專利名稱：電化學檢測結合反應的方法
電化學檢測結合反應的方法本發(fā)明涉及一種直接且高靈敏度的電化學檢測溶液中的抗體-抗原結合反應和其他生物化學相互作用的方法。所述方法適用于診斷中不含洗滌且不含分離的免疫測定，特別適用于自動化及微流體免疫測定。所述方法還適用于廉價的免疫測定系統(tǒng)和一次性使用的測試條。免疫測定使用抗原-抗體反應以特異性檢測復雜介質如血液、血清、尿或食品中最小濃度的分析物。幾十年來，免疫測定已成為臨床診斷、環(huán)境分析和食品分析中不可缺少的工具，用于檢測最小濃度的激素、代謝物、蛋白質、生物標記、毒素、殺蟲劑、病原菌和病毒。許多最重要的臨床-診斷分析物僅用免疫測定可廉價且快速地測量，因為沒有提供高靈敏度(檢測納摩爾或更低濃度)和高特異性(在具有化學相似結構的干擾物質的存在下檢測分析物)的相當組合的備選分析化學方法。備選方法如色譜法(例如HPLC、氣相色譜法)常需要多步樣品制備，例如通過提取和化學衍生化進行制備。
自50年前Rosalyn Yalow和Salomon Berson發(fā)明免疫測定以來，已開發(fā)了許多不同的實施方案，被稱為不同的免疫測定形式(format)。異相形式如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)與均相形式之間的根本區(qū)別建立在用于檢測的抗體的聚集狀態(tài)的基礎上在異相測定中，將抗體(較少見的是抗原)固定在表面(反應管、微量滴定板、測試條)上；所有反應步驟(如洗滌和分離步驟，如檢測)同樣在該表面上進行。在均相形式中，不將任何結合配偶體(binding partner)固定，無需洗滌和分離步驟，并且檢測同樣在溶液中進行。區(qū)分的另一可能性來自使用的檢測方法。因為不可能使得抗體-抗原結合反應直接可見，所以結合配偶體之一必須與分子標志物(marker)或“標記(label) ”化學偶聯(lián)(例外基于表面等離子體共振的質量敏感型生物傳感器、光柵耦合器、石英晶體微天平、表面聲波以及實時直接測量分子結合反應的相似技術(如果結合配偶體之一固定在敏感表面上)。然而，這些方法迄今僅用于研究應用而不是常規(guī)分析中)。合適的標記必須具有高“比活度”，即每個標記分子必須產生盡可能多的信號傳導事件。最常用的標記包括放射性同位素(放射免疫測定，“RIA”)、熒光染料(熒光素、羅丹明等)、熒光半導體納米顆粒(“量子點”)、聚合物納米顆粒(“膠乳珠”，團聚免疫測定)以及酶如過氧化物酶，連同比色、熒光或化學發(fā)光酶底物(ELISA)。放射性同位素具有最高的比活度，甚至允許檢測單個標記分子。由于來自放射性的健康危害，相關的高實驗室要求(“同位素實驗室”)和高成本的殘余物處置，因此放射性免疫測定逐漸被備選方法如ELISA代替。不同免疫測定之間的另一區(qū)別由使用的抗體類型所致?？贵w為具有復雜結構的蛋白質，其具有決定結構并在所有抗體類別中具有相似組成的恒定區(qū)以及形成抗原結合位點的高度可變區(qū)。最初使用的包含多種具有可變的特異性和親和力的抗體的多克隆血清在許多應用中被單克隆抗體代替，所述單克隆抗體確切地僅包含一種具有明確定義的特異性和親和力的抗體實體(“克隆”)。理論上，可以制備任意量的具有相同性質的單克隆抗體。此夕卜，可以通過酶消化從完整抗體制備的所謂的抗體片段也用于一些分析。單鏈抗體是可以通過遺傳工程方法制備的重組抗體片段。原則上，所有類型的抗體以及由其衍生的分子結合劑(molecular binder)均可以用于已知的免疫測定形式中。
公知的可以用免疫測定檢測的臨床分析物包括hCG (妊娠試驗)、甲狀腺激素如TSH(甲狀腺病)、類固醇激素(內分泌學、能育性)和PSA(前列腺癌的生物標記)?？傮w而言，可以說基于單克隆抗體或多克隆抗血清的免疫測定是生物技術、臨床診斷、環(huán)境分析和食品分析的最重要的分析化學方法，并且具有高商業(yè)價值?，F(xiàn)有技術記載了多種進行免疫測定的方法。大多數(shù)異相免疫測定需要幾個人工過程，例如移液步驟、樣品稀釋、洗滌步驟，它們必須按照確切的時間方案。因此，通常需要為這些過程特別配備的專門人才和實驗室以正確進行這樣的測定。需要的檢測裝置(“酶標儀”、微量滴定板讀數(shù)器、免疫測定分析儀)昂貴且不便于攜帶。例如，進行ELISA測試的方案描述于專利[US4016043A、US3839153A]中。本領域技術人員容易地認識到這樣復雜的分析方法僅可以由專門人才進行，并且僅可以在合適的實驗室環(huán)境中進行。這樣的方法的自動化是非常艱巨的，并且需要高度復雜的自動機。
