜條件下記錄空白溶劑(70%こ醇水溶液)100分鐘的色譜圖，未檢測到任何色譜峰(圖未示出)，結(jié)果表明空白溶劑對指紋圖譜檢測無影響。實施例3安胃瘍中甘草黃酮類物質(zhì)的檢測I.色譜柱型號為 Agela Venusil MP 5μπι C18-IOOA 4.6X250mm;2.流動相以こ腈為流動相A，以0.01%三氟醋酸(TFA)溶液為流動相B，按下表中的規(guī)定進行梯度洗脫；
權(quán)利要求
1.一種甘草提取物，優(yōu)選為安胃瘍指紋圖譜的建立方法，所述方法包括采用高效液相色譜法檢測甘草提取物，優(yōu)選為安胃瘍中黃酮類化合物的含量，其中所述高效液相色譜的條件如下 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充相； 流動相體積比為22:78 75:25的乙腈和0. 01 0. 1% (體積比)的三氟醋酸水溶液，進行梯度洗脫；流速0. 5 L 5 ml ,/mi n ； 柱溫:25 40。。； 紫外檢測波長270nm ； 理論塔板數(shù)按查爾酮A峰計算，應不低于3000。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括通過以下方法制備對照品溶液取甘草查爾酮A對照品，加入70%乙醇水溶液制成每Iml含0. 8mg的溶液，作為對照品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，取甘草提取物內(nèi)容物0.lg，置25ml量瓶中，加70% (體積比)乙醇水溶液20ml，超聲提取5分鐘，取出，放冷，以70% (體積比)乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，用0. 2 ii m微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟 (1)對照品溶液的制備取甘草查爾酮A對照品，加入70%乙醇水溶液制成每Iml含0.8mg的溶液，作為對照品溶液； (2)供試品溶液的制備取甘草提取物內(nèi)容物0.lg，置25ml量瓶中，加70%乙醇水溶液20ml，超聲提取5分鐘，取出，放冷，以70%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻，用0. 2iim微孔濾膜濾過，作為供試品溶液；以及 (3)測定精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10iil，注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下色譜條件進行測定，得到指紋圖譜色譜柱Agela Venusil MP 5 u m C18-IOOA 4. 6X 250mm; 流動相體積比為22:78 75:25的乙腈和0. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液，進行梯度洗脫；流速1. 0 mL/min ； 柱溫30°C ; 紫外檢測波長270nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脫程序按如下體積比設(shè)置進行 0分鐘時，流動相為22%的乙腈和78%的0. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液； 10分鐘時，流動相為25%的乙腈和75%的0. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液； 15分鐘時，流動相為30%的乙腈和70%的0. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液； 25分鐘時，流動相為35%的乙腈和65%的0. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液； 40分鐘時，流動相為45%的乙腈和55%的0. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液； 80分鐘時，流動相為60%的乙腈和40%的0. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液； 90分鐘時，流動相為75%的乙腈和25%的0. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液；.100分鐘時，流動相為75%的乙腈和25%的0. 01% (體積比)的三氟醋酸水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述建立的指紋圖譜中包括.7個特征峰，且所述特征峰的相對保留時間分別為峰 I :0. 52±0. 05 ；峰 2 :0. 65±0. 05 ；峰 3 :0. 80±0. 05 ；峰 4 :0. 93±0. 05 ；S 峰I.00±0. 05 ;峰6 :1. 07±0. 05 ;峰 7 :1. 15±0. 05。
7.—種檢測甘草提取物，優(yōu)選為安胃瘍中黃酮類化合物的方法，所述方法采用權(quán)利要求I至6中任一項所述方法建立的指紋圖譜來檢測甘草提取物，優(yōu)選為安胃瘍中黃酮類化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種甘草提取物，優(yōu)選為安胃瘍中的指紋圖譜建立方法。本發(fā)明所提供的采用高效液相色譜法檢測甘草提取物中黃酮類化合物的含量，其中所述高效液相色譜的條件如下色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠填充相；流動相為體積比為22:78~75:25的乙腈和0.01~0.1%的三氟醋酸，進行梯度洗脫；流速為0.5~1.5 mL/min；柱溫為25~40℃；紫外檢測波長為270nm。本發(fā)明提供的方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好，能有效表征甘草提取物的質(zhì)量，有利用于監(jiān)控產(chǎn)品的質(zhì)量。
文檔編號G01N30/06GK102680628SQ20121015694
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者屠鵬飛, 李海晶, 王海峰, 石子儀 申請人:新疆全安藥業(yè)有限公司