對于現(xiàn)場(on-site)使用，已接受異相橫向流動免疫測定形式(“測試條”免疫測定)。US6156271A記載了這種測定形式的現(xiàn)代變體。這種測試在加入樣品溶液后自動運行，并且在完全可視的基礎上進行檢測(由使用者讀出測試條上一條或兩條有色條帶的存在)。很明顯這樣的讀數(shù)方法不能產生定量結果(即濃度的精確測量)，而僅可能是是/否陳述或半定量陳述(濃度低于/高于某一閾值)。本領域技術人員已知相比之下,均相免疫測定(homogeneousimmunoassay)特別適合于實現(xiàn)快速、定量及全自動免疫測定。在均相免疫測定中，信號產生與結合反應同時進行。不同于上述異相免疫測定，均相免疫測定主要由僅一個或幾個配料(dosing)操作、溫育時間和檢測步驟組成。在理想情況下，在可以測量最終值之前僅需要混合樣品與預制的(ready-made)試劑混合物(所謂的“混合和測量”測試)。在I: I混合物即相同體積份的樣品和試劑混合物的情況下，可用具有高精度的最簡單的方法進行配料。本領域技術人員可以容易地認識到均相免疫測定還允許最短的可能的分析持續(xù)時間，因為在實現(xiàn)抗體與抗原之間的結合平衡之后立即測量是可能的。均相免疫測定的缺點是需要較高的化學合成支出以將結合反應與信號產生相關聯(lián)。在專利US4960693A中，記載了抗體-酶片段I結合物的合成，從而功能酶(“全酶”)僅在抗原-酶片段2結合物的結合之后形成。這樣的結合物的化學合成是在空間上是困難的，并且不同樣適合所有類型的分析物。此外，由于與酶反應關聯(lián)需要額外的反應時間，因此這種原理不被接受。用于低分子分析物的更普遍且化學上更簡單的方法是熒光偏振免疫測定，例如EP0200960A所述。在這種方法中，合成分析物(此處是雌三醇)與熒光染料(在大多數(shù)情況下為熒光素)的結合物。用線偏振激發(fā)光照射測量的溶液。只要該結合物在溶液中是游離的，則發(fā)出的熒光不是偏振的(消偏振的)。僅在結合至抗體之后，結合物的旋轉速度受限至這樣的程度，以致發(fā)出的熒光也是偏振的。通過這樣，可以實時測量結合平衡。這種方法的缺點是用于檢測的設備的高支出，因為檢測需要偏振單色光源和兩個裝備有偏振濾光片的熒光檢測器。因此，這種原理僅在特殊實驗室應用中被接受，但是在常規(guī)診斷和現(xiàn)場使用中則不被接受。此外，其僅適用于低分子分析物。對蛋白質分析物需要其他方法。Sellrie等人的方法中實現(xiàn)了技術上更容易的低分子分析物的檢測，其利用銪穴狀化合物免疫測定(abbr. :EuCr)作為實例[US2008199972A]。在這種情況下，合成EuCr-熒光素結合物，其中在EuCr和熒光素之間可存在盡可能短的接頭，所述接頭由I個至不超過3個亞甲基組成。除了抗EuCr抗體外，另外采用抗熒光素抗體，其在結合至熒光素后猝滅后者的熒光。信號產生原理是基于這樣的事實，為了空間原因，兩種抗體中僅一種可以結合至所述結合物。結合平衡和因此的熒光強度取決于游離EuCr的濃度，并且可以直接實時測量。該系統(tǒng)的優(yōu)點是僅需要一個常規(guī)熒光檢測器。缺點是其同樣僅適用于低分子分析物，并且結合物合成是在化學上 是困難的。同樣基于結合依賴性熒光猝滅原理的低分子分析物的備選均相免疫測定方法由Coille等人公開，并且其改進形式由Tan等人公開[I. Coille, S. Reder, S.Bucher and G. Gauglitz, Biomol. Eng 18 (2002)，273-280;ChongxiaoTan, NenadGajovic-Eichelmann, Walter F. M. Stocklein, Rainer Polzius, FrankF. Bier, AnalyticaChimica Acta 658 (2010)，187-192]。在這種情況下,將分析物四氫大麻酹偶聯(lián)至蛋白質牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白在表面上另外攜帶幾個熒光猝滅劑分子。將抗四氫大麻酚抗體與熒光分子綴合。當該抗體結合至結合物時熒光猝滅。如果分析樣品包含游離四氫大麻酚，則該抗體結合后者并再次發(fā)出熒光。如Sellrie等人所述，該方法的優(yōu)點是簡單的測量設置可以用于熒光測量。同樣地，在這種情況下，分析物-猝滅劑結合物和抗體-熒光團結合物的合成在化學上的困難是缺點。雖然熒光測量技術在生物科學中經(jīng)常采用，但是它是復雜的并因此是昂貴的測量技術。而例如用于現(xiàn)場使用的廉價且小巧的檢測器用其他檢測方法實現(xiàn)。電化學檢測方法使得技術上最簡單和最強集成的測量裝置成為可能，并且例如在所有光學測量方法中用于葡萄糖的一次性生物傳感器領域中已得到接受。因此，已努力許多年以實現(xiàn)基于簡單的電化學檢測原理的均相免疫測定。用電化學檢測的均相免疫測定的前提是靈敏的電分析方法和具有高比活度的氧化還原活性標記/標志物的可用性。安培法和伏安法是靈敏且合適的方法。氧化還原標記/標志物的比活度主要取決于電極的異相電子轉移以及檢測電位的速度常數(shù)。本領域技術人員已達成一致，在_200mV至+200mV的范圍內的檢測電位(針對銀/氯化銀參比電極，在下文中縮寫為vs.Ag/AgCl)對于生物溶液如血液中的測量是理想的。電子轉移常數(shù)是氧化還原標記/標志物的化學結構以及擴散系數(shù)和所用的電極材料的函數(shù)。本領域技術人員已知多種氧化還原介質，其具有有益的電化學特性，并且因此原則上是合適的免疫測定標記/標志物。為了用于生物介質，氧化還原介質必須不與樣品成分反應，必須在氧化和還原狀態(tài)下是穩(wěn)定的，并且是足夠水溶性的。這些氧化還原介質包括例如有機分子如氫醌/醌、對氨基苯酹，有機/無機夾心分子(sandwich molecule)如二茂鐵，以及無機絡合物如六氰合亞鐵(II)酸鹽/六氰合鐵(III)酸鹽或雙-聯(lián)卩比唳合鋨(bis-bipyridine osmium)。二茂鐵和雙-聯(lián)吡啶合鋨的水溶性很低，從而為此在大多數(shù)情況下采用相關的水溶性衍生物。US2007/054317記載了具有上述有益特性的水溶性鋨系氧化還原分子和不同的電化學免疫測定形式以及電極形狀例如叉指電極，通過其可以靈敏方式檢測所述水溶性氧化還原分子。除了使用新氧化還原介質以及基于后者的抗體和抗原結合物，US2007/054317中所記載的測定形式未超越現(xiàn)有技術；特別地，未描述新的高度靈敏的均相免疫測定形式。EP1331482A1記載一種電化學免疫測定方法，其中采用二茂鐵和其他氧化還原介質與分析物的結合物。對于該檢測，使用酶生物傳感器，例如葡萄糖傳感器，二茂鐵-分析物結合物的釋放導致該葡萄糖傳感器的電化學信號的調節(jié)。所述偶聯(lián)化學(couplingchemistry)的缺點是蛋白質如人血清白蛋白用來制備具有良好水溶性的結合物。本領域技術人員已知不可能合成具有精確限定的化學計量比的蛋白質-氧化還原介質結合物。因此該測試的特征總是在批次之間有所不同。本領域技術人員還意識到這一事實，即這樣的間接信號傳導方法帶來危險來自酶反應的抑制劑能夠如氧化還原介質-分析物結合物一樣調節(jié)酶反應。氧化還原介質結合物直接調節(jié)電化學信號的方法會更加穩(wěn)健。Sung等人對馬尿酸在微流體芯片中的均相電化學測定按照這樣的原理設計[SungJu Yooj Young Bong Choi, Jong Il Juj Gun-Sik Taej Hyug Han Kimand Sang-Hoon Lee.Analyst 134 (2009)，2462-2467]。合成二茂鐵-馬尿酸結合物并使用抗馬尿酸抗體。將結合至聚合物顆粒的結合物和抗體以精確限定的量加入到樣品中。如果樣品不含游離馬尿酸，則結合物結合至載有抗體的顆粒并與后者一起離心。在伏安實驗中，在二茂鐵的氧化電位下相對小的電流會在上清液中流動。然而，如果樣品包含游離馬尿酸，則與顆粒結合的抗·體優(yōu)選結合至后者，離心期間結合物保留在溶液中，并且在伏安實驗中會有相對較高的電流流動(在二茂鐵的氧化電位下)。該測定和所有按照該原理的測定均具有實際上不允許用于診斷的嚴重缺點。首先，對于血液和血清中的選擇性檢測，二茂鐵的氧化電位(+400mVvs. Ag/AgCl)太高。其次，對于大多數(shù)現(xiàn)場應用，離心步驟不可接受。第三，盡管有分離步驟(離心)，但這種方法非常不靈敏。例如，Sung等人已測量約10mg/mL的馬尿酸作為最低濃度；這等于55mM的濃度。然而，典型的免疫測定分析物必須在納摩爾濃度范圍(或更低)中測量，即更靈敏百萬倍。沒有分離步驟的均相電化學測定由Di Gleria等人提出[Katalin DiGleria, H.Allen, 0. Hill, Calum J. McNeil, Anal. Chem. 1988，58，1203-1205]。在這種情況下將二茂鐵和分析物利多卡因的結合物以及抗分析物抗體也加入到樣品中。作為檢測原理，使用酶反應，其中二茂鐵鎗(feirocenium)-抗原結合物作為氧化還原介質。如果樣品不含游離分析物，則結合物結合至抗體，并且酶反應(此處為葡萄糖氧化酶)延遲，而安培電流變小。這種形式的缺點是對于典型的免疫測定不夠靈敏。例如，在血清中實現(xiàn)約5μΜ的檢測下限，比典型的免疫測定中高約1000倍。已描述這種均相氧化還原免疫測定的變體，其中直接電化學測量氧化還原介質結合物。同樣在這種情況下，僅實現(xiàn)不足的檢測限度。該測定和所有按照相似原理(即通過抗體結合調節(jié)擴散常數(shù))的測定均具有嚴重的缺點，使得在診斷中的使用復雜化。主要缺點是低靈敏度，因為擴散常數(shù)的調節(jié)僅帶來輕微的信號調節(jié)即使氧化還原-活性結合物被抗體完全結合，仍然可以測量明顯的安培或伏安信號。期望的是與抗體結合的結合物不再產生電化學信號。這同樣適用于通過減少結合至抗體后的氧化還原介質來調節(jié)酶反應的原理。這種形式也僅可以檢測微摩爾濃度(或更高)?？傮w而言，可以說基于調節(jié)低分子結合物的擴散常數(shù)或者通過減少結合至抗體后的氧化還原介質來調節(jié)酶反應的均相電化學免疫測定對于測量免疫測定分析物典型的納摩爾范圍(或更低)中的濃度而言不夠靈敏。因此，盡管是廉價的檢測系統(tǒng)，這些測定均不能用于值得注目的商業(yè)應用中。針對這一背景，本發(fā)明的目的是提供在溶液中進行免疫測定的新的改進的方法，其不再具有所提到的現(xiàn)有技術的缺點，并且特別提供顯著提高的靈敏度。
根據(jù)本發(fā)明，通過權利要求I的方法來實現(xiàn)該目的。本發(fā)明的更為具體的實施方案和其他方面是其他權利要求的主題。根據(jù)本發(fā)明用電化學檢測進行均相免疫測定形式的方法的特征在于將作為試劑的兩種不同的結合物與樣品或樣品/緩沖液混合物組合，一種結合物包含氧化還原標志物和分析物分子，而另一種結合物包含抗氧化還原標志物抗體或其特異性結合片段以及特異性結合所述分析物的分子。分析物一般可以是在免疫測定或另一結合測定中可檢測的任意分子，所述分子存在特異性結合配偶體。所述分析物可以是低分子量分析物即分子量〈約1000道爾頓，或者較高或高分子量分析物。較高及高分子量分析物的實例為核酸、肽和蛋白質。特別優(yōu)選的分析物為低分子量有機分子和蛋白質/肽，例如激素、酶、生物標記、生物活性物質和有害物質以及其他生理或代謝相關物質。特異性結合分析物的分子可以是抗分析物抗體或其片段、適體、肽、核酸，或者通常為特異性結合分析物(例如在特殊結合口袋或配位結構中)且并非抗體(在文獻中也稱為“客分子”的“主分子”)的有機螯合劑。優(yōu)選為抗分析物抗體或其片段。更具體地，該方法的特征在于樣品中游離分析物的存在誘導或促進氧化還原標志物結合至抗氧化還原標志物抗體或其特異性結合片段，結合的氧化還原標志物的氧化還原活性被這種結合抑制(“猝滅”)，從而產生或改變可檢測的信號。本發(fā)明的方法為競爭性測定或通常包括競爭性測定。例如，合適的方法設計如下將包含抗分析物抗體和抗氧化還原標志物抗體的雙特異性抗體結合物以及氧化還原標志物-分析物結合物溶于緩沖液中。部分結合物分子結合至雙特異性抗體結合物，特別是在該結合物的空間條件下，它們中的大部分結合至作為抗分析物抗體的雙特異性抗體結合物的抗分析物端，并優(yōu)選具有比抗氧化還原標志物抗體顯著更高的親和常數(shù)。因此該結合物的氧化還原標志物端實際上并未結合，并因此可自由用于電化學測量(例如電流分析法或伏安法)，并且測量高還原電流。如果來自樣品的游離分析物分子現(xiàn)在參與(come into play),則這些分子代替來自分析物抗體結合位點的分析物-氧化還原標志物結合物的分析物端。該結合物的氧化還原標志物端現(xiàn)在僅可以結合至雙特異性抗體結合物的抗氧化還原標志物抗體部分，從而結合的氧化還原標志物的氧化還原活性被抑制(“猝滅”)，并且測量減小的電化學信號。本發(fā)明的方法遠遠優(yōu)于現(xiàn)有技術，因為其首次將通過抗體-抗原結合來“猝滅”信號(類似于熒光猝滅)的原理轉移到直接的電化學檢測。熒光猝滅免疫測定屬于最靈敏和最快速的均相免疫測定，因為信號與抗體-抗原結合相應地實時產生?，F(xiàn)在首次在電化學檢測中也實現(xiàn)了這樣的信號特征。根據(jù)本發(fā)明，二茂鐵(或二茂鐵的任意衍生物)、雙-聯(lián)吡啶合鋨絡合物和其他鋨系絡合物、聯(lián)批唳合釕(bipyridyl ruthenium)絡合物和其他釕系絡合物、對氨基苯酹、六氰合亞鐵(II)酸鹽/六氰合鐵(III)酸鹽、氫醌類/醌類或者其他氧化還原介質特別是已知并適合免疫測定的其他氧化還原標志物可以用作氧化還原活性標志物(類似于熒光團)。在免疫測定的條件下“猝滅”二茂鐵或另一氧化還原介質的氧化還原活性到目前為止在現(xiàn)有技術中是不可能的。諸如Nielson等人[Roger M. Nielson, Joseph T. Hupp, Inorg.Chem. 1996，35，1402-1404]的論文中的確記載了，與二茂鐵形成弱鍵的杯芳烴類化合物能夠完全猝滅二茂鐵的氧化還原活性，但是僅在約IOmM和更高的濃度下。這樣高濃度的氧化還原猝滅劑完全不適合免疫測定。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人之一制備的用于結合二茂鐵的單克隆抗體具有這樣的猝滅特征。特別有效的新的單克隆抗體專門結合二茂鐵的氧化形式二茂鐵陽離子(ferrocenium cation)(或二茂基鐵離子(ferricinium),在下文中稱為二茂鐵鐵)。通過該單克隆抗體，結合的二茂鐵鎗的氧化還原活性被完全猝滅；在結合狀態(tài)下，其不再可以在電極(玻璃-碳、貴金屬)上還原。在本發(fā)明的方法的示 例性實施方案中，與二茂鐵鎗結合的抗體用作氧化還原猝滅劑(類似于熒光猝滅劑)。然而，在本發(fā)明的方法的范圍內，還可以采用結合用于測試的氧化還原介質并因此抑制(猝滅)其氧化還原活性的任意其他抗體。就此而言，抗體是否結合氧化還原介質的氧化或還原狀態(tài)對于本發(fā)明是無關的。然而，結合氧化介質的抗體在一些應用中(例如在首次用于所述發(fā)明的抗二茂鐵鎗抗體的情況下)提供特別的優(yōu)勢。其原因是可以用于氧化還原標志物的還原的較低檢測電位(在應用實例中，檢測在+IOOmV vs. Ag/AgCl下進行；在氧化的情況下，檢測必須在+250mV至+400mV下進行，這會導致血清中非特異性信號增加)。這些具有猝滅劑作用的氧化還原標志物抗體以及包含這些抗體的雙特異性抗體結合物代表了本發(fā)明的一方面。本發(fā)明的具有猝滅劑作用的氧化還原標志物抗體能夠在很大程度上抑制(“猝滅”)所結合的氧化還原標志物的氧化還原活性，所述程度優(yōu)選超過80%，更優(yōu)選超過90%，更優(yōu)選超過95%或完全抑制。除非從上下文中可以明確地另外理解，本發(fā)明所用的術語“抗體”一般還包括其特異性結合片段。 使用本文首次記載的抗二茂鐵鎗抗體可以實現(xiàn)用于檢測二茂鐵鎗(或二茂鐵)的競爭性免疫測定，然而這不會有任何巨大的技術重要性。該方法僅在可以通過其用電化學免疫測定檢測任何分析物時具有高技術效益和高商業(yè)價值。為了這種效果，二茂鐵鎗-抗二茂鐵鎗免疫復合物的形成必須與任何單克隆抗體以這樣的方式相關聯(lián)靶分析物與互補抗體(compIementaryantibody)的結合導致二茂鐵鐵-抗二茂鐵鐵鍵的調節(jié)。Sellrie等人[US2008199972A]所述的簡單方法(通過用非常短的接頭連接的兩種抗原的結合物來關聯(lián)兩個免疫反應從而在每種情況下僅抗殺蟲劑抗體或抗熒光素抗體可以結合)不能在本發(fā)明的方法的情況下使用，因為與低分子物質偶聯(lián)的二茂鐵結合物通常不是水溶性的。為了實際使用，必須制備具有足夠高的水溶性的二茂鐵-分析物結合物。本領域技術人員已知許多可以用于合成生物結合物(bioconjugate)的水溶性接頭分子。由于具有良好的水溶性、與蛋白質和表面的邊緣(marginal)非特異性結合以及存在多種鏈長和化學官能團，聚乙二醇接頭(同義詞聚環(huán)氧乙烷接頭、PEG、ΡΕ0)屬于最常用的水溶性接頭。聚乙二醇接頭(同義詞聚環(huán)氧乙烷接頭)為線性分子，其可以在一端或兩端具有可偶聯(lián)的官能團例如羧基、氨基、巰基(thiol group)等。聚乙二醇接頭的水溶性非常高，并且隨著接頭鏈長的增加而增加。
為了制備用于本發(fā)明的方法的結合物，使用具有足夠鏈長的雙功能水溶性接頭(例如具有兩個末端可偶聯(lián)官能團的400-30，OOODa PEG接頭，優(yōu)選2000Da 二氨基-PEG接頭)來將二茂鐵或另一合適的氧化還原介質與一端偶聯(lián)并將靶分析物與另一端偶聯(lián)。通過使用具有足夠長度的PEG接頭，還可以使不溶于水的分析物可用于該測試?？梢允褂迷趦啥司哂邢嗤悸?lián)官能團的同型雙功能接頭，具有不同偶聯(lián)官能團的異型雙功能接頭也是如此。在游離抗二茂鐵抗體、游離抗分析物抗體和二茂鐵-分析 物結合物的存在下用二茂鐵-分析物結合物進行的結合研究證明沒有發(fā)生足夠的分析物對二茂鐵信號的調節(jié)。還證明在分析的整個持續(xù)時間中二茂鐵鎗-分析物結合物必須保持氧化狀態(tài)以獲得可測量的信號。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，在一些酸性緩沖液中，二茂鐵始終保持氧化狀態(tài)。在本發(fā)明的方法中，測定優(yōu)選在PH I至pH 7(特別優(yōu)選pH 4至pH 5)的pH值下進行。合適的緩沖鹽例如磷酸鹽、MES、HEPES, TRIS、Bistris,乙酸鹽、甘氨酰甘氨酸、甘氨酸。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)驚人簡單的將二茂鐵鎗-抗二茂鐵鎗結合反應與分析物-抗分析物結合反應關聯(lián)的新原理。為了這種效果，通過以化學計量比(1:1)將抗二茂鐵鎗抗體與抗分析物抗體偶聯(lián)來制備雙特異性抗體結合物，其中使用長度不超過10個亞甲基基團的短接頭。通過該原理，首次可以在電化學免疫測定中實現(xiàn)上述期望的信號猝滅特征。就此而言，對競爭性孕酮免疫測定的實例解釋的功能原理如下將由抗孕酮抗體和抗二茂鐵鎗抗體組成的雙特異性抗體結合物以及二茂鐵鎗-孕酮結合物溶于緩沖液中。部分結合物分子結合至雙特異性抗體結合物，它們中的大部分結合至雙特異性抗體結合物的抗孕酮端(因為該抗體具有較高的親和常數(shù))。因為PEG接頭對此太短，所以該結合物的二茂鐵鎗端實際上并未結合，并且還必須采用能量上不利的彎曲構象(bentconformation)。因此二茂鐵鎗端可自由用于電化學測量(電流分析法或伏安法)，并且測量高還原電流。如果來自樣品的游離孕酮分子現(xiàn)在參與，則這些分子代替來自孕酮抗體結合位點的孕酮-二茂鐵鎗結合物的孕酮端。該結合物的二茂鐵鎗端現(xiàn)在僅可以結合至雙特異性抗體結合物的抗二茂鐵鎗抗體部分，并且測量減小的電化學信號(說明參見圖I)。當加入與二茂鐵鎗-分析物結合物相比過量的雙特異性抗體結合物時，大多數(shù)的二茂鐵鎗殘基被抗體結合物結合，并且電化學信號降低至幾乎為零，因此猝滅。然而，本領域技術人員已知以能夠獲得孕酮結果的最大靈敏度的方式選擇免疫測定中的抗體濃度或雙特異性抗體濃度，從而在高度靈敏的測定中以不足的量加入抗體結合物。在這種情況下，甚至用高孕酮濃度，電化學(總)信號仍未完全猝滅。據(jù)證實當通過加入孕酮電化學信號僅可以粹滅約50%時,孕酮測定最靈敏(參見圖2)。實現(xiàn)的信號猝滅特征目前尚未在電化學免疫測定中顯示，因為沒有相應的猝滅劑分子可用。根據(jù)本發(fā)明使用的抗二茂鐵鎗抗體是這樣的氧化還原猝滅劑分子的實例。然而，同樣可制備結合其他氧化還原標志物并猝滅它們的信號的類似抗體。本發(fā)明也包括在雙特異性抗體結合物中使用這樣的抗體。本發(fā)明提供在溶液中用靈敏的電化學檢測進行直接的均相免疫測定的方法，其特征在于可以測量納摩爾濃度的低分子或高分子分析物，沒有試劑被固定，不進行分離和洗滌步驟，并且實時電化學檢測結合反應。
本發(fā)明的方法的技術應用特別容易，因為其可以與本領域技術人員已知的不同電分析技術一起使用，不需要任何對測量電極的修飾(例如化學修飾、膜、用薄膜包覆、橫向結構(lateral structuring)等)，并且實際上可以任意方式改變大小(減小電極尺寸、減小分析體積)。由于信號產生原理(即任何氧化還原介質的氧化還原活性的猝滅)可以應用于所有已知的電分析測量技術例如電流分析法、伏安法、庫侖法、電流滴定、庫侖滴定、電位測定法、阻抗譜(impedance spectroscopy)等,所以本發(fā)明的方法可以與所有那些方法聯(lián)用以產生新的免疫測定應用。例如，在一些情況下電流分析法可以是選擇的方法，例如以實現(xiàn)盡可能廉價的總系統(tǒng)，或者采用現(xiàn)有的安培檢測器(例如葡萄糖-生物傳感器測量裝置)用于免疫測定。根據(jù)具體應用和期望的 分析物，可改變電分析技術而原則上不必重新開發(fā)免疫測定。在用于微流體分析系統(tǒng)(芯片實驗室系統(tǒng))時特別清楚地顯示新免疫測定原理的可變性和技術適用性。這特別容易實現(xiàn)，因為它是沒有固定的組分且沒有分離步驟的均相免疫測定。可以將試劑引入液體形式或干燥形式的芯片實驗室系統(tǒng)，從而通過加入樣品而釋放所述試劑，并且測定開始。測量信號可以連續(xù)測量或者僅在分析開始和結束時測量 (在達到結合平衡之后)。獲得分析結果無需過程(配料和洗滌或離心步驟)的同步。與許多光學測量方法(例如光度測量、熒光測量)相比，電分析方法的信噪比不惡化，甚至在微型化的情況下也是如此，即不必為微電極開發(fā)新的和復雜的檢測器和放大器。新方法的高價值還在這樣的事實中得以證明，例如在現(xiàn)今習慣的按照橫向流動免疫測定原理的妊娠試驗中，可用該方法實現(xiàn)高度靈敏的用于一次性使用的一次性免疫傳感器?？梢詫z測所需的電子設備(例如安培電路(amperometrie circuit))集成入廉價的便攜式裝置(例如用于葡萄糖測試條的測量裝置)中或者甚至可以作為一次性電子設備(例如印刷電路或高度集成的電路)實現(xiàn)。新方法同樣還適合全自動平行進行許多不同免疫測定的實驗室分析儀。在這種情況下，1-5分鐘的本發(fā)明的方法的短分析時間具有顯著效果。在本發(fā)明的方法的一具體實施方案中，以可溶形式加入所需的試劑，并且實時進行結合事件的電化學檢測。在另一具體實施方案中，將所有需要的試劑作為預制的混合物加入到樣品中，并且實時進行結合事件的電化學檢測(混合和測量(mix-and-measure)原理)。在另一具體實施方案中，在合適的反應容器(例如Eppendorf離心管、微量滴定板、芯片實驗室系統(tǒng)、測試條)中提供作為干燥試劑的所有需要的試劑，并且僅通過加入樣品以及任選存在的緩沖液來溶解，這標志著分析開始。在另一特別有益的具體實施方案中，免疫測定在微流體分析系統(tǒng)(芯片實驗室)中進行。在一典型的實施方案中，免疫測定在全自動分析儀上進行。本發(fā)明的方法的另一改進可以通過將結構電極(structured electrode)如叉指電極而非簡單電極用于檢測來實現(xiàn)，這樣分析的靈敏度可以通過所謂的氧化還原循環(huán)得到
進一步提聞。本發(fā)明的方法的另一有利改進是采用酶促催化的循環(huán)反應(例如電化學還原，然后是二茂鐵鎗的酶促再氧化)而非簡單的電化學氧化還原反應(例如將二茂鐵鎗還原為二茂鐵)，即所謂的酶循環(huán)，這樣分析的靈敏度可以進一步提高。本發(fā)明的方法特別適合低納摩爾濃度范圍內的測量，并且比迄今已知的沒有分離步驟的均相電化學免疫測定靈敏約1000倍。這種靈敏度的巨大改進通過上述新信號傳導原理得以實現(xiàn)，在所述原理中，氧化還原-活性結合物的氧化還原活性在結合至抗體后完全猝滅(而非如迄今已知的方法中的僅減小擴散常數(shù))。就此而言，電化學測量方法在技術上與上述方法一樣簡單，因為在常規(guī)的裸電極(例如玻璃-碳電極)上進行安培或伏安測量。人工操作步驟僅限于加入試劑以及加入樣品溶液；不需要分離步驟。本發(fā)明的方法還允許按照混合和測量原理的分析，并且特別適合自動化。就此而言，本發(fā)明的方法可良好擴展，即擴展至微型體積，例如可應用于微流體應用(芯片實驗室)。因為這種特征以及通常為+100mV(vS.Ag/AgCl)的低檢測電位，所以本發(fā)明的方法適用于直接測量低分子分析物如類固醇激素，以及高分子分析物如hCG，或者復雜生物學樣品如血液中的蛋白質標志物。 因此本發(fā)明的方法適用于許多商業(yè)上重要的免疫測定，并且能夠代替技術上復雜(并因此昂貴)或者難以微型化和自動化的現(xiàn)有檢測方法。其適合臨床診斷、環(huán)境分析和食品分析中的應用，并且由于微型化的良好適宜性和技術簡單性，其特別適合實驗室外的應用(現(xiàn)場應用、即時分析(point-of-care analyses)、一次性傳感器、芯片實驗室免疫測定)。因此本發(fā)明的方法具有在許多應用中代替常規(guī)的昂貴的檢測系統(tǒng)如熒光檢測器或熒光偏振檢測器的潛力。附圖
簡述圖I :對孕酮檢測實施例的本發(fā)明的免疫測定的示意2 :按照本發(fā)明的方法的孕酮的安培測量的劑量效應曲線以下非限制性實施例會更詳細地解釋本發(fā)明。實施例I血清中的直接競爭性孕酮免疫測定裝置電化學攬祥池(electrochemical stirred cell)(工作容積ImL),安培模式的恒電位儀。緩沖液乙酸鹽緩沖液，pH 4. 4ο樣品人血清，未稀釋。校準品人血清，未稀釋，與2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的孕酮混合。方法步驟·將450 μ LpH 4. 4的乙酸鹽緩沖液充入電化學測量池中； 使工作電極極化至+100mV(vs. Ag/AgCl)；·加入IOyL的雙特異性抗體結合物(終濃度約O. I μ g/mL)；·加入10 μ L的氧化還原標志物-孕酮結合物(終濃度約IOOnM)；·加入30 μ L的H2O2/過氧化物酶(終濃度5mM的H2O2,過氧化物酶O. 02nM)；·測量基本信號； ·加入500 μ L的人血清(或500 μ L的校準品)；·在加入血清后180秒測量最終信號。
在以前測量的劑量-效應曲線的基礎上或者在2點校準的基礎上進行評價。實施例2唾液中的直接競爭性孕酮免疫測定裝置電化學攪拌池(工作容積ImL)，安培模式的恒電位儀。緩沖液乙酸鹽緩沖液，pH 4. 4ο樣品人唾液，1:5稀釋。校準品人唾液，1:5稀釋，與 2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的孕酮混合。
方法步驟·將450 μ LpH 4. 4的乙酸鹽緩沖液充入電化學測量池中； 使工作電極極化至+100mV(vs. Ag/AgCl)；·加入IOyL的雙特異性抗體結合物(終濃度約O. I μ g/mL)；·加入10 μ L的氧化還原標志物-孕酮結合物(終濃度約IOOnM)；·加入30 μ L的H2O2/過氧化物酶(終濃度5mM的H2O2,過氧化物酶O. 02nM)；·測量基本信號；·加入500 μ L的人唾液，1:5稀釋(或500 μ L的校準品);·在加入唾液后180秒測量最終信號。在以前測量的劑量-效應曲線的基礎上或者在2點校準的基礎上進行評價。實施例3尿液中的直接競爭性人絨毛膜促性腺激素免疫測定(hCG)裝置電化學攪拌池(工作容積ImL)，安培模式的恒電位儀。緩沖液乙酸鹽緩沖液，pH 4. 4ο樣品人血清，未稀釋。校準品人血清，未稀釋，與10mIU/mL、20mIU/mL、40mIU/mL、100mIU/mL、200mIU/mL的hCG混合。方法步驟·將450 μ LpH 4. 4的乙酸鹽緩沖液充入電化學測量池中； 使工作電極極化至+100mV(vs. Ag/AgCl)；·加入10 μ L的雙特異性抗體結合物(終濃度約O. 3 μ g/mL)；·加入10 μ L的氧化還原標志物-hCG結合物(終濃度約200nM)；·加入30 μ L的H2O2/過氧化物酶(終濃度5mM的H2O2,過氧化物酶O. 02nM)； 測量基本信號；·加入500 μ L的人血清(或500 μ L的校準品)；·在加入血清后180秒測量最終信號。在以前測量的劑量-效應曲線的基礎上或者在2點校準的基礎上進行評價。
權利要求
1.在溶液中用電化學檢測進行均相免疫測定形式的方法，其特征在于將作為試劑的兩種不同的結合物與樣品或樣品/緩沖液混合物組合，一種結合物包含氧化還原標志物和分析物分子，而另一種結合物包含抗氧化還原標志物抗體或其特異性結合片段以及特異性結合所述分析物的分子。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述樣品中游離分析物的存在誘導或促進所述氧化還原標志物結合至所述抗氧化還原標志物抗體，結合的氧化還原標志物的氧化還原活性被所述結合抑制(“猝滅”)，從而產生或改變可檢測的信號。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述氧化還原標志物選自二茂鐵和二茂鐵衍生物、雙-聯(lián)吡啶合鋨絡合物和其他鋨系絡合物、聯(lián)吡啶合釕絡合物和其他釕系絡合物、對氨基苯酚、六氰合亞鐵(II)酸鹽/六氰合鐵(III)酸鹽、醌類以及已知用于電化學免疫測定的其他氧化還原標志物。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述氧化還原標志物為二茂鐵鎗，并且所述抗氧化還原標志物抗體優(yōu)選為單克隆抗二茂鐵鎗抗體。
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于所述特異性結合所述分析物的分子表示特異性結合所述分析物的抗分析物抗體、適體、肽、核酸或螯合劑。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于所述特異性結合所述分析物的分子為抗分析物抗體或其片段。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其特征在于所述兩種結合物包含水溶性接頭分子，特別是PEG接頭。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于以可溶形式加入所需試劑，并且實時進行結合事件的電化學檢測。
9.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于將全部所需試劑作為預制的混合物加入到所述樣品中，并且實時進行結合事件的電化學檢測。
10.如權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于在合適的反應容器中提供作為干燥試劑的全部所需試劑，并且僅通過加入所述樣品以及任選存在的緩沖液來溶解，這標志著分析開始。
11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其特征在于所述免疫測定在微流體分析系統(tǒng)(芯片實驗室)中和/或在全自動分析儀上進行。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其特征在于將結構電極例如叉指電極而非簡單電極用于所述檢測。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其特征在于采用酶促催化的循環(huán)反應而非簡單的電化學氧化還原反應。
14.特異性結合至氧化還原標志物的氧化還原標志物抗體或其片段，所述氧化還原標志物選自二茂鐵和二茂鐵衍生物、雙-聯(lián)吡啶合鋨絡合物和其他鋨系絡合物、聯(lián)吡啶合釕絡合物和其他釕系絡合物、對氨基苯酚、六氰合亞鐵(II)酸鹽/六氰合鐵(III)酸鹽、醌類以及已知并適用于電化學免疫測定的其他氧化還原標志物，并且所述氧化還原標志物抗體或其片段在很大程度上抑制(猝滅)其結合的氧化還原標志物的氧化還原活性，所述程度優(yōu)選超過90%，更優(yōu)選超過95%或完全抑制。
15.如權利要求14所述的氧化還原標志物抗體或其片段，其為在很大程度上或完全抑制其結合的二茂鐵鎗的氧化還原活性的抗二茂鐵鎗抗體或其片段。
16.用于進行如權利要求1-13中任一項所述的方法的雙特異性抗體結合物，其包含如權利要求14或15所述的氧化還原標志物抗體或其片段以及抗分析物抗體或其片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在溶液中用高度靈敏的電化學檢測進行均相免疫測定形式的方法，其特征在于將作為試劑的兩種不同的結合物與樣品或樣品/緩沖液混合物組合，其中一種結合物包含氧化還原標志物和分析物分子，而另一種結合物包含抗氧化還原標志物抗體或其特異性結合片段以及特異性結合所述分析物的分子。所述方法適用于診斷中不含洗滌且不含分離的免疫測定，特別適用于自動化及微流體免疫測定。所述方法還適用于廉價的免疫測定系統(tǒng)和一次性測試條。
文檔編號G01N33/543GK102959397SQ201180025601
公開日2013年3月6日 申請日期2011年5月25日 優(yōu)先權日2010年5月25日
發(fā)明者J·埃特林格, N·加約維奇-艾歇爾曼, B·米歇爾, G·沙爾特, J·申克 申請人:弗勞恩霍弗應用技術研究院